Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

Vi takker Dr. Buckner for vennlig å gi pLacZ plasmid. Dette arbeidet ble støttet av Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva fra Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) og Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art ble brukt til å produsere figur 1 (https://smart.servier.com).

MERK: En oversikt over hele det eksperimentelle designet er avbildet i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Figur 1: Oversikt over in vitro screeningsanalysen av Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ linje med CPRG som substrat for den kolorimetriske reaksjonen. Analysen består i å så parasittene (1), inkubere dem me...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+a+bug+and+a+hard+place:+Trypanosoma+cruzi+genetic+diversity+and+the+clinical+outcomes+of+Chagas+disease.">Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).</li><li>Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Chagas+disease.">The history of Chagas disease.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 317 (2014).</li><li>Viotti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+paradigm+shift+in+the+treatment+of+chronic+Chagas+disease.">Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).</li><li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas’+Disease.">Chagas’ Disease.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).</li><li>Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

Dette papiret beskriver en analyse basert på å bestemme cytoplasmatiske β-galaktosidaseaktivitet utgitt på grunn av membranlyse av T. cruzi epimastigoter, trypomastigoter eller infiserte celler med amastigoter i nærvær av substratet CPRG. Vi brukte T. cruzi Dm28c/pLacZ parasitter, en stabil parasittstamme oppnådd etter transfeksjon med et β-galaktosidase-bærende plasmid konstruert av Buckner og medforfattere10. Denne analysen har blitt brukt til å søke etter antitrypan...

