Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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pLacZ 플라스미드를 친절하게 제공해 주신 Buckner 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, 아르헨티나의 Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) 및 영국 연구위원회 [MR / P027989 / 1]가 지원했습니다. Servier Medical Art는 도 1( https://smart.servier.com)을 제작하기 위해 사용되었다.

참고: 전체 실험 설계에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> 도 1: 비색 반응을 위한 기질로서 CPRG를 사용하는 트리파노소마 크루지 Dm28c/pLacZ 라인의 시험관내 스크리닝 분석의 개요. 이 분석은 기생충 (1)을 시드하고...

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	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. 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A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

이 논문은 기질 CPRG의 존재하에 T. cruzi epimastigotes, trypomastigotes, 또는 amastigotes로 감염된 세포의 막 용해로 인해 방출되는 세포질 β-갈락토시다제 활성을 결정하는 것에 기초한 검정을 기술한다. 우리는 T. cruzi Dm28c / pLacZ 기생충을 사용했는데, 이는 Buckner와 공동 저자10에 의해 구축 된 β 갈락토시다제 함유 플라스미드로 형질 감염 후 얻은 안정한 기생충 균주입니다. ?...

샤가스병(ChD) 또는 미국의 트리파노소마증은 편모 원생동물인 트리파노소마 크루지(T. cruzi)에 의해 유발되는 기생충 질환이다. ChD는 일반적으로 진단되지 않은 무증상 또는 올리고 증상 급성기로 시작하여 평생 만성 단계가 뒤 따릅니다. 만성적으로, 환자의 ~ 30 %는 감염 후 수십 년 후에 나타납니다 - 심근 병증, 메가 소화 증후군 또는 둘 다를 포함한 다양한 쇠약 한 상태가 나타나며 사망률은 0.2 %에서 20 % 1,2,3 사이입니다. 무증상 만성 환자는 임상 징후가 없지만 평생 동안 혈청 양성으로 남아있을 수 있습니다.
추정에 따르면 전 세계적으로 약 7 백만 명의 사람들이 ChD가 풍토병이있는 라틴 아메리카에서 주로 감염되었습니다. 이들 국가에서 T. cruzi 는 주로 감염된 피를 빨아 먹는 트리아토민 벌레 (벡터 매개 전염)를 통해 전염되며 기생충을 포함하는 트리아토민 배설물로 오염 된 음식의 섭취를 통한 경구 전달에 의해 덜 빈번합니다2. 또한, 기생충은 chagasic 어머니에서 신생아로, 수혈을 통해 또는 장기 이식 중에 태반을 통해 전염 될 수 있습니다. 감염 및 인간 이동을 획득하는 이러한 벡터 독립적 인 방법은 북미, 유럽 및 일부 아프리카, 동부 지중해 및 서태평양 국가에서 점점 더 많은 사례에 의해 입증 된이 질병의 전 세계적인 확산에 기여했습니다4. ChD는 벡터 매개 전염이 빈곤과 밀접한 관련이 있으며 특히 라틴 아메리카 저소득 국가에서 주요 공중 보건 문제이기 때문에 방치 된 질병으로 간주됩니다. 이용 가능한 치료법이 있지만 라틴 아메리카의 ChD로 인한 사망률은 말라리아2를 포함한 기생충 질환 중에서 가장 높습니다.
