Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Agradecemos al Dr. Buckner por proporcionar amablemente el plásmido pLacZ. Este trabajo fue apoyado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, el Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva de Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) y el Consejo de Investigación del Reino Unido [MR/P027989/1]. Servier Medical Art se utilizó para producir la Figura 1 (https://smart.servier.com).

NOTA: En la Figura 1 se muestra una descripción general de todo el diseño experimental.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Figura 1: Visión general del ensayo de cribado in vitro de la línea Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ utilizando CPRG como sustrato para la reacción colorimétrica. El ensayo consiste en sembrar l...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. 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A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

Este trabajo describe un ensayo basado en la determinación de la actividad citoplasmática β-galactosidasa liberada debido a la lisis de membrana de los epimastigotes de T. cruzi, tripomastigotes o células infectadas con amastigotes en presencia del sustrato CPRG. Utilizamos parásitos T. cruzi Dm28c/pLacZ, una cepa parásita estable obtenida después de la transfección con un plásmido portador de β-galactosidasa construido por Buckner y coautores10. Este ensayo se ha utili...

La enfermedad de Chagas (ChD), o tripanosomiasis americana, es una enfermedad parasitaria causada por el protozoo flagelado, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). La enfermedad coronaria comienza con una fase aguda asintomática u oligosintomática que generalmente no se diagnostica, seguida de una fase crónica de por vida. En la cronicidad, ~ 30% de los pacientes manifiestan, décadas después de la infección, una variedad de afecciones debilitantes, que incluyen miocardiopatía, síndromes megadigestivos o ambos, con una tasa de mortalidad que oscila entre el 0,2% y el 20%1,2,3. Los pacientes crónicos asintomáticos pueden no tener signos clínicos, pero permanecen seropositivos durante toda su vida.
Las estimaciones sugieren que ~ 7 millones de personas están infectadas en todo el mundo, principalmente de América Latina, donde la enfermedad coronaria es endémica. En estos países, T. cruzi se transmite principalmente a través de insectos triatominos chupadores de sangre infectados (transmisión transmitida por vectores) y con menos frecuencia por transmisión oral a través de la ingestión de alimentos contaminados con heces de triatominos que contienen los parásitos2. Además, el parásito puede transmitirse a través de la placenta de las madres chagásicas a los recién nacidos, a través de transfusiones de sangre o durante el trasplante de órganos. Estas formas independientes del vector de adquirir la infección y la migración humana han contribuido a la propagación mundial de la enfermedad, evidenciada por un número creciente de casos en América del Norte, Europa y algunos países de África, el Mediterráneo oriental y el Pacífico occidental4. La enfermedad coronaria se considera una enfermedad desatendida, ya que la transmisión transmitida por vectores está estrechamente asociada con la pobreza y es un problema de salud pública líder, especialmente en los países latinoamericanos de bajos ingresos. Aunque existen tratamientos disponibles, la mortalidad por ChD en América Latina es la más alta entre las enfermedades parasitarias, incluida la malaria2.
Hay dos medicamentos registrados para el tratamiento de chD introducidos a fines de la década de 1960 y principios de la década de 1970: nifurtimox y benznidazol5. Ambos medicamentos son efectivos en la fase aguda de la enfermedad en adultos, niños y recién nacidos infectados congénitamente, así como en niños con infección crónica, donde generalmente se logra la curación. Sin embargo, solo unas pocas personas son diagnosticadas lo suficientemente temprano como para ser tratadas a tiempo. Según los últimos ensayos clínicos, ambos fármacos tienen importantes limitaciones en adultos y fueron ineficaces para reducir los síntomas en personas con enfermedades crónicas; por lo tanto, su uso en esta etapa es controvertido. Otros inconvenientes son los períodos de tratamiento prolongados requeridos (60-90 días) y los efectos adversos frecuentes y graves observados, que conducen a la interrupción de la terapia en una proporción de personas infectadas 6,7. Se estima que menos del 10% de las personas con cardiopatía coronaria han sido diagnosticadas, y aún menos tienen acceso al tratamiento, ya que muchas personas afectadas viven en áreas rurales con acceso nulo o escaso a la atención médica8. Estos hechos ponen de relieve la necesidad urgente de encontrar nuevos fármacos contra T. cruzi que permitan tratamientos más eficientes, seguros y aplicables al campo, especialmente para la fase crónica. En este sentido, otro desafío en el desarrollo de compuestos más eficaces es la limitación de los sistemas para evaluar la eficacia de los fármacos in vitro e in vivo9.