Chagas sykdom (ChD), eller amerikansk trypanosomiasis, er en parasittisk sykdom forårsaket av flagellert protozo, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD begynner med en asymptomatisk eller oligosymptomatisk akutt fase som vanligvis er udiagnostisert, etterfulgt av en livslang kronisk fase. I kronisiteten manifesterer ~ 30% av pasientene - tiår etter infeksjonen - en rekke svekkende forhold, inkludert myokardiopati, mega-fordøyelsessyndromer, eller begge deler, med en dødelighet fra 0,2% til 20% 1,2,3. Asymptomatiske kroniske pasienter kan ikke ha noen kliniske tegn, men forblir seropositive gjennom hele livet.
Estimater tyder på at ~ 7 millioner mennesker er smittet over hele verden, hovedsakelig fra Latin-Amerika, hvor ChD er endemisk. I disse landene overføres T. cruzi hovedsakelig gjennom infiserte blodsugende triatominbugs (vektorbåren overføring) og sjeldnere ved oral overføring ved inntak av mat forurenset med triatomin avføring som inneholder parasittene2. I tillegg kan parasitten overføres via morkaken fra chagasiske mødre til nyfødte, gjennom blodtransfusjoner eller under organtransplantasjon. Disse vektoruavhengige måtene å skaffe seg infeksjonen og menneskelig migrasjon har bidratt til den verdensomspennende spredningen av sykdommen, dokumentert av et økende antall tilfeller i Nord-Amerika, Europa og noen afrikanske, østlige Middelhavet og vestlige Stillehavsland4. ChD regnes som en forsømt sykdom, da vektorbåren overføring er nært forbundet med fattigdom og er et ledende folkehelseproblem, spesielt i latinamerikanske lavinntektsland. Selv om det finnes tilgjengelige behandlinger, er dødeligheten på grunn av ChD i Latin-Amerika den høyeste blant parasittiske sykdommer, inkludert malaria2.
Det er to registrerte legemidler for ChD-behandling introdusert på slutten av 1960-tallet og begynnelsen av 1970-tallet: nifurtimox og benznidazol5. Begge legemidlene er effektive i den akutte fasen av sykdommen hos voksne, barn og medfødt infiserte nyfødte, så vel som hos barn med kronisk infeksjon, hvor kur vanligvis oppnås. Imidlertid blir bare noen få personer diagnostisert tidlig nok til å bli behandlet i tide. Ifølge de siste kliniske forsøkene har begge legemidlene viktige begrensninger hos voksne og var ineffektive for å redusere symptomer hos personer med kronisk sykdom; derfor er deres bruk i dette stadiet kontroversielt. Andre ulemper er de forlengede behandlingsperiodene som kreves (60-90 dager) og de hyppige, alvorlige bivirkningene som observeres, noe som fører til seponering av behandlingen hos en andel av smittede 6,7. Det anslås at færre enn 10% av personer med ChD har blitt diagnostisert, og enda færre har tilgang til behandling, da mange berørte individer bor i landlige områder med ingen eller knapp tilgang til helsetjenester8. Disse fakta fremhever det presserende behovet for å finne nye stoffer mot T. cruzi for å muliggjøre mer effektive, trygge og anvendelige behandlinger, spesielt for kronisk fase. I denne forbindelse er en annen utfordring i utviklingen av mer effektive forbindelser begrensningen av systemer for å vurdere legemiddeleffektivitet in vitro og in vivo9.
Selv om kjemisk biologi og genomiske tilnærminger for identifisering av potensielle legemiddelmål har blitt brukt i kinetoplastidparasitter, er de tilgjengelige genomiske verktøyene i T. cruzi begrenset i motsetning til T. brucei eller Leishmania. Dermed er screening av forbindelser med trypanocidal aktivitet fortsatt den mest brukte tilnærmingen i søket etter nye kjemoterapeutiske legemiddelkandidater mot ChD. Vanligvis må narkotikaoppdagelse i T. cruzi begynne med å teste effekten av et nytt stoff i en in vitro-analyse mot epimaskotstadiet. I flere tiår var den eneste måten å måle de hemmende effektene av kandidatforbindelser på T. cruzi manuell mikroskopisk telling, som er arbeidskrevende, tidkrevende og operatøravhengig. Videre er denne tilnærmingen egnet for å analysere et lite antall forbindelser, men er uakseptabelt for høy gjennomstrømningsscreening av store sammensatte biblioteker. I dag begynner mange undersøkelser med analysen av et stort antall forbindelser fra forskjellige opprinnelser som analyseres in vitro, og tester deres evne til å hemme parasittvekst. Både kolorimetriske og fluorometriske metoder er utviklet for å øke gjennomstrømningen i disse analysene, forbedre objektiviteten til screeningen og gjøre hele prosessen mindre kjedelig9.