1960 년대 후반과 1970 년대 초에 도입 된 ChD 치료에 등록 된 두 가지 약물이 있습니다 : nifurtimox와 benznidazole5. 두 약물 모두 성인, 어린이 및 선천적으로 감염된 신생아뿐만 아니라 만성 감염이있는 어린이뿐만 아니라 치료가 일반적으로 이루어지는 어린이의 급성 단계에 효과적입니다. 그러나 소수의 사람들 만이 제 시간에 치료할 수있을만큼 일찍 진단됩니다. 최신 임상 시험에 따르면, 두 약물 모두 성인에게 중요한 한계가 있으며 만성 질환을 앓고있는 사람들의 증상을 줄이는 데 효과적이지 않았습니다. 따라서이 단계에서 그들의 사용은 논란의 여지가 있습니다. 다른 단점은 장기간 치료 기간 (60-90 일)과 빈번하고 심각한 부작용이 관찰되어 감염된 사람 6,7의 비율에서 치료를 중단하게됩니다. ChD 환자의 10 % 미만이 진단을 받았으며 많은 영향을받는 사람들이 의료 서비스에 대한 접근성이 없거나 부족한 농촌 지역에 살고 있기 때문에 치료에 접근 할 수있는 사람은 훨씬 적습니다8. 이러한 사실은 특히 만성 단계에 대해보다 효율적이고 안전하며 적용 가능한 현장 치료를 허용하기 위해 T. cruzi에 대한 신약을 찾아야 할 긴급한 필요성을 강조합니다. 이와 관련하여, 보다 효과적인 화합물의 개발에서 또 다른 과제는 시험관내 및 생체내9에서 약물 효능을 평가하기 위한 시스템의 제한이다.
잠재적 약물 표적의 확인을 위한 화학 생물학 및 게놈 접근법이 키네토플라스티드 기생충에서 사용되었지만, T. cruzi 에서 사용 가능한 게놈 도구는 T. brucei 또는 Leishmania와는 대조적으로 제한적이다. 따라서, 트립파노시드 활성을 갖는 화합물의 스크리닝은 ChD에 대한 새로운 화학요법 약물 후보물질을 찾는 데 여전히 가장 많이 사용되는 접근법이다. 보통, T. cruzi 에서의 약물 발견은 에피마스티고테 단계에 대한 시험관내 분석에서 신약의 효과를 시험하는 것으로 시작해야 한다. 수십 년 동안 T. cruzi 에 대한 후보 화합물의 억제 효과를 측정하는 유일한 방법은 수동 현미경 계수였으며, 이는 힘들고 시간이 많이 걸리며 운영자에 따라 다릅니다. 더욱이, 이 접근법은 적은 수의 화합물을 어세싱하는 데 적합하지만 큰 화합물 라이브러리의 고처리량 스크리닝에는 허용되지 않는다. 요즘 많은 조사는 시험관 내에서 분석 된 다양한 기원의 방대한 수의 화합물을 분석하여 기생충 성장을 억제하는 능력을 테스트하는 것으로 시작됩니다. 비색 및 불소 방법 모두 이러한 분석에서 처리량을 증가시켜 스크리닝의 객관성을 향상시키고 전체 프로세스를 덜 지루하게 만들기 위해 개발되었습니다9.
가장 널리 사용되는 비색 방법 중 하나는 Bucknet 및 공동 작업자(10)에 의해 처음 설명 된 형질감염된 기생충의 β-갈락토시다제 활성에 기초한다. 재조합 기생충에 의해 발현되는 β-갈락토시다제 효소는 발색성 기질인 클로로페놀 레드 β-D-갈락토피라노시드(CPRG)를 클로로페놀 레드로 가수분해하며, 이는 마이크로플레이트 분광광도계를 이용하여 비색적으로 쉽게 측정할 수 있다. 따라서, 다양한 화합물의 존재하에서의 기생충 성장은 마이크로타이터 플레이트에서 동시에 평가되고 정량될 수 있다. 이 방법은 epimastigote 형태 (곤충 벡터에 존재), trypomastigotes, 및 기생충의 포유동물 단계 인 세포 내 amastigotes에서 약물을 시험하기 위해 적용되었습니다. 또한, 에스케리치아 콜라이 β-갈락토시다제 효소를 발현하기 위해 pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 플라스미드(pLacZ)10으로 형질감염된 몇몇 재조합 T. cruzi 균주가 이미 이용가능하고(그리고 새로운 것들이 구축될 수 있음), 이는 동일한 화합물10,11,12,13에 대해 동등하게 행동하지 않을 수 있는 상이한 이산 타이핑 유닛(DTU)으로부터의 기생충의 평가를 허용한다. . 이 방법은 저처리량 및 고처리량 스크리닝12,13에서 T. cruzi에 대한 화합물에 대한 활성을 평가하기 위해 이미 성공적으로 사용되었다. 유사한 접근법이 Toxoplasma gondii 및 Leishmania mexicana14,15를 포함한 다른 원생 동물 기생충에서도 사용되었습니다.
이 논문은 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 사용하여 T. cruzi의 모든 수명주기 단계에 대한 시험관내 약물 스크리닝을 위한 상세한 방법을 설명하고 보여준다. 여기에 제시된 검정은 DTUI13으로부터 T. cruzi Dm28c 균주를 pLacZ 플라스미드 (Dm28c/pLacZ)로 형질감염시킴으로써 수득된 β-갈락토시다아제-발현 T. cruzi 라인으로 수행되었다. 추가적으로, 동일한 프로토콜은 화합물 사이의 성능과 T. cruzi 균주 또는 DTU 사이의 성능을 비교하기 위해 다른 균주에 쉽게 적응될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

