Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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pLacZプラスミドを提供してくれたバックナー博士に感謝します。この研究は、アルゼンチンのAgencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica、Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212)、Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]の支援を受けた。Servier Medical Artは 、図1 (https://smart.servier.com)の制作に使用されました。

注:実験計画全体の概要を 図1に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> 図1:比色反応の基質としてCPRGを用いたトリパノソーマ・クルジDm28c/pLacZ株のインビトロスクリーニングアッセイの概要。アッセイは、寄生虫を播種し(1)、BZNと共にインキ...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. 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M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

この論文は、基質CPRGの存在下で、T. cruzi epimastigotes、trypomastigotes、またはアマスチゴテスに感染した細胞の膜溶解のために放出される細胞質β-ガラクトシダーゼ活性を決定することに基づくアッセイについて記載する。我々は、Bucknerと共著者ら10によって構築されたβ-ガラクトシダーゼ担持プラスミドとのトランスフェクション後に得られた安定な寄生虫株であるT...

シャーガス病(ChD)、またはアメリカのトリパノソーマ症は、鞭毛原生動物、トリパノソーマクルジ(T. cruzi)によって引き起こされる寄生虫病です。ChDは、通常診断されていない無症候性または寡占症候性の急性期から始まり、生涯にわたる慢性期が続く。慢性化では、患者の〜30%が感染後数十年後、心筋症、巨消化症候群、またはその両方を含むさまざまな衰弱状態を示し、死亡率は0.2%から20%の範囲である1,2,3。無症候性の慢性患者は、臨床的徴候を有さないかもしれないが、生涯を通じて血清陽性のままである。
推定によると、世界中で約700万人が感染しており、そのほとんどはChDが風土病であるラテンアメリカから来ています。これらの国々では、 T. cruzi は主に感染した血液を吸うトリアトミンバグ(ベクター媒介性伝染)を介して伝染し、寄生虫を含むトリトミン糞便で汚染された食物の摂取による経口伝染によってはそれほど頻繁ではない2。さらに、寄生虫は、シャーガシックな母親から新生児への胎盤を介して、輸血を介して、または臓器移植中に伝達され得る。感染およびヒト移動を獲得するこれらのベクターに依存しない方法は、北米、ヨーロッパ、および一部のアフリカ、東地中海、および西太平洋諸国での症例数の増加によって証明され、この疾患の世界的な広がりに貢献しています4。ChDは、ベクター媒介性伝播が貧困と密接に関連しており、特にラテンアメリカの低所得国では主要な公衆衛生問題であるため、無視された疾患と考えられています。利用可能な治療法はありますが、ラテンアメリカのChDによる死亡率はマラリアを含む寄生虫病の中で最も高いです2。
1960年代後半から1970年代初頭に導入されたChD治療のための2つの登録薬があります:ニフルチモックスとベンズニダゾール5。両方の薬物は、成人、小児、および先天的に感染した新生児、ならびに治癒が通常達成される慢性感染を有する小児における疾患の急性期に有効である。しかし、時間内に治療を受けるのに十分な早期に診断されるのはごくわずかです。最新の臨床試験によると、両方の薬物は成人に重要な制限があり、慢性疾患患者の症状を軽減するのに効果がありません。したがって、この段階での使用は議論の余地があります。他の欠点は、必要な治療期間の延長(60〜90日)および観察される頻繁で重度の有害作用であり、感染者の割合で治療の中止につながる6,7。ChD患者の10%未満が診断を受けており、多くの罹患者が医療へのアクセスがない、またはほとんどない農村部に住んでいるため、治療を受けることができる人はさらに少ないと推定されています8。これらの事実は、特に慢性期において、より効率的で安全で、現場に適用可能な治療を可能にするために、T. cruziに対する新薬を見つける緊急の必要性を強調している。これに関して、より効果的な化合物の開発における別の課題は、インビトロおよびインビボでの薬物有効性を評価するためのシステムの限界である9。
