Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

हम कृपया पीएलएसीजेड प्लास्मिड प्रदान करने के लिए डॉ बकनर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को अर्जेंटीना से अगेन्सिया नैशनल डी प्रोमोसियोन सिएंटिफिका वाई टेक्नोलोजिका, मिनिस्टरियो डी सिएन्सिया ई इनोवासियोन प्रोडक्टिवा (पीआईसीटी 2016-0439, पीआईसीटी 2019-0526, पीआईसीटी 2019-4212), और रिसर्च काउंसिल यूनाइटेड किंगडम [एमआर / सर्वियर मेडिकल आर्ट का उपयोग चित्रा 1 (https://smart.servier.com) का उत्पादन करने के लिए किया गया था।

नोट: पूरे प्रयोगात्मक डिजाइन का अवलोकन चित्रा 1 में दर्शाया गया है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> चित्रा 1: वर्णमितीय प्रतिक्रिया के लिए सब्सट्रेट के ...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+a+bug+and+a+hard+place:+Trypanosoma+cruzi+genetic+diversity+and+the+clinical+outcomes+of+Chagas+disease.">Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).</li><li>Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Chagas+disease.">The history of Chagas disease.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 317 (2014).</li><li>Viotti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+paradigm+shift+in+the+treatment+of+chronic+Chagas+disease.">Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).</li><li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas’+Disease.">Chagas’ Disease.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).</li><li>Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

यह पेपर सब्सट्रेट सीपीआरजी की उपस्थिति में एमास्टिगोट्स के साथ टी क्रूज़ी एपिमास्टिगोट्स, ट्रिपोमास्टिगोट्स, या संक्रमित कोशिकाओं के झिल्ली लिसिस के कारण जारी साइटोप्लाज्मिक β-गैलेक्टोसिडेस ग?...

