Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

Мы благодарим доктора Бакнера за любезное предоставление плазмиды pLacZ. Эта работа была поддержана Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva из Аргентины (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) и Исследовательским советом Соединенного Королевства [MR/P027989/1]. Медицинское искусство Сервье было использовано для создания рисунка 1 (https://smart.servier.com).

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор всего экспериментального проекта показан на рисунке 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Рисунок 1: Обзор скринингового анализа in vitro линии Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ с использованием CPRG в...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+a+bug+and+a+hard+place:+Trypanosoma+cruzi+genetic+diversity+and+the+clinical+outcomes+of+Chagas+disease.">Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).</li><li>Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Chagas+disease.">The history of Chagas disease.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 317 (2014).</li><li>Viotti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+paradigm+shift+in+the+treatment+of+chronic+Chagas+disease.">Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).</li><li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas’+Disease.">Chagas’ Disease.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).</li><li>Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

В данной работе описан анализ, основанный на определении активности цитоплазматической β-галактозидазы, высвобождаемой в результате мембранного лизиса T. cruzi epimastigotes, трипомастиготов или инфицированных клеток амастиготами в присутствии субстрата CPRG. Мы использовали паразитов T...

Болезнь Шагаса (ChD), или американский трипаносомоз, является паразитарным заболеванием, вызванным жгутиковым простейшим, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ИБС начинается с бессимптомной или олигосимптомной острой фазы, которая обычно не диагностируется, за которой следует пожизненная хроническая фаза. При хроничности ~ 30% пациентов проявляются через десятилетия после заражения различные изнурительные состояния, включая миокардиопатию, мега-пищеварительные синдромы или и то, и другое, с коэффициентом смертности от 0,2% до 20%1,2,3. Бессимптомные хронические пациенты могут не иметь клинических признаков, но оставаться серопозитивными на протяжении всей своей жизни.
Оценки показывают, что ~ 7 миллионов человек инфицированы во всем мире, в основном из Латинской Америки, где ИБС является эндемичным. В этих странах T. cruzi в основном передается через инфицированных кровососущих триатоминовых насекомых (трансмиссивная передача) и реже перорально через прием пищи, загрязненной триатоминовыми фекалиями, содержащими паразитов2. Кроме того, паразит может передаваться через плаценту от чагасических матерей новорожденным, через переливание крови или во время трансплантации органов. Эти независимые от переносчиков способы заражения инфекцией и миграции людей способствовали всемирному распространению болезни, о чем свидетельствует увеличение числа случаев заболевания в Северной Америке, Европе и некоторых странах Африки, Восточного Средиземноморья и Западной части Тихогоокеана4. ИБС считается забытой болезнью, поскольку трансмиссивная передача тесно связана с нищетой и является ведущей проблемой общественного здравоохранения, особенно в странах Латинской Америки с низким уровнем дохода. Несмотря на наличие доступных методов лечения, смертность от ИБС в Латинской Америке является самой высокой среди паразитарных заболеваний, включая малярию2.
Существует два зарегистрированных препарата для лечения ИБС, введенных в конце 1960-х и начале 1970-х годов: нифуртимокс и бензнидазол5. Оба препарата эффективны в острой фазе заболевания у взрослых, детей и врожденно инфицированных новорожденных, а также у детей с хронической инфекцией, где обычно достигается излечение. Тем не менее, только несколько человек диагностируются достаточно рано, чтобы вовремя лечиться. Согласно последним клиническим испытаниям, оба препарата имеют важные ограничения у взрослых и были неэффективны в уменьшении симптомов у людей с хроническими заболеваниями; следовательно, их использование на данном этапе является спорным. Другими недостатками являются длительные сроки лечения (60-90 дней) и наблюдаемые частые, тяжелые побочные эффекты, которые приводят к прекращению терапии у доли инфицированных людей 6,7. По оценкам, менее 10% людей с ИБС были диагностированы, и еще меньше людей имеют доступ к лечению, поскольку многие пострадавшие люди живут в сельских районах без или с ограниченным доступом к здравоохранению8. Эти факты подчеркивают настоятельную необходимость поиска новых лекарств против T. cruzi, чтобы обеспечить более эффективные, безопасные и применимые к полевым методам лечения, особенно для хронической фазы. В связи с этим еще одной проблемой в разработке более эффективных соединений является ограничение систем оценки эффективности препарата in vitro и in vivo9.