Aunque la biología química y los enfoques genómicos para la identificación de posibles objetivos farmacológicos se han utilizado en parásitos cinetoplastidos, las herramientas genómicas disponibles en T. cruzi son limitadas en contraste con T. brucei o Leishmania. Por lo tanto, el cribado de compuestos con actividad tripanocida sigue siendo el enfoque más utilizado en la búsqueda de nuevos candidatos a fármacos quimioterapéuticos contra la Enfermedad Coronaria. Por lo general, el descubrimiento de fármacos en T. cruzi debe comenzar con la prueba de los efectos de un nuevo fármaco en un ensayo in vitro contra la etapa de epimastigote. Durante décadas, la única forma de medir los efectos inhibitorios de los compuestos candidatos en T. cruzi fue el conteo microscópico manual, que es laborioso, lento y dependiente del operador. Además, este enfoque es adecuado para el ensayo de un pequeño número de compuestos, pero es inaceptable para el cribado de alto rendimiento de grandes bibliotecas de compuestos. Hoy en día, muchas investigaciones comienzan con el análisis de una gran cantidad de compuestos de diferentes orígenes que se ensayan in vitro, probando su capacidad para inhibir el crecimiento de parásitos. Se han desarrollado métodos colorimétricos y fluorométricos para aumentar el rendimiento en estos ensayos, mejorando la objetividad del cribado y haciendo que todo el proceso sea menos tedioso9.
Uno de los métodos colorimétricos más utilizados se basa en la actividad β-galactosidasa de parásitos transfectados descritos por primera vez por Bucknet y colaboradores10. La enzima β-galactosidasa expresada por los parásitos recombinantes hidroliza el sustrato cromogénico, clorofenol rojo β-D-galactopiranosido (CPRG), a rojo clorofenol, que se puede medir fácilmente colorimétricamente utilizando un espectrofotómetro de microplacas. Por lo tanto, el crecimiento del parásito en presencia de una variedad de compuestos se puede evaluar y cuantificar simultáneamente en placas de microtitulación. Este método se ha aplicado para probar fármacos en formas de epimastigote (presentes en el insecto vector), tripomastigotes y amastigotes intracelulares, las etapas mamíferas del parásito. Además, ya están disponibles varias cepas recombinantes de T. cruzi transfectadas con el plásmido pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 para expresar la enzima Escherichia coli β-galactosidasa (y se pueden construir otras nuevas), lo que permite la evaluación de parásitos a partir de diferentes unidades de tipificación discreta (DTU) que pueden no comportarse igualmente hacia los mismos compuestos 10,11,12,13 . Este método ya se ha utilizado con éxito para evaluar la actividad de los compuestos contra T. cruzi en el cribado de bajo y alto rendimiento12,13. Enfoques similares también se han utilizado en otros parásitos protozoarios, incluyendo Toxoplasma gondii y Leishmania mexicana14,15.
Este artículo describe y muestra un método detallado para un cribado de fármacos in vitro contra todas las etapas del ciclo de vida de T. cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa. Los ensayos aquí presentados se han realizado con una línea de T. cruzi que expresa β-galactosidasa obtenida por transfección de la cepa T. cruzi Dm28c de DTU I13 con plásmido pLacZ (Dm28c/pLacZ). Además, el mismo protocolo podría adaptarse fácilmente a otras cepas para comparar el rendimiento entre compuestos y entre cepas de T. cruzi o DTU.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas (ChD), una enfermedad endémica de importancia para la salud pública en América Latina que también afecta a muchos países no endémicos debido al aumento de la migración. Esta enfermedad afecta a casi 8 millones de personas, con nuevos casos estimados en 50.000 por año. En las décadas de 1960 y 70, se introdujeron dos medicamentos para el tratamiento de la enfermedad coronaria: nifurtimox y benznidazol (BZN). Ambos son efectivos en recién nacidos y durante la fase aguda de la enfermedad, pero no en la fase crónica, y su uso se asocia con importantes efectos secundarios. Estos hechos subrayan la necesidad urgente de intensificar la búsqueda de nuevos medicamentos contra T. cruzi.
T. cruzi se transmite a través de insectos vectores hematófagos de las familias Reduviidae y Hemiptera. Una vez en el huésped mamífero, se multiplica intracelularmente a medida que se forma el amastigota no flagelado y se diferencia en el tripomastigote, la forma infecciosa no replicativa del torrente sanguíneo. Dentro del insecto vector, los tripomastigotes se transforman en la etapa de epimastigote y se multiplican a través de la fisión binaria.
En este trabajo se describe un ensayo basado en la medición de la actividad de la β-galactosidasa citoplasmática liberada en el cultivo debido a la lisis de parásitos mediante el uso del sustrato, clorofenol rojo β-D-galactopiranosido (CPRG). Para ello, la cepa T. cruzi Dm28c fue transfectada con un plásmido sobreexpresante de β-galactosidasa y utilizada para el cribado farmacológico in vitro en estadios de epimastigote, tripomastigote y amastigote. Este artículo también describe cómo medir la actividad enzimática en epimastigotes cultivados, células Vero infectadas con amastigotes y tripomastigotes liberados de las células cultivadas utilizando el fármaco de referencia, benznidazol, como ejemplo. Este ensayo colorimétrico se realiza fácilmente y se puede escalar a un formato de alto rendimiento y aplicarse a otras cepas de T. cruzi .