चगास रोग (सीएचडी), या अमेरिकी ट्रिपैनोसोमियासिस, फ्लैगेलेटेड प्रोटोजोआ, ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी (टी क्रूज़ी) के कारण होने वाली एक परजीवी बीमारी है। सीएचडी एक स्पर्शोन्मुख या ऑलिगोसिम्प्टोमैटिक तीव्र चरण से शुरू होता है जो आमतौर पर अनियंत्रित होता है, इसके बाद आजीवन क्रोनिक चरण होता है। क्रोनिकता में, ~ 30% रोगी संक्रमण के दशकों बाद प्रकट होते हैं- मायोकार्डियोपैथी, मेगा-पाचन सिंड्रोम, या दोनों सहित विभिन्न प्रकार की दुर्बल स्थितियां, मृत्यु दर 0.2% से 20% 1,2,3 तक होती है। स्पर्शोन्मुख पुराने रोगियों में कोई नैदानिक संकेत नहीं हो सकते हैं लेकिन जीवन भर सीरोपॉजिटिव रहते हैं।
अनुमान बताते हैं कि दुनिया भर में ~ 7 मिलियन लोग संक्रमित हैं, ज्यादातर लैटिन अमेरिका से, जहां सीएचडी स्थानिक है। इन देशों में, टी क्रूज़ी मुख्य रूप से संक्रमित रक्त चूसने वाले ट्रायटोमाइन बग (वेक्टर-जनित संचरण) के माध्यम से प्रेषित होता है और परजीवी युक्त ट्रायटोमाइन मल से दूषित भोजन के अंतर्ग्रहण के माध्यम से मौखिक संचरण द्वारा कम बारप्रेषित होता है 2. इसके अतिरिक्त, परजीवी को नाल के माध्यम से चगासिक माताओं से नवजात शिशुओं में, रक्त आधान के माध्यम से, या अंग प्रत्यारोपण के दौरान प्रेषित किया जा सकता है। संक्रमण और मानव प्रवास प्राप्त करने के इन वेक्टर-स्वतंत्र तरीकों ने बीमारी के दुनिया भर में प्रसार में योगदान दिया है, जो उत्तरी अमेरिका, यूरोप और कुछ अफ्रीकी, पूर्वी भूमध्यसागरीय और पश्चिमी प्रशांत देशों में मामलों की बढ़ती संख्या से प्रमाणितहै। सीएचडी को एक उपेक्षित बीमारी माना जाता है क्योंकि वेक्टर-जनित संचरण गरीबी से निकटता से जुड़ा हुआ है और विशेष रूप से लैटिन अमेरिकी कम आय वाले देशों में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा है। यद्यपि उपलब्ध उपचार हैं, लैटिन अमेरिका में सीएचडी के कारण मृत्यु दर परजीवी रोगों में सबसे अधिक है, जिसमें मलेरिया2 भी शामिल है।
1960 के दशक के अंत और 1970 के दशक की शुरुआत में पेश किए गए सीएचडी उपचार के लिए दो पंजीकृत दवाएं हैं: निफर्टिमॉक्स और बेंज़निडाज़ोल5। दोनों दवाएं वयस्कों, बच्चों और जन्मजात रूप से संक्रमित नवजात शिशुओं के साथ-साथ पुराने संक्रमण वाले बच्चों में बीमारी के तीव्र चरण में प्रभावी हैं, जहां इलाज आमतौर पर प्राप्त किया जाता है। हालांकि, केवल कुछ ही लोगों को समय पर इलाज करने के लिए पर्याप्त जल्दी निदान किया जाता है। नवीनतम नैदानिक परीक्षणों के अनुसार, दोनों दवाओं की वयस्कों में महत्वपूर्ण सीमाएं हैं और पुरानी बीमारी वाले लोगों में लक्षणों को कम करने में अप्रभावी थीं; इसलिए, इस चरण में उनका उपयोग विवादास्पद है। अन्य कमियां लंबे समय तक आवश्यक उपचार अवधि (60-90 दिन) और लगातार, गंभीर प्रतिकूल प्रभाव देखी जाती हैं, जिससे संक्रमित लोगों के अनुपात में चिकित्सा बंद हो जाती है 6,7. यह अनुमान लगाया गया है कि सीएचडी वाले 10% से कम लोगों का निदान किया गया है, और यहां तक कि कम लोगों के पास उपचार तक पहुंच है, क्योंकि कई प्रभावित व्यक्ति ग्रामीण क्षेत्रों में रहते हैं, जिनके पास स्वास्थ्य सेवा तक कोई या दुर्लभ पहुंच नहींहै। ये तथ्य टी क्रूज़के खिलाफ नई दवाओं को खोजने की तत्काल आवश्यकता को उजागर करते हैं ताकि विशेष रूप से पुराने चरण के लिए अधिक कुशल, सुरक्षित और लागू-से-क्षेत्र उपचार की अनुमति मिल सके। इस संबंध में, अधिक प्रभावशाली यौगिकों के विकास में एक और चुनौती इन विट्रो और विवो9 में दवा प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए सिस्टम की सीमा है।
