Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

Vi tackar Dr. Buckner för att han vänligt tillhandahöll pLacZ-plasmiden. Detta arbete stöddes av Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva från Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) och Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art användes för att producera figur 1 (https://smart.servier.com).

OBS: En översikt över hela den experimentella designen visas i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Figur 1: Översikt över in vitro-screeninganalysen av Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ-linjen med CPRG som substrat för den kolorimetriska reaktionen. Analysen består av sådd av parasiterna (1), inkubera dem me...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+a+bug+and+a+hard+place:+Trypanosoma+cruzi+genetic+diversity+and+the+clinical+outcomes+of+Chagas+disease.">Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).</li><li>Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Chagas+disease.">The history of Chagas disease.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 317 (2014).</li><li>Viotti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+paradigm+shift+in+the+treatment+of+chronic+Chagas+disease.">Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).</li><li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas’+Disease.">Chagas’ Disease.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).</li><li>Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

Detta dokument beskriver en analys baserad på bestämning av cytoplasmatisk β-galaktosidasaktivitet som frigörs på grund av membranlys av T. cruzi-epimastigoter, trypomastigotes eller infekterade celler med amastigotes i närvaro av substratet CPRG. Vi använde T. cruzi Dm28c/pLacZ-parasiter, en stabil parasitstam som erhållits efter transfektion med en β-galaktosidasbärande plasmid konstruerad av Buckner och medförfattare10. Denna analys har använts för att söka efter...