Хотя химическая биология и геномные подходы для идентификации потенциальных мишеней лекарств использовались у кинетопластидных паразитов, доступные геномные инструменты у T. cruzi ограничены в отличие от T. brucei или Leishmania. Таким образом, скрининг соединений с трипаноцидной активностью по-прежнему является наиболее используемым подходом в поиске новых химиотерапевтических препаратов-кандидатов против ИПК. Обычно открытие препарата у T. cruzi должно начинаться с тестирования эффектов нового препарата в анализе in vitro против стадии эпимастигота. В течение десятилетий единственным способом измерения ингибирующего воздействия соединений-кандидатов на T. cruzi был ручной микроскопический подсчет, который является трудоемким, трудоемким и зависящим от оператора. Кроме того, этот подход подходит для анализа небольшого количества соединений, но неприемлем для высокопроизводительного скрининга больших библиотек соединений. В настоящее время многие исследования начинаются с анализа огромного количества соединений различного происхождения, которые анализируются in vitro, проверяя их способность ингибировать рост паразитов. Как колориметрические, так и флуорометрические методы были разработаны для увеличения пропускной способности в этих анализах, повышения объективности скрининга и делая весь процесс менее утомительным9.
Один из наиболее широко используемых колориметрических методов основан на β-галактозидазной активности трансфекторазных паразитов, впервые описанной Бакнетом и соавторами10. Фермент β-галактозидазы, экспрессируемый рекомбинантными паразитами, гидролизует хромогенный субстрат, хлорфенол красный β-D-галактопиранозид (CPRG), до хлорфенол-красного, который можно легко измерить колориметрически с помощью микропластичного спектрофотометра. Таким образом, рост паразитов в присутствии различных соединений может быть одновременно оценен и количественно определен в микротитрных пластинах. Этот метод был применен для тестирования лекарств в формах эпимастигот (присутствующих в насекомом переносчике), трипомастиготах и внутриклеточных амастиготах, стадиях млекопитающих паразита. Кроме того, несколько рекомбинантных штаммов T. cruzi, трансфектированных плазмидой pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 для экспрессии фермента Escherichia coli β-галактозидазы, уже доступны (и могут быть построены новые), что позволяет оценивать паразитов из разных дискретных типографских единиц (DTU), которые могут не вести себя одинаково по отношению к одним и тем же соединениям 10,11,12,13 . Этот метод уже успешно использовался для оценки активности соединений в отношении T. cruzi при низко- и высокопроизводительном скрининге12,13. Аналогичные подходы также использовались у других простейших паразитов, включая Toxoplasma gondii и Leishmania mexicana14,15.
В этой статье описан и показан подробный метод скрининга препарата in vitro против всех стадий жизненного цикла T. cruzi с использованием паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу. Представленные здесь анализы были выполнены с β-галактозидазой-экспрессирующей линией T. cruzi , полученной путем трансфекции штамма T. cruzi Dm28c из DTU I13 с плазмидой pLacZ (Dm28c/pLacZ). Кроме того, тот же протокол может быть легко адаптирован к другим штаммам для сравнения производительности между соединениями и между штаммами T. cruzi или DTU.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi является возбудителем болезни Шагаса (ИБС), эндемического заболевания, имеющего значение для общественного здравоохранения в Латинской Америке, которое также поражает многие неэндемические страны из-за увеличения миграции. Это заболевание поражает почти 8 миллионов человек, причем новые случаи оцениваются в 50 000 в год. В 1960-х и 70-х годах были введены два препарата для лечения ИБС: нифуртимокс и бензнидазол (БЗН). Оба эффективны у новорожденных и во время острой фазы заболевания, но не в хронической фазе, и их использование связано с важными побочными эффектами. Эти факты подчеркивают настоятельную необходимость активизации поиска новых препаратов против T. cruzi.
T. cruzi передается через гематофаговых насекомых-переносчиков семейств Reduviidae и Hemiptera. Попав в хозяина млекопитающих, он размножается внутриклеточным образом как небигеллированная амастиготная форма и дифференцируется в трипомастигот, нерепликативную инфекционную форму кровотока. Внутри насекомого-переносчика трипомастиготы превращаются в стадию эпимастигота и размножаются посредством бинарного деления.
В данной работе описан анализ, основанный на измерении активности цитоплазматической β-галактозидазы, высвобождаемой в культуру вследствие лизиса паразитов с использованием субстрата хлорфенола красного β-D-галактопиранозида (CPRG). Для этого штамм T. cruzi Dm28c трансфектировался β-галактозидазой-сверхэкспрессирующей плазмидой и использовался для фармакологического скрининга in vitro на стадиях эпимастигота, трипомастигота и амастигота. В этой статье также описывается, как измерить ферментативную активность в культивируемых эпимастиготах, инфицированных клетках Vero амастиготами и трипомастиготах, высвобождаемых из культивируемых клеток, используя в качестве примера референтный препарат бензнидазол. Этот колориметрический анализ легко выполняется и может быть масштабирован до высокопроизводительного формата и применен к другим штаммам T. cruzi .