यद्यपि संभावित दवा लक्ष्यों की पहचान के लिए रासायनिक जीव विज्ञान और जीनोमिक दृष्टिकोण का उपयोग कीनेटोप्लास्टिड परजीवी में किया गया है, टी क्रूज़ी में उपलब्ध जीनोमिक उपकरण टी। इस प्रकार, ट्रिपैनोसिडल गतिविधि के साथ यौगिकों की स्क्रीनिंग अभी भी सीएचडी के खिलाफ नए कीमोथेरेप्यूटिक दवा उम्मीदवारों की खोज में सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण है आमतौर पर, टी क्रूज़ी में दवा की खोज एपिमास्टिगोट चरण के खिलाफ इन विट्रो परख में एक नई दवा के प्रभावों का परीक्षण करने के साथ शुरू होनी चाहिए। दशकों से, टी क्रूज़ी पर उम्मीदवार यौगिकों के निरोधात्मक प्रभावों को मापने का एकमात्र तरीका मैनुअल सूक्ष्म गिनती थी, जो श्रमसाध्य, समय लेने वाली और ऑपरेटर-निर्भर है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण यौगिकों की एक छोटी संख्या परख के लिए उपयुक्त है, लेकिन बड़े यौगिक पुस्तकालयों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अस्वीकार्य है। आजकल, कई जांच विभिन्न मूल से यौगिकों की एक विशाल संख्या के विश्लेषण के साथ शुरू होती है जो इन विट्रो में परख की जाती हैं, परजीवी वृद्धि को बाधित करने के लिए उनकी क्षमता का परीक्षण करती हैं। इन परखों में थ्रूपुट बढ़ाने, स्क्रीनिंग की निष्पक्षता में सुधार करने और पूरी प्रक्रिया को कम थकाऊ बनाने के लिए वर्णमितीय और फ्लोरोमेट्रिक दोनों विधियों को विकसित किया गया है।
सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली वर्णमिति विधियों में से एक ट्रांसफेक्टेड परजीवी की β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि पर आधारित है जिसे पहले बकनेट और सहयोगियों10 द्वारा वर्णित किया गया है। पुनः संयोजक परजीवियों द्वारा व्यक्त β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट, क्लोरोफेनोल रेड β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड (सीपीआरजी) को क्लोरोफेनोल लाल में हाइड्रोलाइज करता है, जिसे माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आसानी से मापा जा सकता है। इस प्रकार, विभिन्न यौगिकों की उपस्थिति में परजीवी वृद्धि का मूल्यांकन और माइक्रोटिटर प्लेटों में एक साथ मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इस विधि को एपिमास्टिगोट रूपों (कीट वेक्टर में मौजूद), ट्रिपोमास्टिगोट्स और इंट्रासेल्युलर अमास्टिगोट्स, परजीवी के स्तनधारी चरणों में दवाओं का परीक्षण करने के लिए लागू किया गया है। इसके अलावा, एस्चेरिचिया कोलाई β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम को व्यक्त करने के लिए पीबीएस: सीएल-नियो -01 / बीसी-एक्स -10 प्लास्मिड (पीएलएसीजेड) 10 से संक्रमित कई पुनः संयोजक टी क्रूज़ी उपभेद पहले से ही उपलब्ध हैं (और नए लोगों का निर्माण किया जा सकता है), जो विभिन्न असतत टाइपिंग इकाइयों (डीटीयू) से परजीवी के मूल्यांकन की अनुमति देता है जोसमान रूप से व्यवहार नहीं कर सकते हैं . इस विधि का उपयोग पहले से ही कम और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग12,13 में टी क्रूज़ी के खिलाफ गतिविधि के लिए यौगिकों का मूल्यांकन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग अन्य प्रोटोजोआ परजीवी में भी किया गया है, जिसमें टोक्सोप्लाज्मा गोंडी और लीशमैनिया मैक्सिकना14,15 शामिल हैं।
