Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Agradecemos ao Dr. Buckner por gentilmente fornecer o plasmídeo pLacZ. Este trabalho contou com o apoio da Agência Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva da Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) e Conselho de Pesquisa Reino Unido [MR/P027989/1]. Servier Medical Art foi usado para produzir figura 1 (https://smart.servier.com).

NOTA: Uma visão geral de todo o design experimental é retratada na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do ensaio de triagem in vitro da linha Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ usando CPRG como substrato para a reação colorimétrica. O ensaio consiste em semear os parasitas (1), incuba-lo...

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

Este artigo descreve um ensaio baseado na determinação da atividade citoplasmática β-galactosidase liberada devido à lise de membrana de epimastigotes T. cruzi, trippomastigotes ou células infectadas com amastigotes na presença do substrato CPRG. Utilizamos parasitas T. cruzi Dm28c/pLacZ, uma cepa de parasita estável obtida após a transfecção com um plasmídeo de β-galactosidase construído por Buckner e coautores10. Este ensaio tem sido usado para procurar compostos ...

A doença de Chagas (CHD), ou trippanosomiase americana, é uma doença parasitária causada pelo protozoário flagelado, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). A CD começa com uma fase aguda assintomática ou oligossintomática que geralmente não é diagnosticada, seguida de uma fase crônica ao longo da vida. Na cronidade, ~30% dos pacientes se manifestam décadas após a infecção - uma variedade de condições debilitantes, incluindo miocardiopatia, síndromes mega-digestivas, ou ambos, com uma taxa de mortalidade variando de 0,2% a 20%1,2,3. Pacientes crônicos assintomáticos podem não ter sinais clínicos, mas permanecem soropositivos ao longo de sua vida.
Estimativas sugerem que ~7 milhões de pessoas estão infectadas em todo o mundo, principalmente da América Latina, onde o ChD é endêmico. Nesses países, t. cruzi é transmitido principalmente através de insetos de triatomina sugadores de sangue infectados (transmissão transmitida por vetores) e menos frequentemente pela transmissão oral através da ingestão de alimentos contaminados com fezes de triatomina contendo os parasitas2. Além disso, o parasita pode ser transmitido através da placenta de mães chagásicas para recém-nascidos, através de transfusões de sangue, ou durante o transplante de órgãos. Essas formas independentes de adquirir a infecção e a migração humana contribuíram para a disseminação mundial da doença, evidenciada por um número crescente de casos na América do Norte, Europa e alguns países africanos, do Mediterrâneo Oriental e do Pacífico Ocidental4. A ACS é considerada uma doença negligenciada, pois a transmissão transmitida por vetores está intimamente associada à pobreza e é um dos principais problemas de saúde pública, especialmente nos países latino-americanos de baixa renda. Embora existam tratamentos disponíveis, a mortalidade por AC Na América Latina é a mais alta entre as doenças parasitárias, incluindo a malária2.
Existem dois medicamentos registrados para o tratamento de ChD introduzidos no final da década de 1960 e início da década de 1970: nifurtimox e benznidazol5. Ambas as drogas são eficazes na fase aguda da doença em adultos, crianças e recém-nascidos infectados congênitas, bem como em crianças com infecção crônica, onde a cura é geralmente alcançada. No entanto, apenas algumas pessoas são diagnosticadas precocemente o suficiente para serem tratadas a tempo. De acordo com os últimos ensaios clínicos, ambos os fármacos têm limitações importantes em adultos e foram ineficazes na redução de sintomas em pessoas com doença crônica; portanto, seu uso nesta fase é controverso. Outras desvantagens são os períodos prolongados de tratamento exigidos (60-90 dias) e os efeitos adversos frequentes e graves observados, que levam à interrupção da terapia em proporção de pessoas infectadas 6,7. Estima-se que menos de 10% das pessoas com ACS foram diagnosticadas, e ainda menos têm acesso ao tratamento, já que muitos indivíduos afetados vivem em áreas rurais sem acesso ou pouco acesso à saúde8. Esses fatos destacam a necessidade urgente de encontrar novas drogas contra t. cruzi para permitir tratamentos mais eficientes, seguros e aplicáveis ao campo, especialmente para a fase crônica. Nesse sentido, outro desafio no desenvolvimento de compostos mais eficazes é a limitação de sistemas para avaliação da eficácia da droga in vitro e in vivo9.