트리파노소마 크루 지는 라틴 아메리카에서 공중 보건이 중요한 발병 질환인 샤가스병(ChD)의 원인균으로, 이주의 증가로 인해 많은 비발병 국가에도 영향을 미친다. 이 질병은 거의 8 백만 명의 사람들에게 영향을 미치며 새로운 사례는 연간 50,000 명으로 추산됩니다. 1960 년대와 70 년대에는 ChD 치료를위한 두 가지 약물, 즉 nifurtimox와 benznidazole (BZN)이 도입되었습니다. 둘 다 신생아와 질병의 급성기에는 효과적이지만 만성기에는 효과적이지 않으며 그 사용은 중요한 부작용과 관련이 있습니다. 이러한 사실은 T. cruzi에 대한 신약 검색을 강화할 긴급한 필요성을 강조합니다.
T. cruzi 는 Reduviidae 및 Hemiptera 가족의 hematophagous 곤충 벡터를 통해 전달됩니다. 일단 포유동물 숙주에 들어가면, 편모가 없는 아마스티고테 형태로서 세포내 증식하고, 트립포마스티고테, 혈류 비복제성 감염 형태로 분화된다. 곤충 벡터 내부에서, trypomastigotes는 epimastigote 단계로 변형되고 이진 분열을 통해 증식합니다.
본 논문은 기질인 클로로페놀 레드β-D-갈락토피라노사이드(CPRG)를 이용하여 기생충 용해로 인한 배양물 내로 방출된 세포질 β-갈락토시다제의 활성을 측정하는 것에 기초한 검정을 설명한다. 이를 위해, T. cruzi Dm28c 균주를 β-갈락토시다아제-과발현 플라스미드로 형질감염시키고, 에피마스티고테, 트리포마스티고테 및 아마스티고테 단계에서 시험관내 약리학적 스크리닝에 사용하였다. 이 논문은 또한 예를 들어 참조 약물인 벤즈니다졸을 사용하여 배양된 에피마스티고트, 아마티고트로 감염된 베로 세포, 및 트리포마스티고트에서 효소 활성을 측정하는 방법을 설명한다. 이 비색 분석은 쉽게 수행되며 고처리량 형식으로 스케일링하고 다른 T. cruzi 균주에 적용할 수 있습니다.

상기 기재된 프로토콜에 따라, β-갈락토시다제-발현 Dm28c 에피마스티고테스를 72시간 동안 6개의 농도의 BZN (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (또는 관심있는 화합물)과 함께 인큐베이션하였다. 이 기간 후, CPRG 시약을 세제와 함께 첨가하여 세포를 용해시키고 β-갈락토시다제를 방출합니다. CPRG는 β-갈락토시다제에 의해 절단되어 클로로페놀 적색을 생성하고, 노란색에서 적색으로 변색을 유도한다(<strong class...