यह पत्र β-गैलेक्टोसिडेस को व्यक्त करने वाले परजीवी का उपयोग करके टी क्रूज़ी के सभी जीवन चक्र चरणों के खिलाफ इन विट्रो ड्रग स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है और दिखाता है। यहां प्रस्तुत परखों को पीएलएसीजेड प्लास्मिड (डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड) के साथ डीटीयू आई13 से टी क्रूज़ी डीएम 28 सी तनाव के अभिकर्मक द्वारा प्राप्त β-गैलेक्टोसिडेस-एक्सप्रेसिंग टी क्रूज़ी लाइन के साथ किया गया है। इसके अतिरिक्त, यौगिकों के बीच और टी क्रूज़ी उपभेदों या डीटीयू के बीच प्रदर्शन की तुलना करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी चागास रोग (सीएचडी) का प्रेरक एजेंट है, जो लैटिन अमेरिका में सार्वजनिक स्वास्थ्य महत्व की एक स्थानिक बीमारी है जो प्रवास में वृद्धि के कारण कई गैर-स्थानिक देशों को भी प्रभावित करती है। यह बीमारी लगभग 8 मिलियन लोगों को प्रभावित करती है, जिसमें प्रति वर्ष 50,000 नए मामलों का अनुमान है। 1 9 60 और 70 के दशक में, सीएचडी उपचार के लिए दो दवाएं पेश की गईं: निफर्टिमॉक्स और बेंज़निडाज़ोल (बीजेडएन)। दोनों नवजात शिशुओं में और बीमारी के तीव्र चरण के दौरान प्रभावी होते हैं लेकिन पुराने चरण में नहीं, और उनका उपयोग महत्वपूर्ण दुष्प्रभावों से जुड़ा होता है। ये तथ्य टी क्रूज़ी के खिलाफ नई दवाओं की खोज को तेज करने की तत्काल आवश्यकता को रेखांकित करते हैं।
क्रूजी रेडुविडे और हेमिप्टेरा परिवारों के हेमटोफैगस कीट वैक्टर के माध्यम से प्रेषित होता है। एक बार स्तनधारी मेजबान में, यह इंट्रासेल्युलर रूप से गैर-फ्लैगेलेटेड अमास्टिगोट रूप के रूप में गुणा करता है और ट्रिपोमास्टिगोट में अंतर करता है, रक्तप्रवाह गैर-प्रतिकृति संक्रामक रूप। कीट वेक्टर के अंदर, ट्रिपोमास्टिगोट्स एपिमास्टिगोट चरण में बदल जाते हैं और बाइनरी विखंडन के माध्यम से गुणा करते हैं।
यह पेपर सब्सट्रेट, क्लोरोफेनोल लाल β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड (सीपीआरजी) का उपयोग करके परजीवी लसीका के कारण संस्कृति में जारी साइटोप्लाज्मिक β-गैलेक्टोसिडेस की गतिविधि को मापने के आधार पर एक परख का वर्णन करता है। इसके लिए, टी क्रूज़ी डीएम 28 सी तनाव को β-गैलेक्टोसिडेस-ओवरएक्सप्रेसिंग प्लास्मिड के साथ ट्रांसफेक्ट किया गया था और एपिमास्टिगोट, ट्रिपोमास्टिगोट और अमास्टिगोट चरणों में इन विट्रो फार्माकोलॉजिकल स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता था। यह पत्र यह भी वर्णन करता है कि सुसंस्कृत एपिमास्टिगोट्स में एंजाइमेटिक गतिविधि को कैसे मापा जाए, अमास्टिगोट्स के साथ संक्रमित वेरो कोशिकाएं, और एक उदाहरण के रूप में संदर्भ दवा, बेंज़निडाज़ोल का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं से जारी ट्रिपोमास्टिगोट्स। यह वर्णमितीय परख आसानी से किया जाता है और इसे उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में स्केल किया जा सकता है और अन्य टी क्रूज़ी उपभेदों पर लागू किया जा सकता है।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, β-गैलेक्टोसिडेस-एक्सप्रेसिंग डीएम 28 सी एपिमास्टिगोट्स को 72 घंटे के लिए बीजेडएन (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (या ब्याज के यौगिकों) की 6 सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया था। इस अवधि के बाद, सीपीआ?...