潜在的な薬物標的の同定のためのケミカルバイオロジーおよびゲノムアプローチは、キネトプラスチド寄生虫において使用されてきたが、 T. cruzi において利用可能なゲノムツールは、 T. brucei または Leishmaniaとは対照的に限られている。したがって、トリパノサイド活性を有する化合物のスクリーニングは、ChDに対する新しい化学療法薬候補の探索において依然として最も使用されるアプローチであり、通常、 T. cruzi における創薬は、エピマスチゴート段階に対する in vitroアッセイにおける 新薬の効果を試験することから始めなければならない。何十年もの間、 T. cruzi に対する候補化合物の阻害効果を測定する唯一の方法は、手作業による顕微鏡計数であり、これは手間がかかり、時間がかかり、オペレータに依存していました。さらに、このアプローチは、少数の化合物をアッセイするのには適しているが、大規模な化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングには受け入れられない。今日、多くの研究は、 インビトロでアッセイされる異なる起源からの膨大な数の化合物の分析から始まり、寄生虫の成長を阻害する能力をテストする。比色法と蛍光法の両方が開発され、これらのアッセイのスループットを向上させ、スクリーニングの客観性を向上させ、プロセス全体の退屈さを軽減します9。
最も広く使用されている比色法の1つは、Bucknetおよび共同研究者10によって最初に記載されたトランスフェクト寄生虫のβ−ガラクトシダーゼ活性に基づくものである。組換え寄生虫によって発現されるβ-ガラクトシダーゼ酵素は、発色基質、クロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド(CPRG)、クロロフェノールレッドを加水分解し、マイクロプレート分光光度計を用いて比色法で容易に測定することができる。したがって、種々の化合物の存在下での寄生虫増殖は、マイクロタイタープレートにおいて同時に評価および定量することができる。この方法は、寄生虫の哺乳類の段階であるエピマスチゴート形態(昆虫ベクター中に存在する)、トリポマスチゴット、および細胞内アマスチゴテスの試験薬物に適用されている。さらに、大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素を発現するためにpBS:CL-Neo-01/BC-X-10プラスミド(pLacZ)10を導入したいくつかの組換えT. cruzi株がすでに入手可能であり(そして新しいものを構築することができる)、同じ化合物に対して等しく振る舞わない可能性のある異なる離散型型単位(DTU)からの寄生虫の評価を可能にする10、11、12、13.この方法は、低スループットおよびハイスループットスクリーニングにおけるT. cruziに対する活性について化合物を評価するために既に首尾よく使用されている12、13。同様のアプローチは、トキソプラズマ・ゴンディイおよびリーシュマニア・メキシカーナを含む他の原生動物寄生虫においても使用されている14,15。
この論文は、β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いて、T. cruziのすべてのライフサイクル段階に対するin vitro薬物スクリーニングのための詳細な方法を記載し、示している。ここで提示するアッセイは、DTU I13由来のT. cruzi Dm28c株をpLacZプラスミド(Dm28c/pLacZ)でトランスフェクションすることによって得られたβ-ガラクトシダーゼ発現T. cruzi株を用いて実施された。さらに、同じプロトコルを他の株に容易に適合させて、化合物間およびT. cruzi株またはDTU間の性能を比較することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