Следуя описанному выше протоколу, β-галактозидазо-экспрессирующие Dm28c эпимастиготы инкубировали с 6 концентрациями BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 мкМ) (или представляющих интерес соединений) в течение 72 ч. По истечении этого периода вместе с моющим средством добавляли реагент CPRG, который лизирует кле?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

Описан высокопроизводительный колориметрический анализ, измеряющий активность β-галактозидазы на трех стадиях жизненного цикла Trypanosoma cruzi, возбудителя болезни Шагаса. Этот анализ может быть использован для идентификации трипаноцидных соединений простым, быстрым и воспроизводимым способом.

В пробирке Медикаментозный скрининг на всех стадиях жизненного цикла Trypanosoma cruzi с использованием паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Этот протокол описывает высокопроизводительный колориметрический анализ на трех этапах жизненного цикла Trypanosoma cruzi для выявления новых кандидатов на лекарства для болезни Шагаса. Это может быть использовано для идентификации трипаноцидных соединений простым, быстрым и воспроизводимым способом. Продемонстрировать процедуру будет Ромина Манарин, техник по лабораторным клеточным культурам из лаборатории колыбелы Памелы.Начинают с культивирования бета-галактозидазы, экспрессирующей Trypanosoma cruzi epimastigotes в колбе культуры ткани Т-25 и инкубируют при 28 градусах Цельсия для выращивания их аксенически. Используя камеру Нойбауэра, количественно оцените рост паразита перед субкультурой. Для поддержания культур в логарифмической фазе субкультуру каждые 48 - 72 часа в пяти миллилитрах ЛИТ среды дополняют 10% FCS и генетикином в сульфате в конечной концентрации 200 мкг на миллилитр.Затем надежно закройте колпачок перед инкубацией при 28 градусах Цельсия в вертикальном положении. Из логарифмической фазы культуры делают суспензию эпимастигота в ЛИТ-среде, дополненную генетином и сульфатом в конечной концентрации 200 000 клеток на миллилитр эпимастигота на миллилитр. После дозирования 100 микролитров суспензии на лунку 96 луночной пластины, внесите окончательный объем скважины 200 микролитров со средой.Производят клеточную суспензию Vero в DMEM с добавлением 2% FCS в конечной концентрации 100 000 клеток на миллилитр. Посейте 100 микролитров суспензии на лунку в 96 луночных тканевых культуральных пластинах. Инкубируйте клетки на ночь для адгезии и на следующий день наблюдайте за клетками под микроскопом.На следующий день промыть клеточный монослой Vero три раза 100 микролитрами стерильного PBS. Добавьте ранее полученные метациклические трипомастиготы. Добавьте кратность инфекции или MOI 10-1 на 100 микролитров DMEM, дополненных 2% FCS на лунку, и инкубируйте в течение шести часов, как показано ранее.В конце инкубации дважды промыть пластину PBS и добавить 100 микролитров DMEM без фенольного красного с добавлением 2% FCS. После внесения суспензии клеток Vero в DMEM добавляют конечную концентрацию 1 миллион клеток на миллилитр. Посейте 800 000 клеток в пяти миллилитрах среды в колбах Т-25 и инкубируют в течение ночи для клеточной адгезии.После того, как колба промыта PBS, добавьте трипомастиготы, добавьте MOI 10-1 в пяти миллилитрах DMEM, дополненных 2% FCS, и инкубируйте в течение ночи, как показано ранее. В конце инкубации дважды промыть колбу PBS. Добавьте пять миллилитров свежего DMEM с добавлением 2% FCS и инкубируйте в течение четырех дней.В конце инкубации, после наблюдения за присутствием супернатанта на наличие трипомастиготов под оптическим микроскопом. Количественно оцените трипомастиготы с помощью камеры Нойбауэра. Соберите супернатант в 15-миллилитровую трубку и центрифугу в 7 000 раз g в течение 10 минут при комнатной температуре.