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In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

हम चगास रोग के प्रेरक एजेंट ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी के तीन जीवन चक्र चरणों में β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि को मापने वाले एक उच्च-थ्रूपुट वर्णमितीय परख का वर्णन करते हैं। इस परख का उपयोग ट्रिपैनोसिडल यौगिकों को एक आसान, तेज़ और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से पहचानने के लिए किया जा सकता है।

इन विट्रो में ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी के सभी जीवन चक्र चरणों के खिलाफ ड्रग स्क्रीनिंग β-गैलेक्टोसिडेस व्यक्त करने वाले परजीवी का उपयोग करके

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

यह प्रोटोकॉल चगास रोग के लिए नई दवा उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी के तीन जीवनचक्र चरणों में एक उच्च थ्रूपुट वर्णमितीय परख का वर्णन करता है। इसका उपयोग ट्रिपैनोसिडल यौगिकों को आसान, तेज़ और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से पहचानने के लिए किया जा सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन पामेला पालना की प्रयोगशाला से एक प्रयोगशाला सेल संस्कृति तकनीशियन रोमिना मनारिन होगा।टी -25 टिशू कल्चर फ्लास्क में ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी एपिमास्टिगोट्स को व्यक्त करने वाले बीटा गैलेक्टोसिडेस को संवर्धन करके शुरू करें और उन्हें अक्षीय रूप से उगाने के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। न्यूबॉयर चैंबर का उपयोग करके, उपसंस्कृति से पहले परजीवी वृद्धि की मात्रा निर्धारित करें। एक लॉग चरण में संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए, एलआईटी माध्यम के पांच मिलीलीटर में हर 48 से 72 घंटे में उपसंस्कृति 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर सल्फेट में 10% एफसीएस और आनुवंशिकी के साथ पूरक होती है।फिर ऊर्ध्वाधर स्थिति में 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने से पहले टोपी को सुरक्षित रूप से बंद करें। लॉग चरण संस्कृति से, 200, 000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर एपिमास्टिगोट प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर आनुवंशिक और सल्फेट के साथ पूरक एलआईटी माध्यम में एपिमास्टिगोट का निलंबन करें। 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति निलंबन के 100 माइक्रोलीटर वितरित करने के बाद, मध्यम के साथ अच्छी तरह से 200 माइक्रोलीटर की मेकअप अंतिम मात्रा।डीएमईएम में वेरो सेल निलंबन प्रति मिलीलीटर 100, 000 कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता पर 2% एफसीएस के साथ पूरक करें। एक 96 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में अच्छी तरह से निलंबन के 100 माइक्रोलीटर बीज। पालन के लिए रात भर कोशिकाओं सेते हैं और अगले दिन, माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें।अगले दिन, बाँझ पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर के साथ वेरो सेल मोनोलेयर को तीन बार कुल्लाएं। पहले प्राप्त मेटासाइक्लिक ट्रिपोमास्टिगोट्स जोड़ें। डीएमईएम के 100 माइक्रोलीटर में संक्रमण या 10-1 के एमओआई की बहुलता जोड़ें जो प्रति अच्छी तरह से 2% एफसीएस के साथ पूरक है और पहले दिखाए गए अनुसार छह घंटे के लिए सेते हैं।इनक्यूबेशन के अंत में, प्लेट को पीबीएस के साथ दो बार धो लें और 2% एफसीएस के साथ पूरक फिनोल लाल के बिना डीएमईएम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। डीएमईएम में वेरो कोशिकाओं को निलंबित करने के बाद प्रति मिलीलीटर 1 मिलियन कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता जोड़ें। टी -25 फ्लास्क में माध्यम के पांच मिलीलीटर में बीज 800, 000 कोशिकाएं और सेल पालन के लिए रात भर सेते हैं।एक बार फ्लास्क को पीबीएस के साथ धोया जाता है, तो ट्रिपोमास्टिगोट्स जोड़ें, 2% एफसीएस के साथ पूरक डीएमईएम के पांच मिलीलीटर में 10-1 का एमओआई जोड़ें और पहले दिखाए गए अनुसार रात भर सेते हैं। इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस के साथ फ्लास्क को दो बार धो लें। 2% एफसीएस के साथ पूरक ताजा डीएमईएम के पांच मिलीलीटर जोड़ें और चार दिनों के लिए सेते हैं।इनक्यूबेशन के अंत में, एक ऑप्टिक माइक्रोस्कोप के तहत ट्रिपोमास्टिगोट्स उपस्थिति के लिए सतह पर तैरनेवाला का अवलोकन करने के बाद। न्यूबॉयर कक्ष का उपयोग करके ट्रिपोमास्टिगोट्स को मापें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 7, 000 गुना जी पर 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए।फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और प्रति मिलीलीटर 1 मिलियन ट्रिपोमास्टिगोट्स की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 2% एफसीएस के साथ पूरक फिनोल लाल के बिना डीएमईएम में गोली को फिर से निलंबित करें। 