Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Ringraziamo il Dr. Buckner per aver gentilmente fornito il plasmide pLacZ. Questo lavoro è stato sostenuto da Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva dall'Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) e Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art è stato utilizzato per produrre la Figura 1 (https://smart.servier.com).

NOTA: una panoramica dell'intero progetto sperimentale è illustrata nella Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del test di screening in vitro della linea Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ utilizzando CPRG come substrato per la reazione colorimetrica. Il test consiste nel seminare i parassiti (...

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	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. 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A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

Questo articolo descrive un test basato sulla determinazione dell'attività citoplasmatica β-galattosidasi rilasciata a causa della lisi di membrana di T. cruzi epimastigotes, tripomastigotes o cellule infette con amastigoti in presenza del substrato CPRG. Abbiamo usato i parassiti T. cruzi Dm28c/pLacZ, un ceppo parassitario stabile ottenuto dopo la trasfezione con un plasmide portatore di β-galattosidasi costruito da Buckner e co-autori10. Questo test è stato utilizzato per l...

La malattia di Chagas (ChD), o tripanosomiasi americana, è una malattia parassitaria causata dal protozoo flagellato, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD inizia con una fase acuta asintomatica o oligosintomatica che di solito non viene diagnosticata, seguita da una fase cronica permanente. Nella cronicità, ~ 30% dei pazienti manifesta - decenni dopo l'infezione - una varietà di condizioni debilitanti, tra cui miocardiopatia, sindromi mega-digestive, o entrambe, con un tasso di mortalità che va dallo 0,2% al 20% 1,2,3. I pazienti cronici asintomatici possono non avere segni clinici, ma rimangono sieropositivi per tutta la vita.
Le stime suggeriscono che circa 7 milioni di persone sono infette in tutto il mondo, per lo più dall'America Latina, dove la ChD è endemica. In questi paesi, T. cruzi viene trasmesso principalmente attraverso insetti triatomine infetti succhiatori di sangue (trasmissione trasmessa da vettori) e meno frequentemente per trasmissione orale attraverso l'ingestione di alimenti contaminati da feci di triatomina contenenti i parassiti2. Inoltre, il parassita può essere trasmesso attraverso la placenta dalle madri chagasic ai neonati, attraverso trasfusioni di sangue o durante il trapianto di organi. Questi modi indipendenti dal vettore di acquisire l'infezione e la migrazione umana hanno contribuito alla diffusione mondiale della malattia, evidenziata da un numero crescente di casi in Nord America, Europa e alcuni paesi africani, del Mediterraneo orientale e del Pacifico occidentale4. La ChD è considerata una malattia trascurata in quanto la trasmissione trasmessa da vettori è strettamente associata alla povertà ed è un importante problema di salute pubblica, specialmente nei paesi a basso reddito dell'America Latina. Sebbene ci siano trattamenti disponibili, la mortalità dovuta a ChD in America Latina è la più alta tra le malattie parassitarie, tra cui la malaria2.
Ci sono due farmaci registrati per il trattamento ChD introdotti alla fine del 1960 e all'inizio del 1970: nifurtimox e benznidazolo5. Entrambi i farmaci sono efficaci nella fase acuta della malattia negli adulti, nei bambini e nei neonati congenitamente infetti, così come nei bambini con infezione cronica, dove di solito si ottiene la cura. Tuttavia, solo poche persone vengono diagnosticate abbastanza presto da essere trattate in tempo. Secondo gli ultimi studi clinici, entrambi i farmaci hanno importanti limitazioni negli adulti e sono stati inefficaci nel ridurre i sintomi nelle persone con malattie croniche; quindi, il loro uso in questa fase è controverso. Altri inconvenienti sono i periodi di trattamento prolungati richiesti (60-90 giorni) e gli effetti avversi frequenti e gravi osservati, che portano all'interruzione della terapia in una percentuale di persone infette 6,7. Si stima che meno del 10% delle persone con ChD siano state diagnosticate e ancora meno abbiano accesso alle cure, poiché molti individui affetti vivono in aree rurali con accesso assente o scarso all'assistenza sanitaria8. Questi fatti evidenziano l'urgente necessità di trovare nuovi farmaci contro T. cruzi per consentire trattamenti più efficienti, sicuri e applicabili al campo, specialmente per la fase cronica. A questo proposito, un'altra sfida nello sviluppo di composti più efficaci è la limitazione dei sistemi per valutare l'efficacia dei farmaci in vitro e in vivo9.