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se incubaron epimastigotes Dm28c que expresan β-galactosidasa con 6 concentraciones de BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (o compuestos de interés) durante 72 h. Después de este período, se agregó reactivo CPRG junto con detergente, que lisa las células y libera β-galactosidasa. CPRG es escindido por la β-galactosidasa para producir rojo clorofenol, lo que lleva a un cambio en el color de amarillo a rojizo (Figura 2A). El rojo clorofenol s...

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In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

Describimos un ensayo colorimétrico de alto rendimiento que mide la actividad de la β-galactosidasa en tres etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas. Este ensayo se puede utilizar para identificar compuestos tripanocidas de una manera fácil, rápida y reproducible.

In vitro Detección de drogas contra todas las etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Este protocolo describe un ensayo colorimétrico de alto rendimiento en las tres etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi para identificar nuevos candidatos a fármacos para la enfermedad de Chagas. Esto se puede utilizar para identificar compuestos tripanocidas de una manera fácil, rápida y reproducible. La demostración del procedimiento estará a cargo de Romina Manarin, técnica de cultivo celular de laboratorio del laboratorio de Pamela crib.Comience cultivando beta galactosidasa que expresa trypanosoma cruzi epimastigotes en un matraz de cultivo de tejido T-25 e incube a 28 grados centígrados para cultivarlos axénicamente. Usando una cámara de Neubauer, cuantifique el crecimiento del parásito antes de subcultivar. Para mantener los cultivos en una fase logarítmica, subcultivo cada 48 a 72 horas en cinco mililitros de medio LIT suplementado con 10% FCS y genética en sulfato a una concentración final de 200 microgramos por mililitros.Luego cierre firmemente la tapa antes de incubar a 28 grados centígrados en posición vertical. A partir del cultivo en fase logarítmica, realizar una suspensión de epimastigote en medio LIT suplementado con geneticina y sulfato a la concentración final de 200.000 células por epimastigoto mililitro por mililitro. Después de dispensar 100 microlitros de suspensión por pozo de una placa de 96 pocillos, maquillar el volumen final del pozo 200 microlitros con medio.Hacer la suspensión de células Vero en DMEM suplementada con 2% FCS a la concentración final de 100, 000 células por mililitro. Sembra 100 microlitros de la suspensión por pozo en una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos. Incubar las células durante la noche para la adherencia y al día siguiente, observar las células bajo el microscopio.Al día siguiente, enjuague la monocapa de células Vero tres veces con 100 microlitros de PBS estéril. Añadir tripomastigotes metacíclicos obtenidos previamente. Agregue una multiplicidad de infección o MOI de 10-1 en 100 microlitros de DMEM suplementados con 2% FCS por pozo e incube durante seis horas como se demostró anteriormente.Al final de la incubación, lave la placa dos veces con PBS y agregue 100 microlitros de DMEM sin rojo fenol suplementado con 2% FCS. Después de hacer la suspensión de células Vero en DMEM agregue la concentración final de 1 millón de células por mililitro. Sembrar 800, 000 células en cinco mililitros del medio en matraces T-25 e incubar durante la noche para la adherencia celular.Una vez que el matraz esté enjuagado con PBS, agregue tripomastigotes, agregue un MOI de 10-1 en cinco mililitros de DMEM suplementado con 2% FCS e incube durante la noche como se demostró anteriormente. Al final de la incubación, lave el matraz dos veces con PBS. Añadir cinco mililitros de DMEM fresco suplementado con 2% FCS e incubar durante cuatro días.Al final de la incubación, después