Embora a biologia química e abordagens genômicas para a identificação de potenciais alvos de drogas tenham sido usadas em parasitas cinetoplastídeos, as ferramentas genômicas disponíveis em T. cruzi são limitadas em contraste com T. brucei ou Leishmania. Assim, a triagem de compostos com atividade tripanocida ainda é a abordagem mais utilizada na busca de novos candidatos a drogas quimioterápicas contra ChD. Geralmente, a descoberta de drogas em T. cruzi deve começar com o teste dos efeitos de uma nova droga em um ensaio in vitro contra a fase de epimastigote. Durante décadas, a única maneira de medir os efeitos inibitórios dos compostos candidatos em T. cruzi foi a contagem microscópica manual, que é trabalhosa, demorada e dependente do operador. Além disso, essa abordagem é adequada para avaliar um pequeno número de compostos, mas é inaceitável para a triagem de alto rendimento de grandes bibliotecas compostas. Hoje em dia, muitas investigações começam com a análise de um grande número de compostos de diferentes origens que são avaliados in vitro, testando sua capacidade de inibir o crescimento de parasitas. Tanto métodos colorimétricos quanto fluorométricos foram desenvolvidos para aumentar o rendimento nesses ensaios, melhorando a objetividade da triagem e tornando todo o processo menos tedioso9.
Um dos métodos colorimétricos mais utilizados é baseado na atividade β-galactosidase de parasitas transfeinados descritos pela primeira vez por Bucknet e colaboradores10. A enzima β-galactosidase expressa pelos parasitas recombinantes hidrolisa o substrato cromogênico, clorofenol vermelho β-D-galactopyranoside (CPRG), para o vermelho clorofenol, que pode ser facilmente medido colorimetricamente usando um espectógrafo microplato. Assim, o crescimento de parasitas na presença de uma variedade de compostos pode ser avaliado simultaneamente e quantitado em placas de microtátrica. Este método tem sido aplicado para testar drogas em formas de epimastigote (presentes no vetor de insetos), tripulações e amastigotes intracelulares, os estágios mamíferos do parasita. Além disso, vários T recombinante. cepas cruzi transfectadas com a enzima pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 plasmid (pLacZ)10 para expressar a enzima Escherichia coli β-galactosidase já estão disponíveis (e novos podem ser construídos), o que permite a avaliação de parasitas de diferentes unidades de digitação discretas (DTUs) que podem não se comportar igualmente em direção aos mesmos compostos 10,11,12,13 . Este método já foi utilizado com sucesso para avaliar compostos para atividade contra T. cruzi na triagem de baixo e alto rendimento12,13. Abordagens semelhantes também têm sido usadas em outros parasitas protozoários, incluindo Toxoplasma gondii e Leishmania mexicana14,15.
Este artigo descreve e mostra um método detalhado para uma triagem in vitro de drogas contra todas as etapas do ciclo de vida de T. cruzi usando parasitas expressando β-galactosidase. Os ensaios aqui apresentados foram realizados com uma linha T. cruzi expressa β-galactosidase obtida pela transfecção da cepa T. cruzi Dm28c da DTU I13 com plasmid pLacZ (Dm28c/pLacZ). Além disso, o mesmo protocolo poderia ser facilmente adaptado a outras cepas para comparar o desempenho entre compostos e entre cepas de T. cruzi ou DTUs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas (ACS), uma doença endêmica de importância da saúde pública na América Latina que também afeta muitos países não endêmicas devido ao aumento da migração. Essa doença afeta cerca de 8 milhões de pessoas, com novos casos estimados em 50.000 por ano. Nas décadas de 1960 e 1970, foram introduzidos dois medicamentos para tratamento de ChD: nifurtimox e benznidazol (BZN). Ambos são eficazes em recém-nascidos e durante a fase aguda da doença, mas não na fase crônica, e seu uso está associado a efeitos colaterais importantes. Esses fatos ressaltam a necessidade urgente de intensificar a busca por novas drogas contra T. cruzi.
T. cruzi é transmitido através de vetores de insetos hematófagos das famílias Reduviidae e Hemiptera. Uma vez no hospedeiro mamífero, multiplica-se intracelularmente como a forma amastigote não sinalizada e se diferencia no trippomastigote, a corrente sanguínea não-replicativa forma infecciosa. Dentro do vetor de insetos, os tripuladores se transformam no estágio de epimastigote e se multiplicam através da fissão binária.
Este artigo descreve um ensaio baseado na medição da atividade do β-galactosidase citoplasmático lançado na cultura devido à lise de parasitas usando o substrato, clorofenol vermelho β-D-galactopyranoside (CPRG). Para isso, a cepa T. cruzi Dm28c foi transfeinada com um plasmídeo de β-galactosidase-sobreexpresso e usado para triagem farmacológica in vitro em estágios de epimastigote, tripomastigote e amastigote. Este artigo também descreve como medir a atividade enzimática em epimastigotes cultivados, células Vero infectadas com amastigotes, e tripulações liberadas das células cultivadas usando a droga de referência, benznidazol, como exemplo. Este ensaio colorimétrico é facilmente executado e pode ser dimensionado para um formato de alto rendimento e aplicado a outras cepas T. cruzi .