Sebbene la biologia chimica e gli approcci genomici per l'identificazione di potenziali bersagli farmacologici siano stati utilizzati nei parassiti kinetoplastidi, gli strumenti genomici disponibili in T. cruzi sono limitati in contrasto con T. brucei o Leishmania. Pertanto, lo screening di composti con attività tripanocida è ancora l'approccio più utilizzato nella ricerca di nuovi candidati farmaci chemioterapici contro ChD. Di solito, la scoperta di farmaci in T. cruzi deve iniziare con il test degli effetti di un nuovo farmaco in un test in vitro contro lo stadio epimastigote. Per decenni, l'unico modo per misurare gli effetti inibitori dei composti candidati su T. cruzi era il conteggio microscopico manuale, che è laborioso, dispendioso in termini di tempo e dipendente dall'operatore. Inoltre, questo approccio è adatto per l'analisi di un piccolo numero di composti, ma è inaccettabile per lo screening ad alto rendimento di grandi librerie di composti. Al giorno d'oggi, molte indagini iniziano con l'analisi di un vasto numero di composti di origini diverse che vengono analizzati in vitro, testando la loro capacità di inibire la crescita dei parassiti. Sono stati sviluppati sia metodi colorimetrici che fluorometrici per aumentare la produttività in questi saggi, migliorando l'obiettività dello screening e rendendo l'intero processo meno noioso9.
Uno dei metodi colorimetrici più utilizzati si basa sull'attività β-galattosidasi dei parassiti trasfettati descritti per la prima volta da Bucknet e dai collaboratori10. L'enzima β-galattosidasi espresso dai parassiti ricombinanti idrolizza il substrato cromogenico, il clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside (CPRG), al rosso clorofenolo, che può essere facilmente misurato colorimetricamente utilizzando uno spettrofotometro a micropiastre. Pertanto, la crescita del parassita in presenza di una varietà di composti può essere simultaneamente valutata e quantificata in piastre di microtitolazione. Questo metodo è stato applicato per testare farmaci in forme epimastigote (presenti nell'insetto vettore), tripomastigoti e amastigoti intracellulari, gli stadi mammiferi del parassita. Inoltre, sono già disponibili diversi ceppi di T. cruzi ricombinanti trasfettati con il plasmide pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 per esprimere l'enzima Escherichia coli β-galattosidasi (e ne possono essere costruiti di nuovi), che consente la valutazione di parassiti provenienti da diverse unità di tipizzazione discreta (DTU) che potrebbero non comportarsi allo stesso modo verso gli stessi composti 10,11,12,13 . Questo metodo è già stato utilizzato con successo per valutare i composti per l'attività contro T. cruzi nello screening a bassa e alta produttività12,13. Approcci simili sono stati utilizzati anche in altri parassiti protozoari, tra cui Toxoplasma gondii e Leishmania mexicana14,15.
Questo documento descrive e mostra un metodo dettagliato per uno screening farmacologico in vitro contro tutte le fasi del ciclo di vita di T. cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi. I saggi qui presentati sono stati eseguiti con una linea di T. cruzi che esprime β galattosidasi ottenuta per trasfezione del ceppo T. cruzi Dm28c da DTU I13 con plasmide pLacZ (Dm28c/pLacZ). Inoltre, lo stesso protocollo potrebbe essere facilmente adattato ad altri ceppi per confrontare le prestazioni tra composti e tra ceppi di T. cruzi o DTU.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi è l'agente eziologico della malattia di Chagas (ChD), una malattia endemica di importanza per la salute pubblica in America Latina che colpisce anche molti paesi non endemici a causa dell'aumento della migrazione. Questa malattia colpisce quasi 8 milioni di persone, con nuovi casi stimati in 50.000 all'anno. Negli anni 1960 e '70, sono stati introdotti due farmaci per il trattamento della ChD: nifurtimox e benznidazolo (BZN). Entrambi sono efficaci nei neonati e durante la fase acuta della malattia ma non nella fase cronica, e il loro uso è associato a importanti effetti collaterali. Questi fatti sottolineano l'urgente necessità di intensificare la ricerca di nuovi farmaci contro T. cruzi.
T. cruzi è trasmesso attraverso insetti vettori ematofagi delle famiglie Reduviidae ed Hemiptera. Una volta nell'ospite mammifero, si moltiplica intracellulare come forma amastigote non flagellata e si differenzia nella tripomastigote, la forma infettiva non replicativa del flusso sanguigno. All'interno dell'insetto vettore, i tripomastigoti si trasformano nello stadio epimastigote e si moltiplicano attraverso la fissione binaria.
Questo articolo descrive un test basato sulla misurazione dell'attività della β-galattosidasi citoplasmatica rilasciata nella coltura a causa della lisi dei parassiti utilizzando il substrato, clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside (CPRG). Per questo, il ceppo T. cruzi Dm28c è stato trasfettato con un plasmide sovraespressivo β-galattosidasi e utilizzato per lo screening farmacologico in vitro negli stadi epimastigote, tripomastigote e amastigote. Questo articolo descrive anche come misurare l'attività enzimatica in epimastigoti in coltura, cellule Vero infette con amastigoti e tripomastigoti rilasciati dalle cellule coltivate utilizzando il farmaco di riferimento, il benznidazolo, come esempio. Questo test colorimetrico è facilmente eseguibile e può essere scalato in un formato ad alta produttività e applicato ad altri ceppi di T. cruzi .