Chagas sjukdom (ChD), eller amerikansk trypanosomiasis, är en parasitisk sjukdom som orsakas av den flagellerade protozoen, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD börjar med en asymptomatisk eller oligosymptomatisk akut fas som vanligtvis är odiagnostiserad, följt av en livslång kronisk fas. I kroniskhet manifesterar ~ 30% av patienterna årtionden efter infektionen - en mängd olika försvagande tillstånd, inklusive myokardiopati, mega-matsmältningssyndrom eller båda, med en dödlighet som sträcker sig från 0,2% till 20% 1,2,3. Asymptomatiska kroniska patienter kan inte ha några kliniska tecken men förblir seropositiva under hela livet.
Uppskattningar tyder på att ~ 7 miljoner människor är smittade över hela världen, mestadels från Latinamerika, där ChD är endemisk. I dessa länder överförs T. cruzi huvudsakligen genom infekterade blodsugande triatominbuggar (vektorburen överföring) och mindre ofta genom oral överföring genom intag av mat som är förorenad med triatomin avföring som innehåller parasiterna2. Dessutom kan parasiten överföras via moderkakan från chagasiska mödrar till nyfödda, genom blodtransfusioner eller under organtransplantation. Dessa vektoroberoende sätt att förvärva infektionen och mänsklig migration har bidragit till den globala spridningen av sjukdomen, vilket framgår av ett ökande antal fall i Nordamerika, Europa och vissa afrikanska, östra Medelhavet och västra Stilla havet4. ChD anses vara en försummad sjukdom eftersom vektorburen överföring är nära förknippad med fattigdom och är en ledande folkhälsofråga, särskilt i latinamerikanska låginkomstländer. Även om det finns tillgängliga behandlingar är dödligheten på grund av ChD i Latinamerika den högsta bland parasitsjukdomar, inklusive malaria2.
Det finns två registrerade läkemedel för ChD-behandling som introducerades i slutet av 1960-talet och början av 1970-talet: nifurtimox och bensnidazol5. Båda läkemedlen är effektiva i den akuta fasen av sjukdomen hos vuxna, barn och medfödda infekterade nyfödda, liksom hos barn med kronisk infektion, där botemedel vanligtvis uppnås. Men bara ett fåtal personer diagnostiseras tillräckligt tidigt för att behandlas i tid. Enligt de senaste kliniska prövningarna har båda läkemedlen viktiga begränsningar hos vuxna och var ineffektiva för att minska symtomen hos personer med kronisk sjukdom. därför är deras användning i detta skede kontroversiell. Andra nackdelar är de förlängda behandlingsperioder som krävs (60-90 dagar) och de frekventa, allvarliga biverkningar som observerats, vilket leder till att behandlingen avbryts hos en andel infekterade personer 6,7. Det uppskattas att färre än 10% av personerna med ChD har diagnostiserats, och ännu färre har tillgång till behandling, eftersom många drabbade individer bor på landsbygden med ingen eller knapp tillgång till vård8. Dessa fakta belyser det brådskande behovet av att hitta nya läkemedel mot T. cruzi för att möjliggöra mer effektiva, säkra och tillämpliga behandlingar på fältet, särskilt för den kroniska fasen. I detta avseende är en annan utmaning i utvecklingen av mer effektiva föreningar begränsningen av system för att bedöma läkemedelseffektivitet in vitro och in vivo9.
Även om kemisk biologi och genomiska metoder för identifiering av potentiella läkemedelsmål har använts i kinetoplastidparasiter, är de tillgängliga genomiska verktygen i T. cruzi begränsade i motsats till T. brucei eller Leishmania. Således är screening av föreningar med trypanocidal aktivitet fortfarande det mest använda tillvägagångssättet i sökandet efter nya kemoterapeutiska läkemedelskandidater mot ChD. Vanligtvis måste läkemedelsupptäckt i T. cruzi börja med att testa effekterna av ett nytt läkemedel i en in vitro-analys mot epimastigotstadiet. I årtionden var det enda sättet att mäta de hämmande effekterna av kandidatföreningar på T. cruzi manuell mikroskopisk räkning, vilket är mödosamt, tidskrävande och operatörsberoende. Dessutom är detta tillvägagångssätt lämpligt för analys av ett litet antal föreningar men är oacceptabelt för screening med hög genomströmning av stora sammansatta bibliotek. Numera börjar många undersökningar med analys av ett stort antal föreningar från olika ursprung som analyseras in vitro och testar deras förmåga att hämma parasittillväxt. Både kolorimetriska och fluorometriska metoder har utvecklats för att öka genomströmningen i dessa analyser, förbättra screeningens objektivitet och göra hela processen mindre tråkig9.