En av de mest brukte kolorimetriske metodene er basert på den β-galaktosidaseaktiviteten til transfiserte parasitter først beskrevet av Bucknet og samarbeidspartnere10. Det β-galaktosidase-enzymet uttrykt av de rekombinante parasittene hydrolyserer det kromogene substratet, klorfenolrødt β-D-galactopyranoside (CPRG), til klorfenolrødt, som lett kan måles kolorimetrisk ved hjelp av et mikroplate-spektrofotometer. Dermed kan parasittvekst i nærvær av en rekke forbindelser samtidig evalueres og kvantifiseres i mikrotiterplater. Denne metoden har blitt brukt til å teste legemidler i epimaskigoteformer (tilstede i insektvektoren), trypomastigoter og intracellulære amastigoter, pattedyrstadiene av parasitten. Videre er flere rekombinante T. cruzi-stammer transfisert med pBS: CL-Neo-01 / BC-X-10 plasmid (pLacZ) 10 for å uttrykke Escherichia coli-β-galaktosidase-enzymet allerede tilgjengelige (og nye kan konstrueres), noe som gjør det mulig å evaluere parasitter fra forskjellige diskrete skriveenheter (DTU) som kanskje ikke oppfører seg likt mot de samme forbindelsene 10,11,12,13 . Denne metoden har allerede blitt brukt til å evaluere forbindelser for aktivitet mot T. cruzi i lav- og høy gjennomstrømningsscreening12,13. Lignende tilnærminger har også blitt brukt i andre protozoa parasitter, inkludert Toxoplasma gondii og Leishmania mexicana14,15.
Denne artikkelen beskriver og viser en detaljert metode for en in vitro medikamentell screening mot alle livssyklusstadier av T. cruzi ved bruk av parasitter som uttrykker β-galaktosidase. Analysene som presenteres her er utført med en β-galaktosidase-uttrykkende T. cruzi-linje oppnådd ved transfeksjon av T. cruzi Dm28c-stamme fra DTU I13 med pLacZ-plasmid (Dm28c/pLacZ). I tillegg kan den samme protokollen lett tilpasses andre stammer for å sammenligne ytelsen mellom forbindelser og mellom T. cruzi-stammer eller DTU-er.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi er årsaksmidlet til Chagas sykdom (ChD), en endemisk sykdom av folkehelse betydning i Latin-Amerika som også påvirker mange ikke-endemiske land på grunn av økningen i migrasjon. Denne sykdommen rammer nesten 8 millioner mennesker, med nye tilfeller anslått til 50 000 per år. På 1960- og 70-tallet ble to legemidler for ChD-behandling introdusert: nifurtimox og benznidazol (BZN). Begge er effektive hos nyfødte og i den akutte fasen av sykdommen, men ikke i kronisk fase, og deres bruk er forbundet med viktige bivirkninger. Disse fakta understreker det presserende behovet for å intensivere søket etter nye stoffer mot T. cruzi.
T. cruzi overføres gjennom hematofagøse insektvektorer av familiene Reduviidae og Hemiptera. En gang i pattedyrverten multipliserer den intracellulært som den ikke-flagellerte amastigotformen og skiller seg ut i trypomastigoten, blodets ikke-replikative infeksjonsform. Inne i insektvektoren forvandles trypomastigoter til epimaskigotstadiet og formerer seg gjennom binær fisjon.
Dette papiret beskriver en analyse basert på måling av aktiviteten til cytoplasmatisk β-galaktosidase som slippes ut i kulturen på grunn av parasitter lysis ved bruk av substratet, klorfenolrødt β-D-galactopyranoside (CPRG). For dette ble T. cruzi Dm28c-stammen transfisert med en β-galaktosidase-overuttrykkende plasmid og brukt til in vitro farmakologisk screening i epimaskigot-, trypomastigot- og amastigotstadier. Dette papiret beskriver også hvordan man måler den enzymatiske aktiviteten i dyrkede epimastigoter, infiserte Vero-celler med amastigoter og trypomastigoter frigjort fra de dyrkede cellene ved hjelp av referansemedikamentet benznidazol, som et eksempel. Denne kolorimetriske analysen utføres enkelt og kan skaleres til et høyt gjennomstrømningsformat og påføres andre T. cruzi-stammer .