Seguendo il protocollo sopra descritto, gli epimastigoti Dm28c che esprimono β galattosidasi sono stati incubati con 6 concentrazioni di BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (o composti di interesse) per 72 ore. Dopo questo periodo, il reagente CPRG è stato aggiunto insieme al detergente, che lisa le cellule e rilascia β-galattosidasi. CpRG è scisso dalla β-galattosidasi per produrre clorofenolo rosso, portando ad un cambiamento di colore da giallo a rossastro (Figura 2A). Il rosso clorofen...

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In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

Descriviamo un saggio colorimetrico ad alto rendimento che misura l'attività β-galattosidasi in tre fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi, l'agente eziologico della malattia di Chagas. Questo test può essere utilizzato per identificare i composti tripanocidi in modo facile, veloce e riproducibile.

In vitro Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Questo protocollo descrive un test colorimetrico ad alto rendimento nelle tre fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi per identificare nuovi farmaci candidati per la malattia di Chagas. Questo può essere usato per identificare i composti tripanocidi in modo facile, veloce e riproducibile. A dimostrare la procedura sarà Romina Manarin, tecnico di laboratorio di coltura cellulare del laboratorio del presepe Pamela.Inizia coltivando beta galattosidasi che esprime Trypanosoma cruzi epimastigotes in un pallone di coltura tissutale T-25 e incuba a 28 gradi Celsius per farli crescere axenicamente. Utilizzando una camera Neubauer, quantificare la crescita del parassita prima della subculturazione. Per mantenere le colture in una fase di log, sottocoltura ogni 48-72 ore in cinque millilitri di mezzo LIT integrato con 10% FCS e geneticina in solfato ad una concentrazione finale di 200 microgrammi per millilitro.Quindi chiudere saldamente il cappuccio prima di incubare a 28 gradi Celsius in posizione verticale. Dalla coltura in fase logaritmica, effettuare una sospensione di epimastigote in mezzo LIT integrata con geneticina e solfato alla concentrazione finale di 200.000 cellule per millilitro epimastigote per millilitro. Dopo aver erogato 100 microlitri di sospensione per pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, trucco volume finale di ben 200 microlitri con mezzo.Fare la sospensione cellulare Vero in DMEM integrata con 2% FCS alla concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro. Semina 100 microlitri della sospensione per pozzetto in una piastra di coltura tissutale da 96 pozzi. Incubare le cellule durante la notte per l'aderenza e il giorno successivo, osservare le cellule al microscopio.Il giorno successivo, risciacquare il monostrato cellulare Vero tre volte con 100 microlitri di PBS sterile. Aggiungere tripomastitigoti metaciclici ottenuti in precedenza. Aggiungere una molteplicità di infezione o MOI di 10-1 su 100 microlitri di DMEM integrati con il 2% di FCS per pozzetto e incubare per sei ore come dimostrato in precedenza.Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra due volte con PBS e aggiungere 100 microlitri di DMEM senza rosso fenolo integrato con il 2% di FCS. Dopo aver fatto la sospensione delle cellule Vero in DMEM aggiungere la concentrazione finale di 1 milione di cellule per millilitro. Semina 800.000 cellule in cinque millilitri del mezzo in palloni T-25 e incuba durante la notte per l'aderenza cellulare.Una volta che il pallone è stato risciacquato con PBS, aggiungere tripomastiti, aggiungere un MOI di 10-1 in cinque millilitri di DMEM integrato con 2% FCS e incubare durante la notte come dimostrato in precedenza. Alla fine dell'incubazione, lavare il pallone due volte con PBS. Aggiungere cinque millilitri di DMEM fresco integrato con 2% FCS e incubare per quattro giorni.Al termine dell'incubazione, dopo aver osservato la presenza del surnatante per i tripomastigoti al microscopio ottico. Quantificare i tripomastimiti utilizzando una camera neubauer. Raccogliere il surnatante in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 7.