En av de mest använda kolorimetriska metoderna är baserad på β-galaktosidasaktiviteten hos transinfekterade parasiter som först beskrivits av Bucknet och medarbetare10. Enzymet β-galaktosidas uttryckt av de rekombinanta parasiterna hydrolyserar det kromogena substratet, klorfenolrött β-D-galaktopyranosid (CPRG), till klorfenolrött, som lätt kan mätas kolorimetriskt med hjälp av en mikroplattspektrofotometer. Således kan parasittillväxt i närvaro av en mängd olika föreningar samtidigt utvärderas och kvantifieras i mikrotiterplattor. Denna metod har tillämpats på testläkemedel i epimastigotformer (närvarande i insektsvektorn), trypomastigoter och intracellulära amastigoter, parasitens däggdjursstadier. Vidare finns det redan flera rekombinanta T. cruzi-stammar transfekterade med pBS:CL-Neo-01/BC-X-10-plasmiden (pLacZ)10 för att uttrycka enzymet Escherichia coli β-galaktosidas (och nya kan konstrueras), vilket möjliggör utvärdering av parasiter från olika diskreta skrivenheter (DTU) som kanske inte beter sig lika mot samma föreningar 10,11,12,13 . Denna metod har redan framgångsrikt använts för att utvärdera föreningar för aktivitet mot T. cruzi vid screening med låg och hög genomströmning12,13. Liknande metoder har också använts i andra protozoa parasiter, inklusive Toxoplasma gondii och Leishmania mexicana14,15.
Detta dokument beskriver och visar en detaljerad metod för en in vitro-läkemedelsscreening mot alla livscykelstadier av T. cruzi med hjälp av parasiter som uttrycker β-galaktosidas. Analyserna som presenteras här har utförts med en β-galaktosidasuttryckande T. cruzi-linje erhållen genom transfektion av T. cruzi Dm28c-stam från DTU I13 med pLacZ-plasmid (Dm28c / pLacZ). Dessutom kan samma protokoll enkelt anpassas till andra stammar för att jämföra prestandan mellan föreningar och mellan T. cruzi-stammar eller DTU.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi är orsaksmedlet för Chagas sjukdom (ChD), en endemisk sjukdom av folkhälsobetydelse i Latinamerika som också påverkar många icke-endemiska länder på grund av ökad migration. Denna sjukdom drabbar nästan 8 miljoner människor, med nya fall som uppskattas till 50 000 per år. På 1960- och 70-talet introducerades två läkemedel för ChD-behandling: nifurtimox och bensnidazol (BZN). Båda är effektiva hos nyfödda och under den akuta fasen av sjukdomen men inte i den kroniska fasen, och deras användning är förknippad med viktiga biverkningar. Dessa fakta understryker det brådskande behovet av att intensifiera sökandet efter nya droger mot T. cruzi.
T. cruzi överförs genom hematofagiska insektsvektorer av familjerna Reduviidae och Hemiptera. En gång i däggdjursvärden multipliceras den intracellulärt som den icke-flagellerade amastigotformen och differentieras till trypomastigoten, blodomloppets icke-replikativa infektionsform. Inuti insektsvektorn omvandlas trypomastigoter till epimastigotstadiet och multipliceras genom binär fission.
Denna uppsats beskriver en analys baserad på mätning av aktiviteten hos den cytoplasmatiska β-galaktosidas som släpps ut i kulturen på grund av parasiterlys genom att använda substratet, klorfenolrött β-D-galaktopyranosid (CPRG). För detta transinfekterades T. cruzi Dm28c-stammen med en β-galaktosidas-överuttryckande plasmid och användes för in vitro-farmakologisk screening i epimastigot-, trypomastigote- och amastigotstadier. Denna uppsats beskriver också hur man mäter den enzymatiska aktiviteten i odlade epimastigoter, infekterade Vero-celler med amastigotes och trypomastigotes som frigörs från de odlade cellerna med hjälp av referensläkemedlet bensnidazol som ett exempel. Denna kolorimetriska analys utförs enkelt och kan skalas till ett format med hög genomströmning och tillämpas på andra T. cruzi-stammar .