Seguindo o protocolo descrito acima, os epimastigotes Dm28c expressos β-galactose foram incubados com 6 concentrações de BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (ou compostos de interesse) por 72 h. Após esse período, foi adicionado reagente CPRG junto com detergente, que lise as células e libera β-galactosidase. CPRG é cortado pelo β-galactosidase para produzir clorofenol vermelho, levando a uma mudança de cor de amarelo para avermelhado (Figura 2A). O vermelho clorofenol foi medido pela...

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In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

Descrevemos um ensaio colorimétrico de alta produtividade medindo β-galactosidase atividade em três estágios do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. Este ensaio pode ser usado para identificar compostos trypanocidas de forma fácil, rápida e reprodutível.

In vitro Triagem de drogas contra todas as etapas do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi usando parasitas expressando β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Este protocolo descreve um alto rendimento de assimetria colorimétrica nas três etapas do ciclo de vida do Trypanosoma cruzi para identificar novos candidatos à doença de Chagas. Isso pode ser usado para identificar compostos trypanocidas de forma fácil, rápida e reprodutível. O procedimento será Romina Manarin, técnica de cultura celular de laboratório do laboratório de Pamela Crib.Comece cultivando beta galactosidase expressando epimastigotes Trypanosoma cruzi em um frasco de cultura tecidual T-25 e incubar a 28 graus Celsius para cultingá-los axenicamente. Usando uma câmara de Neubauer, quantifique o crescimento dos parasitas antes de subculturar. Para a manutenção das culturas em fase de registro, a subcultura a cada 48 a 72 horas em cinco mililitros de meio LIT complementado com 10% de FCS e geneticina em sulfato em uma concentração final de 200 microgramas por mililitros.Em seguida, feche firmemente a tampa antes de incubar a 28 graus Celsius em uma posição vertical. A partir da cultura da fase de registro, faça uma suspensão de epimastigote em meio LIT suplementado com geneticina e sulfato na concentração final de 200.000 células por epimastigote mililitro por mililitro. Depois de dispensar 100 microliters de suspensão por poço de uma placa de 96 poços, maquiagem volume final de bem 200 microliters com médio.Faça a suspensão da célula Vero em DMEM suplementada com 2% de FCS na concentração final de 100.000 células por mililitro. Semente 100 microliters da suspensão por poço em uma placa de cultura de tecido de 96 poços. Incubar as células durante a noite para adesão e, no dia seguinte, observar as células sob o microscópio.No dia seguinte, enxágue a monocamada celular Vero três vezes com 100 microliters de PBS estéreis. Adicione tripolas metacíclicas obtidas anteriormente. Adicione uma multiplicidade de infecção ou MOI de 10-1 em 100 microliters de DMEM suplementados com 2% de FCS por poço e incubar por seis horas, como demonstrado anteriormente.No final da incubação, lave a placa duas vezes com PBS e adicione 100 microliters de DMEM sem fenol vermelho complementado com 2% de FCS. Depois de fazer a suspensão das células Vero no DMEM adicionar a concentração final de 1 milhão de células por mililitro. Sementes 800.000 células em cinco mililitros do meio em frascos T-25 e incubar durante a noite para a adesão celular.Uma vez que o frasco é enxaguado com PBS, adicione tripmonstigotes, adicione um MOI de 10-1 em cinco mililitros de DMEM complementados com 2% DE FCS e incubar durante a noite como demonstrado anteriormente. No final da incubação, lave o frasco duas vezes com PBS. Adicione cinco mililitros de DMEM fresco suplementado com 2% de FCS e incubar por quatro dias.No final da incubação, depois de observar o supernatante