トリパノソーマ・クルジ は、ラテンアメリカで公衆衛生上重要な風土病であるシャーガス病(ChD)の原因物質であり、移住の増加により多くの非流行国にも影響を及ぼします。この病気は800万人近くが罹患しており、新規症例は年間5万人と推定されています。1960年代と70年代には、ChD治療のための2つの薬物が導入されました:ニフルチモックスとベンズニダゾール(BZN)。どちらも新生児および疾患の急性期には有効であるが、慢性期には有効ではなく、それらの使用は重要な副作用と関連している。これらの事実は、 T. cruziに対する新薬の探索を強化する緊急の必要性を強調しています。
T. cruzi は、ReduviidaeおよびHemiptera科の血道昆虫ベクターを介して伝達される。哺乳類宿主に入ると、非鞭毛状アマスチゴート型として細胞内で増殖し、血流非複製性感染型であるトリポマスチゴテに分化する。昆虫ベクターの内部では、トリポマスチゴテスはエピマスティゴット段階に変化し、二元核分裂によって増殖する。
本論文では、基質であるクロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド(CPRG)を用いて寄生虫溶解により培養物中に放出される細胞質β-ガラクトシダーゼの活性を測定することに基づくアッセイについて述べる。このために、 T. cruzi Dm28c株にβ-ガラクトシダーゼ過剰発現プラスミドをトランスフェクトし、エピマスチゴテ、トリポマスチゴテ、およびアマスチゴーテの段階における インビトロ 薬理学的スクリーニングに使用した。また、参照薬ベンズニダゾールを用いて、培養エピマスチゴット、アマスチゴットに感染したVero細胞、培養細胞から放出されるトリポマスチゴットの酵素活性を測定する方法についても説明します。この比色アッセイは簡単に実施でき、ハイスループット形式にスケーリングし、他の T. cruzi 株に適用することができます。

上述のプロトコールに従って、β-ガラクトシダーゼ発現Dm28cエピマスチゴットを、6濃度のBZN(2.5、5、10、20、40、80μM)(または目的の化合物)と共に72時間インキュベートした。この期間の後、CPRG試薬を洗剤と共に添加し、細胞を溶解し、β-ガラクトシダーゼを放出する。CPRGは、β-ガラクトシダーゼによって切断されてクロロフェノール赤色を生成し、黄色から赤みを帯びた色に変化する(<strong cl...

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In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

シャーガス病の原因物質である トリパノソーマ・クルジの3つのライフサイクル段階におけるβ-ガラクトシダーゼ活性を測定するハイスループット比色アッセイについて述べる。このアッセイは、トリパノサイド化合物を容易、迅速、かつ再現性のある方法で同定するために使用することができる。

インビトロ β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いた トリパノソーマクルジ のすべてのライフサイクル段階に対する薬物スクリーニング