Efter det protokoll som beskrivits ovan inkuberades β-galaktosidas-uttryckande Dm28c-epimastigoter med 6 koncentrationer av BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (eller föreningar av intresse) i 72 timmar. Efter denna period tillsattes CPRG-reagens tillsammans med tvättmedel, som lyserar cellerna och frigör β-galaktosidas. HLRG klyvs av β-galaktosidas för att producera klorfenolrött, vilket leder till en färgförändring från gult till rödaktigt (figur 2A). Klorfenolrött mättes genom...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

Vi beskriver en kolorimetrisk analys med hög genomströmning som mäter β-galaktosidasaktivitet i tre livscykelstadier av Trypanosoma cruzi, orsaksmedlet till Chagas sjukdom. Denna analys kan användas för att identifiera trypanocidala föreningar på ett enkelt, snabbt och reproducerbart sätt.

In vitro Läkemedelsscreening mot alla livscykelstadier av Trypanosoma cruzi med hjälp av parasiter som uttrycker β-galaktosidas

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Detta protokoll beskriver en kolorimetrisk analys med hög genomströmning i de tre livscykelstadierna av Trypanosoma cruzi för att identifiera nya läkemedelskandidater för Chagas sjukdom. Detta kan användas för att identifiera trypanocidala föreningar på ett enkelt, snabbt och reproducerbart sätt. Romina Manarin, en laboratoriecellodlingstekniker från Pamela-spjälsängens laboratorium, demonstrerar proceduren.Börja med att odla beta galaktosidas som uttrycker Trypanosoma cruzi epimastigotes i en T-25 vävnadsodlingskolv och inkubera vid 28 grader Celsius för att odla dem axeniskt. Använd en Neubauer-kammare för att kvantifiera parasittillväxt före subkulturering. För att upprätthålla kulturerna i en loggfas, subkultur var 48: e till 72: e timme i fem milliliter LIT-medium kompletterat med 10% FCS och genetik i sulfat vid en slutlig koncentration av 200 mikrogram per milliliter.Stäng sedan locket ordentligt innan du inkuberar vid 28 grader Celsius i vertikalt läge. Från loggfaskulturen gör du en suspension av epimastigot i LIT-medium kompletterat med genetikin och sulfat vid den slutliga koncentrationen av 200 000 celler per milliliter epimastigot per milliliter. Efter dosering av 100 mikroliter suspension per brunn på en 96 brunnsplatta, smink slutlig volym av brunn 200 mikroliter med medium.Gör Vero-cellsuspensionen i DMEM kompletterad med 2% FCS vid den slutliga koncentrationen av 100 000 celler per milliliter. Frö 100 mikroliter av suspensionen per brunn i en 96 brunnsvävnadsodlingsplatta. Inkubera cellerna över natten för vidhäftning och nästa dag, observera cellerna under mikroskopet.Nästa dag, skölj Vero-cellmonoskiktet tre gånger med 100 mikroliter steril PBS. Lägg till tidigare erhållna metacykliska trypomastigotes. Lägg till en mångfald av infektion eller MOI på 10-1 i 100 mikroliter DMEM kompletterat med 2% FCS per brunn och inkubera i sex timmar som visats tidigare.Vid slutet av inkubationen, tvätta plattan två gånger med PBS och tillsätt 100 mikroliter DMEM utan fenolrött kompletterat med 2% FCS. Efter att ha gjort Vero-cellsuspensionen i DMEM tillsätt den slutliga koncentrationen av 1 miljon celler per milliliter. Frö 800 000 celler i fem milliliter av mediet i T-25-kolvar och inkubera över natten för cellföljsamhet.När kolven har sköljts med PBS, tillsätt trypomastigotes, tillsätt en MOI på 10-1 i fem milliliter DMEM kompletterad med 2% FCS och inkubera över natten som visats tidigare. Vid slutet av inkubationen, tvätta kolven två gånger med PBS. Tillsätt fem milliliter färsk DMEM kompletterad med 2% FCS och inkubera i fyra dagar.Vid slutet av inkubationen, efter att ha observerat supernatanten för trypomastigotes närvaro under ett optiskt mikroskop. Kvantifiera trypomastigoterna med hjälp av en Neubauer-kammare. Samla supernatanten i ett 15 ml rör och centrifugera vid 7 000 gånger G i 10 minuter vid rumstemperatur.Kassera sedan supernatanten och återsuspendera pelleten i DMEM utan fenolrött kompletterat med 2% FCS för att erhålla en koncentration av 1 miljon trypomastigotes per milliliter. Frö 100 mikroliter av trypomastigotsuspensionen per brunn i en 96-brunnsplatta. Tillsätt bensnidazollösning till epimastigoter, Vero-celler med amastigotes eller trypomastigotes som beskrivs i textmanuskriptet.Inkubera sedan epimastigoterna, sätt 28 grader Celsius i 72 timmar och trypomastigoterna eller infekterade Vero-celler med amastigotes i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. För den kolorimetriska analysen ställer du in de tomma brunnarna genom att lägga till 100 mikroliter PBS eller motsvarande medium. Tillsätt sedan 40 mikroliter CPRG-substratlösning och 10 mikroliter av tvättmedelslösningen till varje brunn för att erhålla en slutlig koncentration av 200 mikromolär CPRG och 0,1% tvättmedel i en slutlig volym på 250 mikroliter i varje brunn.Efter inkubation, vid 37 grader Celsius i två timmar, mät absorbansen vid 595 nanometer med hjälp av en mikroplattspektrofotometer. I programvaran skapar du ett nytt protokoll genom att välja absorbans som detekteringsmetod och slutpunkt som lästyp och klicka sedan på okej. Lägg sedan till ett lässteg.Skriv den valda våglängden och klicka på okej. I avsnittet om plattlayout markerar du brunnarna som ska läsas, klickar på okej och klickar på läsplattan, väntar på att värdena ska visas på skärmen och exporterar dem till ett kalkylblad för att analysera resultaten och beräkna absorbansvärdena med subtraktion som beskrivs i manuskriptet. I statistisk analysprogramvara, plotta koncentrationen av BZN kontra absorbansen vid 595 nanometer i XY-tabellen.Transformera BZN-koncentrationerna till logaritmiska värden genom att klicka på analysera, välja transformeringsalternativet och klicka på okej. För att få IC50-värden klickar du på analysera och väljer olinjär regressionskurva passar i XY-analyslistan och klickar sedan på okej. Gå sedan till parameterfönstret, på modellfliken, gå till dosresponshämningsgruppen med inbyggda ekvationer, välj loghämmare kontra responsvariabellutning för parametrar eftersom dosresponsmetoden lämnar alla andra flikar vid standardvärden och klicka sedan på, okej.Klicka på resultatavsnittet för att hitta IC50-värdet, SD och passformens godhet. Klicka på diagramsektionen för att hitta XY-grafen för läkemedlets logaritmiska koncentration jämfört med absorbansvärdena och se till att kurvpassningen också är graferad i en annan färg. I den aktuella studien var IC50-värdet som erhölls för epimastigotes cirka 20 mikromolar, liknande tidigare studier.Dessutom indikerade resultaten liner beta galaktosidasaktivitet hos epimastigoterna över tiden. Det är mycket viktigt att utföra åtminstone repliker av varje testat tillstånd och minimerade fel i volymhanteringen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Snabb ett steg Enzymatisk syntes och All-vatten Rening av trehalos analoger

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Beredning av cellcykeln svängningar i mikroemulsioner av cellfria Xenopus ägg extrakt

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolering av F1-ATPas från den parasitiska Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Med hög halt Imaging att kvantifiera mål engagemang i vidhäftande celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisk screening av Nukleasaktivitet med hjälp av Nukleinsyrprober

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening för Thermotoga maritima membran-bundna Pyrofosfatashämmare

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening för fytoöstrogener med hjälp av en cellbaserad östrogenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatisering av Protein kristaller med I3C med hjälp av Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...