para trippomastigotes presença sob um microscópio óptico. Quantifique os trypomastigotes usando uma câmara de Neubauer. Colete o supernatante em um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 7.000 vezes G durante 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, descarte o supernasce e resuspenque a pelota em DMEM sem fenol vermelho complementado com 2% de FCS para obter uma concentração de 1 milhão de tripmonotes por mililitro. Semente 100 microliters da suspensão trypomastigote por poço em uma placa de 96 poços. Adicione solução de benznidazol a epimastigotes, células Vero com amastigotes, ou tripulações como descrito no manuscrito do texto.Em seguida, incubar os epimastigotes, definir 28 graus Celsius por 72 horas e os tripulações ou células Vero infectadas com amastigotes por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. Para o ensaio coloridométrico, configure os poços em branco adicionando 100 microliters de PBS ou meio correspondente. Em seguida, adicione 40 microliters de solução de substrato CPRG e 10 microliters da solução detergente para cada poço para obter uma concentração final de 200 CPRG micromolar e 0,1% detergente em um volume final de 250 microliters em cada poço.Após a incubação, a 37 graus Celsius por duas horas, meça a absorvência em 595 nanômetros usando um espectrômetro de microplato. No software, crie um novo protocolo selecionando a absorvância como método de detecção e ponto final como o tipo de leitura e clique em ok. Em seguida, adicione um passo de leitura.Digite o comprimento de onda selecionado e clique em ok. Na seção de layout da placa marque os poços a serem lidos, clique bem e clique na placa de leitura, aguarde que os valores apareçam na tela e exporte-os para uma planilha para analisar os resultados e calcular os valores de absorção usando subtração conforme descrito no manuscrito. Em software de análise estatística, plote a concentração de BZN versus a absorvância em 595 nanômetros na tabela XY.Transforme as concentrações do BZN em valores logarítmicos clicando em analisar, selecionando a opção transformar e clicando bem. Para obter valores IC50, clique em analisar e, a partir da lista de análise XY, selecione ajuste de curva de regressão não linear e clique em ok. Em seguida, vá para a janela de parâmetros, na guia modelo, vá para o grupo de inibição de resposta de dose de equações incorporadas, selecione inibidor de log versus inclinação variável de resposta para parâmetros como o método de resposta da dose deixar todas as outras guias em valores padrão e, em seguida, clique, ok.Clique na seção resultados para encontrar o valor IC50, o SD e a bondade do ajuste. Clique na seção gráfico para encontrar o gráfico XY da concentração logarítmica da droga versus os valores de absorção e certifique-se de que o ajuste da curva também seja grafado em uma cor diferente. No presente estudo, o valor ic50 obtido para epimastigotes foi de aproximadamente 20 micromolar, semelhante aos estudos anteriores.Além disso, os resultados indicaram a atividade beta do liner dos epimastigotes ao longo do tempo. É muito importante realizar pelo menos réplicas de cada condição testada e erros minimizados no gerenciamento de volumes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rápida em uma etapa enzimática Síntese e All-aquosa Purificação da trealose Análogos

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Bioquímica

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolamento de F1-ATPase do Protista parasita Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Usando o índice elevado de imagem para quantificar o destino noivado em células aderentes

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatização de Cristais de Proteína com I3C usando Triagem de Matriz Microseada Aleatória

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...