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.Quindi scartare il surnatante e risospese il pellet in DMEM senza rosso fenolo integrato con 2% FCS per ottenere una concentrazione di 1 milione di tripomastiti per millilitro. Semina 100 microlitri della sospensione di tripomastigote per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere la soluzione di benznidazolo agli epimastigoti, alle cellule Vero con amastigoti o ai tripomastigoti come descritto nel manoscritto del testo.Quindi incubare gli epimastigoti, impostare 28 gradi Celsius per 72 ore e i tripomastigoti o cellule Vero infette con amastigoti per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per il test coloremetrico, impostare i pozzetti vuoti aggiungendo 100 microlitri di PBS o mezzo corrispondente. Quindi, aggiungere 40 microlitri di soluzione di substrato CPRG e 10 microlitri della soluzione detergente a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 200 micromolari CPRG e 0,1% detergente in un volume finale di 250 microlitri in ciascun pozzetto.Dopo l'incubazione, a 37 gradi Celsius per due ore, misurare l'assorbanza a 595 nanometri utilizzando uno spettrofotometro a micropiastre. Nel software, creare un nuovo protocollo selezionando l'assorbanza come metodo di rilevamento e il punto finale come tipo di lettura, quindi fare clic su OK. Quindi, aggiungi un passaggio di lettura.Digitate la lunghezza d'onda selezionata e fate clic su OK. Nella sezione layout della piastra contrassegnare i pozzetti da leggere, fare clic su OK e fare clic su leggi lastra, attendere che i valori vengano visualizzati sullo schermo ed esportarli in un foglio di calcolo per analizzare i risultati e calcolare i valori di assorbanza utilizzando la sottrazione come descritto nel manoscritto. Nel software di analisi statistica, tracciare la concentrazione di BZN rispetto all'assorbanza a 595 nanometri nella tabella XY.Trasformare le concentrazioni di BZN in valori logaritmici facendo clic su Analizza, selezionando l'opzione di trasformazione e facendo clic su OK. Per ottenere i valori IC50, fare clic su Analizza e dall'elenco analisi XY selezionare adattamento curva di regressione non lineare, quindi fare clic su OK. Quindi, vai alla finestra dei parametri, nella scheda del modello, vai al gruppo di inibizione della risposta alla dose delle equazioni incorporate, seleziona l'inibitore del registro rispetto alla pendenza della variabile di risposta per i parametri poiché il metodo di risposta alla dose lascia tutte le altre schede ai valori predefiniti e quindi fai clic su OK.Fai clic sulla sezione dei risultati per trovare il valore IC50, la SD e la bontà della vestibilità. Fare clic sulla sezione del grafico per trovare il grafico XY della concentrazione logaritmica del farmaco rispetto ai valori di assorbanza e assicurarsi che anche l'adattamento della curva sia rappresentato graficamente in un colore diverso. Nel presente studio, il valore IC50 ottenuto per gli epimastigoti era di circa 20 micromolari, simile agli studi precedenti.Inoltre, i risultati hanno indicato l'attività della beta galattosidasi di liner degli epimastigoti nel tempo. È molto importante eseguire almeno repliche di ogni condizione testata e ridurre al minimo gli errori nella gestione del volume.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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