de observar la presencia del sobrenadante para tripomastigotes bajo un microscopio óptico. Cuantificar los tripomastigotos utilizando una cámara de Neubauer. Recoger el sobrenadante en un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 7.000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en DMEM sin rojo fenol suplementado con 2%FCS para obtener una concentración de 1 millón de tripomastigotes por mililitro. Sembra 100 microlitros de la suspensión de tripomastigote por pozo en una placa de 96 pocillos. Agregue la solución de benznidazol a los epimastigotes, células Vero con amastigotes o tripomastigotes como se describe en el manuscrito de texto.Luego incubar los epimastigotes, establecer 28 grados Celsius durante 72 horas y los tripomastigotes o células Vero infectadas con amastigotes durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Para el ensayo colormétrico, configure los pozos en blanco agregando 100 microlitros de PBS o el medio correspondiente. A continuación, añadir 40 microlitros de solución de sustrato CPRG y 10 microlitros de la solución detergente a cada pocillo para obtener una concentración final de 200 micromolares CPRG y 0,1% de detergente en un volumen final de 250 microlitros en cada pozo.Después de la incubación, a 37 grados Celsius durante dos horas, mida la absorbancia a 595 nanómetros utilizando un espectrofotómetro de microplacas. En el software, cree un nuevo protocolo seleccionando absorbancia como método de detección y punto final como tipo de lectura y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, agregue un paso de lectura.Escriba la longitud de onda seleccionada y haga clic en Aceptar. En la sección de diseño de la placa, marque los pozos que se leerán, haga clic en Aceptar y haga clic en la placa de lectura, espere a que los valores aparezcan en la pantalla y expórtelos a una hoja de cálculo para analizar los resultados y calcular los valores de absorbancia utilizando la resta como se describe en el manuscrito. En el software de análisis estadístico, grafique la concentración de BZN versus la absorbancia a 595 nanómetros en la tabla XY.Transforme las concentraciones de BZN en valores logarítmicos haciendo clic en analizar, seleccionando la opción de transformación y haciendo clic en Aceptar. Para obtener los valores de IC50, haga clic en analizar y, en la lista de análisis XY, seleccione ajuste de curva de regresión no lineal y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, vaya a la ventana de parámetros, en la pestaña del modelo, vaya al grupo de inhibición de la dosis respuesta de las ecuaciones incorporadas, seleccione el inhibidor de registro frente a la pendiente variable de respuesta para los parámetros como el método de respuesta a la dosis deje todas las demás pestañas en los valores predeterminados y luego haga clic en, de acuerdo.Haga clic en la sección de resultados para encontrar el valor IC50, la SD y la bondad del ajuste. Haga clic en la sección del gráfico para encontrar el gráfico XY de la concentración logarítmica del fármaco frente a los valores de absorbancia y asegúrese de que el ajuste de la curva también se grafique en un color diferente. En el presente estudio, el valor de IC50 obtenido para los epimastigotes fue de aproximadamente 20 micromolares, similar a estudios anteriores.Además, los resultados indicaron la actividad de la beta galactosidasa de los epimastigotes a lo largo del tiempo. Es muy importante realizar al menos réplicas de cada condición probada y minimizar los errores en la administración de volúmenes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rápida de un solo paso Síntesis enzimática y All-Purificación acuosa de trehalosa Análogos

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Investigación

Bioquímica

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

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