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

このプロトコルは、シャーガス病の新薬候補を同定するためのトリパノソーマ・クルジの3つのライフサイクル段階におけるハイスループット比色アッセイを記載している。これは、トリパノサイド化合物を容易、迅速、かつ再現可能な方法で同定するために使用することができる。手順を実演するのは、パメラベビーベッドの研究室のラボ細胞培養技術者であるロミナ・マナリンです。トリパノソーマ・クルジ・エピマスティゴテスを発現するベータ・ガラクトシダーゼをT-25組織培養フラスコ中で培養することから始め、摂氏28度でインキュベートしてアキセニックに成長させる。ノイバウアーチャンバーを用いて、継代培養前に寄生虫の増殖を定量化する。培養物を対数期に維持するために、硫酸塩中の10%FCSおよびジェネチシンを1ミリリットル当たり200マイクログラムの最終濃度で補充した5ミリリットルのLIT培地中で48〜72時間ごとに継代培養する。その後、キャップをしっかり閉めてから、垂直位置で摂氏28度でインキュベートします。対数期培養から、ジェネティシンと硫酸塩を添加したLIT培地にエピマスチゴートを終濃度200,000細胞当たり200,000細胞/ミリリットルのエピマスチゴート1ミリリットルで懸濁液を作る。96ウェルプレートのウェル当たり100マイクロリットルの懸濁液を分配した後、200マイクロリットルのウェルの最終容量を培地でメイクアップする。DMEM中のVero細胞懸濁液に、1ミリリットルあたり100,000細胞の最終濃度で2%FCSを添加した。種子1ウェルあたり100マイクロリットルの懸濁液を96ウェル組織培養プレートに入れた。接着のために細胞を一晩インキュベートし、翌日、顕微鏡下で細胞を観察する。翌日、Vero細胞単分子層を100マイクロリットルの滅菌PBSで3回すすいでください。以前に得られた中環式トリポマスチゴットを加える。ウェルあたり2%FCSを添加した100マイクロリットルのDMEMに10-1の感染またはMOIの多重度を加え、以前に実証したように6時間インキュベートする。インキュベーションの最後に、PBSでプレートを2回洗浄し、2%FCSを添加したフェノールレッドを含まないDMEMを100マイクロリットル加える。DMEM中でVero細胞懸濁液を作製した後、1ミリリットルあたり100万個の細胞の最終濃度を加える。種子800、000細胞をT−25フラスコ中の5ミリリットルの培地中で、細胞接着のために一晩インキュベートした。フラスコをPBSですすぎ、トリポマスチゴテスを加え、2%FCSを添加した5ミリリットルのDMEMに10-1のMOIを加え、前述のように一晩インキュベートする。インキュベーションの終わりに、フラスコをPBSで2回洗浄する。2%FCSを添加した5ミリリットルの新鮮なDMEMを加え、4日間インキュベートする。インキュベーションの最後に、トリポマスチゴテス存在について上清を光学顕微鏡下で観察した後。ノイバウアーチャンバーを用いてトリポマスチゴテスを定量化する。上清を15ミリリットルのチューブに集め、7, 000倍Gで室温で10分間遠心分離する。次いで、上清を捨て、2%FCSを添加したフェノールレッドを含まないDMEMにペレットを再懸濁し、1ミリリットルあたり100万トリポマスチゴットの濃度を得た。種子100マイクロリットルのトリポマスチゴート懸濁液を1ウェルあたり96ウェルプレートに含む。ベンズニダゾール溶液をエピマスチゴット、アマスチゴットを含むベロ細胞、またはテキスト原稿に記載されているようにトリポマスチゴテスに加える。その後、エピマスティゴットをインキュベートし、摂氏28度で72時間、トリポマスチゴテスまたは感染したVero細胞を37°Cおよび5%二酸化炭素で24時間アマスチゴテスでインキュベートする。比色アッセイのために、100マイクロリットルのPBSまたは対応する培地を加えてブランクウェルをセットアップする。次に、40マイクロリットルのCPRG基質溶液および10マイクロリットルの洗剤溶液を各ウェルに加え、各ウェルに最終容量250マイクロリットルの最終濃度200マイクロモルCPRGおよび0.1%洗剤を得る。インキュベーション後、摂氏37度で2時間、マイクロプレート分光光度計を用いて595ナノメートルの吸光度を測定する。ソフトウェアで、検出方法として吸光度を選択し、読み取りタイプとしてエンドポイントを選択して新しいプロトコルを作成し、[OK]をクリックします。次に、読み取りステップを追加します。選択した波長を入力し、「OK」をクリックします。プレートレイアウトセクションで、読み取るウェルにマークを付け、[OK]をクリックし、[プレートの読み取り]をクリックし、値が画面に表示されるのを待ってスプレッドシートにエクスポートし、結果を分析し、原稿に記載されているように減算を使用して吸光度値を計算します。統計解析ソフトウェアで、BZNの濃度対595ナノメートルでの吸光度をXY表にプロットする。BZN 濃度を対数値に変換するには、[分析] をクリックし、[変換] オプションを選択して、[OK] をクリックします。IC50値を取得するには、[解析]をクリックし、[XY解析]リストから[非線形回帰カーブフィット]を選択し、[OK]をクリックします。次に、パラメータウィンドウに移動し、[モデル]タブで、組み込み方程式の線量反応抑制グループに移動し、線量反応法としてパラメータの対数阻害剤対応答変数の傾きを選択し、他のすべてのタブをデフォルト値のままにしてからクリックします。結果セクションをクリックして、IC50値、SD、および適合度を確認します。グラフセクションをクリックして、薬物の対数濃度と吸光度値のXYグラフを見つけ、カーブフィットも別の色でグラフ化されていることを確認します。本研究では、エピマスチゴットについて得られたIC50値は、以前の研究と同様に約20マイクロモルであった。加えて、結果は、経時的なエピマスチゴットのライナーベータガラクトシダーゼ活性を示した。ボリューム管理において、テストおよび最小化されたエラーの各条件の少なくとも反復を実行することは非常に重要です。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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