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In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

우리는 Chagas 질병의 원인 인자 인 Trypanosoma cruzi의 세 가지 수명주기 단계에서 β-galactosidase 활성을 측정하는 고처리량 비색 분석을 설명합니다. 이 분석은 트립파노시달 화합물을 쉽고 빠르며 재현 가능한 방식으로 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

체외 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 이용한 트리파노소마 크루지 의 모든 생애주기 단계에 대한 약물 스크리닝

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

이 프로토콜은 Chagas 질병에 대한 신약 후보를 확인하기 위해 Trypanosoma cruzi의 세 가지 수명주기 단계에서 높은 처리량 비색 분석을 설명합니다. 이것은 쉽고 빠르며 재현 가능한 방식으로 트립파노시달 화합물을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Pamela crib의 실험실에서 실험실 세포 배양 기술자 인 Romina Manarin이 될 것입니다.T-25 조직 배양 플라스크에서 트립파노소마 크루지 에피마스티고테스를 발현하는 베타 갈락토시다제를 배양함으로써 시작하고, 이들을 축삭 방향으로 성장시키기 위해 섭씨 28도에서 배양한다. Neubauer 챔버를 사용하여 계대 배양하기 전에 기생충 성장을 정량화하십시오. 배양물을 로그 페이즈로 유지하기 위해, 10%FCS 및 설페이트 중의 제네티신이 보충된 5밀리리터의 LIT 배지에서 밀리리터당 200마이크로그램의 최종 농도로 48 내지 72시간마다 계대배양한다.그런 다음 수직 위치에서 섭씨 28도에서 배양하기 전에 뚜껑을 단단히 닫으십시오. 로그상 배양으로부터, 밀리리터 당 에피마스티고테 당 200, 000 세포의 최종 농도에서 제네티신 및 설페이트로 보충된 LIT 배지에서 에피마스티고테의 현탁액을 만든다. 96 웰 플레이트의 웰 당 100 마이크로리터의 현탁액을 분배한 후, 웰 200 마이크로리터의 최종 부피를 배지로 메이크업한다.2%FCS가 보충된 DMEM의 베로 세포 현탁액을 밀리리터 당 100, 000 세포의 최종 농도로 만드십시오. 현탁액을 웰당 100 마이크로리터의 시드를 96 웰 조직 배양 플레이트에 넣는다. 부착을 위해 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션하고 다음날 현미경으로 세포를 관찰한다.다음날, 베로 세포 단일층을 100 마이크로리터의 멸균 PBS로 세 번 헹구었다. 이전에 얻은 메타시클릭 트리포마스티고트를 첨가한다. 웰 당 2 % FCS로 보충 된 DMEM 100 마이크로 리터에 10-1의 감염 또는 MOI의 다중성을 추가하고 이전에 입증 된 바와 같이 6 시간 동안 배양하십시오.인큐베이션이 끝나면 플레이트를 PBS로 두 번 세척하고 2 %FCS로 보충 된 페놀 레드없이 100 마이크로 리터의 DMEM을 첨가하십시오. DMEM에서 베로 세포 현탁액을 만든 후 밀리리터 당 1 백만 세포의 최종 농도를 추가한다. 시드 800, 000 세포를 T-25 플라스크에서 배지의 5밀리리터에 넣고 세포 부착을 위해 밤새 인큐베이션한다.플라스크를 PBS로 헹구고 나면, 트립포마스티고트를 첨가하고, 2%FCS로 보충된 DMEM 5밀리리터에 10-1의 MOI를 첨가하고, 이전에 입증된 바와 같이 밤새 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝나면 플라스크를 PBS로 두 번 세척하십시오. 2 % FCS로 보충 된 신선한 DMEM 다섯 밀리리터를 넣고 나흘 동안 배양하십시오.인큐베이션의 끝에서, 트립포마스티고트의 존재에 대한 상청액을 광학 현미경으로 관찰한 후. Neubauer 챔버를 사용하여 트립포마스티고트를 정량화합니다. 상층액을 15 밀리리터 튜브에 수집하고, 실온에서 10분 동안 7, 000배 G에서 원심분리한다.