Затем выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в DMEM без фенольного красного, дополненного 2% FCS для получения концентрации 1 млн трипомастигот на миллилитр. Посейте 100 микролитров суспензии трипомастигота на лунку в 96 луночных пластинах. Добавьте раствор бензнидазола к эпимастиготам, клеткам Веро с амастиготами или трипомастиготам, как описано в тексте рукописи.Затем инкубируют эпимастиготы, устанавливают 28 градусов Цельсия в течение 72 часов и трипомастиготы или инфицированные клетки Веро амастиготами в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Для цветометрического анализа установите пустые скважины, добавив 100 микролитров PBS или соответствующей среды. Далее добавляют 40 микролитров раствора подложки CPRG и 10 микролитров моющего раствора в каждую скважину для получения конечной концентрации 200 микромолярного CPRG и 0,1% моющего средства в конечном объеме 250 микролитров в каждой скважине.После инкубации при 37 градусах Цельсия в течение двух часов измеряют поглощение на 595 нанометрах с помощью микропластинчатого спектрофотометра. В программном обеспечении создайте новый протокол, выбрав поглощение в качестве метода обнаружения и конечную точку в качестве типа чтения, затем нажмите кнопку «ОК». Затем добавьте шаг чтения.Введите выбранную длину волны и нажмите кнопку «ОК». В разделе макета пластины отметьте скважины для чтения, нажмите ok и нажмите на прочитанную пластину, подождите, пока значения появятся на экране, и экспортируйте их в электронную таблицу для анализа результатов и расчета значений поглощения с использованием вычитания, как описано в рукописи. В программном обеспечении для статистического анализа построить график концентрации BZN по сравнению с поглощением на уровне 595 нанометров в таблице XY.Преобразуйте концентрации BZN в логарифмические значения, щелкнув Анализ, выбрав параметр преобразования и нажав кнопку ОК. Для получения значений IC50 нажмите кнопку «Анализировать» и в списке анализа XY выберите «Соответствие кривой нелинейной регрессии», затем нажмите кнопку «ОК». Затем перейдите в окно параметров, на вкладке модели перейдите к группе ингибирования реакции на дозу встроенных уравнений, выберите ингибитор журнала против переменного наклона ответа для параметров, поскольку метод ответа дозы оставляет все остальные вкладки со значениями по умолчанию, а затем нажмите, хорошо.Щелкните раздел результатов, чтобы найти значение IC50, SD и правильность подгонки. Щелкните раздел графика, чтобы найти график XY логарифмической концентрации лекарственного средства по сравнению со значениями абсорбции и убедиться, что кривая также отрисована другим цветом. В настоящем исследовании значение IC50, полученное для эпимастиготов, составляло приблизительно 20 микромоляров, аналогично предыдущим исследованиям.Кроме того, результаты показали активность бета-галактозидазы эпимастиготов с течением времени. Очень важно выполнять хотя бы реплики каждого тестируемого условия и минимизировать ошибки в управлении томами.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Быстрое Одношаговый ферментативный синтез и All-водный Очистка трегалозных Аналогов

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Восстановление клеточного цикла колебаний в микроэмульсий свободных клеток Xenopus яйцо экстрактов

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Изоляции F1-АТФазы от паразитических протисты Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Скрининг для Термотога маритима Мембрана-Связанные пирофосфаза ингибиторы

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Вывод белковых кристаллов с I3C с помощью случайного скрининга матрицы микросея

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...