Etter protokollen beskrevet ovenfor ble β-galaktosidase-uttrykkende Dm28c epimastigoter inkubert med 6 konsentrasjoner av BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (eller forbindelser av interesse) i 72 timer. Etter denne perioden ble CPRG-reagens tilsatt sammen med vaskemiddel, som lyser cellene og frigjør β-galaktosidase. HLRG spaltes av β-galaktosidase for å produsere klorfenolrødt, noe som fører til endring i farge fra gul til rødlig (figur 2A). Klorfenolrødt ble målt ved å lese absorb...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

Vi beskriver en kolorimetrisk analyse med høy gjennomstrømning som måler β-galaktosidaseaktivitet i tre livssyklusstadier av Trypanosoma cruzi, det forårsakende middelet til Chagas sykdom. Denne analysen kan brukes til å identifisere trypanocidalforbindelser på en enkel, rask og reproduserbar måte.

In vitro Narkotika screening mot alle livssyklus stadier av Trypanosoma cruzi Bruke parasitter Uttrykke β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Denne protokollen beskriver en kolorimetrisk analyse med høy gjennomstrømning i de tre livssyklusstadiene av Trypanosoma cruzi for å identifisere nye legemiddelkandidater for Chagas sykdom. Dette kan brukes til å identifisere trypanocidalforbindelser på en enkel, rask og reproduserbar måte. Demonstrere prosedyren vil være Romina Manarin, en lab celle kultur tekniker fra laboratoriet i Pamela krybbe.Begynn med å dyrke beta galaktosidase som uttrykker Trypanosoma cruzi epimastigoter i en T-25 vevskulturkolbe og inkubere ved 28 grader Celsius for å dyrke dem aksenisk. Ved hjelp av et Neubauer-kammer kvantifiserer du parasittvekst før subkulturering. For å opprettholde kulturene i en loggfase, subkultur hver 48 til 72 timer i fem milliliter LIT-medium supplert med 10% FCS og genetisk i sulfat ved en endelig konsentrasjon på 200 mikrogram per milliliter.Lukk deretter hetten sikkert før den inkuberes ved 28 grader Celsius i vertikal stilling. Fra loggfasekulturen gjør du en suspensjon av epimaskitiot i LIT-medium supplert med genetisk og sulfat ved den endelige konsentrasjonen på 200.000 celler per milliliter epimastigot per milliliter. Etter å ha dispensert 100 mikroliter suspensjon per brønn på en 96 brønnplate, sminke det endelige volumet på brønn 200 mikroliter med medium.Gjør Vero-cellesuspensjonen i DMEM supplert med 2% FCS ved den endelige konsentrasjonen på 100.000 celler per milliliter. Frø 100 mikroliter av suspensjonen per brønn i en 96 brønnvevskulturplate. Inkuber cellene over natten for overholdelse og neste dag, observer cellene under mikroskopet.Neste dag, skyll Vero-cellemonolaget tre ganger med 100 mikroliter steril PBS. Legg til tidligere oppnådde metasykliske trypomastigoter. Legg til et mangfold av infeksjon eller MOI på 10-1 i 100 mikroliter DMEM supplert med 2% FCS per brønn og inkubere i seks timer som vist tidligere.På slutten av inkubasjonen vasker du platen to ganger med PBS og tilsett 100 mikroliter DMEM uten fenolrødt supplert med 2% FCS. Etter å ha gjort Vero-cellene suspensjon i DMEM, legg til den endelige konsentrasjonen på 1 million celler per milliliter. Frø 800.000 celler i fem milliliter av mediet i T-25 kolber og inkubere over natten for celletilslutning.Når kolben er skyllet med PBS, tilsett trypomastigoter, tilsett en MOI på 10-1 i fem milliliter DMEM supplert med 2% FCS og inkuber over natten som vist tidligere. På slutten av inkubasjonen, vask kolben to ganger med PBS. Legg til fem milliliter fersk DMEM supplert med 2% FCS og inkubere i fire dager.På slutten av inkubasjonen, etter å ha observert supernatanten for trypomastigotes tilstedeværelse under et optisk mikroskop. Kvantifiser trypomastigotene ved hjelp av et Neubauer-kammer. Samle supernatanten i et 15 milliliter rør og sentrifuge ved 7.000 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur.Kast deretter supernatanten og resuspender pelleten i DMEM uten fenolrødt supplert med 2% FCS for å oppnå en konsentrasjon på 1 million trypomastigoter per milliliter. Frø 100 mikroliter av trypomastigote suspensjonen per brønn i en 96 brønnplate. Tilsett benznidazoloppløsning til epimastigoter, Vero-celler med amastigoter eller trypomastigoter som beskrevet i tekstmanuskriptet.Inkuber deretter epimastigotene, sett 28 grader Celsius i 72 timer og trypomastigotene eller infiserte Vero-cellene med amastigoter i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. For den kolorimetriske analysen, sett opp de tomme brønnene ved å legge til 100 mikroliter PBS eller tilsvarende medium. Deretter tilsettes 40 mikroliter HLRG-substratløsning og 10 mikroliter av vaskemiddeloppløsningen til hver brønn for å oppnå en endelig konsentrasjon på 200 mikromolar CPRG og 0,1% vaskemiddel i et endelig volum på 250 mikroliter i hver brønn.Etter inkubering, ved 37 grader Celsius i to timer, måler absorbans ved 595 nanometer ved hjelp av et mikroplate-spektrofotometer. Opprett en ny protokoll i programvaren ved å velge absorbans som deteksjonsmetode og sluttpunkt som lesetype, og klikk deretter ok. Deretter legger du til et lesetrinn.Skriv inn den valgte bølgelengden og klikk OK. I plateoppsettseksjonen markerer du brønnene som skal leses, klikker ok og klikker på leseplaten, venter på at verdiene skal vises på skjermen og eksporterer dem til et regneark for å analysere resultatene og beregne absorbansverdiene ved hjelp av subtraksjon som beskrevet i manuskriptet. I statistisk analyseprogramvare plotter du konsentrasjonen av BZN versus absorbansen ved 595 nanometer i XY-tabellen.Transformer BZN-konsentrasjonene til logaritmiske verdier ved å klikke analyser, velge transformeringsalternativet og klikke OK. Hvis du vil hente IC50-verdier, klikker du analyser, velger ikke-lineær regresjonskurvetilpasning fra XY-analyselisten, og deretter klikker du OK. Gå deretter til parametervinduet, i modellfanen, gå til doseresponshemmingsgruppen av innebygde ligninger, velg logghemmer versus responsvariabelhelling for parametere som doseresponsmetoden, la alle andre faner ha standardverdier og klikk deretter, ok.Klikk på resultatdelen for å finne IC50-verdien, SD-en og passformens godhet. Klikk på grafdelen for å finne XY-grafen over den logaritmiske konsentrasjonen av stoffet kontra absorbansverdiene, og sørg for at kurvetilpasningen også er tegnet i en annen farge. I denne studien var IC50-verdien oppnådd for epimastigoter ca. 20 mikromolar, lik tidligere studier.I tillegg indikerte resultatene liner beta galaktosidaseaktivitet av epimastigotene over tid. Det er svært viktig å utføre minst replikasjoner av hver tilstand som testes og minimeres feil i volumstyring.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rapid Ett-trinns Enzymatisk Syntese og All-vandig Rensing av Trehalose analoger

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifisering av Hypopigmentation aktivitet i Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolering av F-1-ATPase fra den parasittiske Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga Maritima membran bundne Pyrophosphatase hemmere

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening for fytoøstrogener ved hjelp av en cellebasert østrogenreseptor β Reporter Analyse

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatisering av proteinkrystaller med I3C ved hjelp av tilfeldig mikroseede matrix screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...