그 후 상층액을 버리고 2%FCS로 보충된 페놀 레드 없이 DMEM에 펠렛을 재현탁시켜 밀리리터당 1백만 트리포마스티고트의 농도를 얻었다. 웰당 100 마이크로리터의 트립포마스티고트 현탁액을 96 웰 플레이트에 시드한다. 텍스트 원고에 설명 된대로 epimastigotes, amastigotes가있는 Vero 세포 또는 trypomastigotes에 benznidazole 용액을 추가하십시오.그런 다음 epimastigotes를 배양하고, 섭씨 28도를 72 시간 동안 설정하고, 트리포 마스티고트 또는 감염된 베로 세포를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 24 시간 동안 아마스티고테스로 감염시켰다. 비색 검정을 위해, PBS 또는 상응하는 배지 100 마이크로리터를 첨가하여 블랭크 웰을 설정한다. 다음으로, 40 마이크로리터의 CPRG 기질 용액과 10 마이크로리터의 세제 용액을 각 웰에 첨가하여 각 웰에 250 마이크로리터의 최종 부피의 200 마이크로몰 CPRG 및 0.1% 세제의 최종 농도를 얻는다.배양 후, 섭씨 37도에서 두 시간 동안, 마이크로플레이트 분광광도계를 이용하여 595 나노미터에서 흡광도를 측정하였다. 소프트웨어에서 흡광도를 감지 방법으로 선택하고 끝점을 읽기 유형으로 선택하여 새 프로토콜을 만든 다음 확인을 클릭하십시오. 그런 다음 읽기 단계를 추가합니다.선택한 파장을 입력하고 확인을 클릭합니다. 플레이트 레이아웃 섹션에서 읽을 웰을 표시하고 확인을 클릭 한 다음 읽기 플레이트를 클릭하고 값이 화면에 나타날 때까지 기다렸다가 스프레드 시트로 내보내 결과를 분석하고 원고에 설명 된대로 빼기를 사용하여 흡광도 값을 계산합니다. 통계 분석 소프트웨어에서 BZN의 농도 대 595 나노미터에서의 흡광도를 XY 표에 플로팅합니다.분석을 클릭하고 변환 옵션을 선택한 다음 확인을 클릭하여 BZN 농도를 로그 값으로 변환합니다. IC50 값을 얻으려면 분석을 클릭하고 XY 분석 목록에서 비선형 회귀 곡선 맞춤을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로, 매개 변수 창으로 이동하여 모델 탭에서 내장 방정식의 용량 반응 억제 그룹으로 이동하여 용량 반응 방법이 다른 모든 탭을 기본값으로 남겨 두면 로그 억제제 대 반응 변수 기울기를 매개 변수에 대해 선택한 다음 확인을 클릭하십시오.결과 섹션을 클릭하여 IC50 값, SD 및 적합도의 우수성을 찾습니다. 그래프 섹션을 클릭하여 약물의 로그 농도 대 흡광도 값의 XY 그래프를 찾고 곡선 맞춤도 다른 색상으로 그래프로 표시되는지 확인하십시오. 본 연구에서, epimastigottes에 대해 수득된 IC50 값은 이전 연구와 유사하게 대략 20 마이크로몰이었다.또한, 상기 결과는 시간에 따른 에피마스티고테스의 라이너 베타갈락토시다제 활성을 나타내었다. 최소한 테스트된 각 조건의 반복실험을 수행하고 볼륨 관리에서 오류를 최소화하는 것이 매우 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

빠른 한 단계 효소 합성 및 트레 할로 오스 유사체의 모든 수계 정화

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

연구

생화학

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

식물에 철 분 함량을 측정 하는 색도계 방법

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

F1의 절연-ATPase 기생 원생 생물 Trypanosoma brucei 에서

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

써모토가 마리티마 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

무작위 마이크로시드 매트릭스 스크리닝을 사용하여 I3C로 단백질 결정의 파생

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...