96 अच्छी तरह से प्लेट में ट्रिपोमास्टिगोट निलंबन के 100 माइक्रोलीटर बीज। एपिमास्टिगोट्स, अमास्टिगोट्स के साथ वेरो कोशिकाओं, या पाठ पांडुलिपि में वर्णित ट्रिपोमास्टिगोट्स में बेंज़निडाज़ोल समाधान जोड़ें।फिर एपिमास्टिगोट्स को सेते हैं, 72 घंटों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस सेट करें और ट्रिपोमास्टिगोट्स या संक्रमित वेरो कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 24 घंटे के लिए अमास्टिगोट्स के साथ सेट करें। कलरमेट्रिक परख के लिए, पीबीएस या संबंधित माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर रिक्त कुओं को सेट करें। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में 250 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में 200 माइक्रोमोलर सीपीआरजी और 0.1% डिटर्जेंट की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं में सीपीआरजी सब्सट्रेट समाधान के 40 माइक्रोलीटर और डिटर्जेंट समाधान के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।इनक्यूबेशन के बाद, दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर, माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 595 नैनोमीटर पर अवशोषण को मापें। सॉफ़्टवेयर में, पता लगाने की विधि के रूप में अवशोषण और पढ़ने के प्रकार के रूप में अंत बिंदु का चयन करके एक नया प्रोटोकॉल बनाएं, फिर ठीक क्लिक करें। अगला, एक पठन चरण जोड़ें।चयनित तरंग दैर्ध्य टाइप करें और ठीक क्लिक करें। प्लेट लेआउट अनुभाग में पढ़ने के लिए कुओं को चिह्नित करें, ठीक क्लिक करें, और पढ़ने की प्लेट पर क्लिक करें, स्क्रीन पर दिखाई देने वाले मूल्यों की प्रतीक्षा करें और परिणामों का विश्लेषण करने के लिए उन्हें स्प्रेडशीट में निर्यात करें और पांडुलिपि में वर्णित घटाव का उपयोग करके अवशोषण मूल्यों की गणना करें। सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, एक्सवाई तालिका में 595 नैनोमीटर पर अवशोषण बनाम बीजेडएन की एकाग्रता की साजिश करें।विश्लेषण पर क्लिक करके, ट्रांसफ़ॉर्म विकल्प का चयन करके और ठीक क्लिक करके बीजेडएन सांद्रता को लघुगणकीय मानों में बदलें। IC50 मान प्राप्त करने के लिए, विश्लेषण क्लिक करें, और XY विश्लेषण सूची से नॉनलाइनियर प्रतिगमन वक्र फ़िट का चयन करें, फिर ठीक क्लिक करें। अगला, पैरामीटर विंडो पर जाएं, मॉडल टैब में, अंतर्निहित समीकरणों के खुराक प्रतिक्रिया निषेध समूह पर जाएं, पैरामीटर के लिए लॉग अवरोधक बनाम प्रतिक्रिया चर ढलान का चयन करें क्योंकि खुराक प्रतिक्रिया विधि अन्य सभी टैब को डिफ़ॉल्ट मानों पर छोड़ देती है और फिर क्लिक करें, ठीक है।IC50 मान, एसडी, और फिट की अच्छाई खोजने के लिए परिणाम अनुभाग पर क्लिक करें। अवशोषण मूल्यों बनाम दवा की लघुगणक एकाग्रता के एक्सवाई ग्राफ को खोजने के लिए ग्राफ अनुभाग पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि वक्र फिट भी एक अलग रंग में रेखांकित है। वर्तमान अध्ययन में, एपिमास्टिगोट्स के लिए प्राप्त आईसी 50 मूल्य पिछले अध्ययनों के समान लगभग 20 माइक्रोमोलर था।इसके अलावा, परिणामों ने समय के साथ एपिमास्टिगोट्स की लाइनर बीटा गैलेक्टोसिडेस गतिविधि का संकेत दिया। वॉल्यूम प्रबंधन में परीक्षण की गई प्रत्येक स्थिति की कम से कम प्रतिकृतियां करना और कम से कम त्रुटियों को करना बहुत महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

रैपिड एक कदम एंजाइमी संश्लेषण और Trehalose analogues के सभी जलीय शोधन

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

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Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

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Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

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च1का अलगाव-परजीवी Protist Trypanosoma brucei से ATPase

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Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

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Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

थर्मोटोगा मैरिटिमा झिल्ली-बाउंड पायरोफोस्फेटेसे अवरोधकों के लिए स्क्रीनिंग

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

एक सेल आधारित एस्ट्रोजन रिसेप्टर β रिपोर्टर परख का उपयोग कर फाइटोएस्ट्रोजेन के लिए स्क्रीनिंग

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

रैंडम माइक्रोसीेड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग का उपयोग करके I3C के साथ प्रोटीन क्रिस्टल का व्युत्पन्न

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...