Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

Dr. Buckner'a pLacZ plazmidini nazik bir şekilde sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Arjantin'den Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) ve Research Council United Kingdom [MR/P027989/1] tarafından desteklenmiştir. Servier Medical Art, Şekil 1'i (https://smart.servier.com) üretmek için kullanılmıştır.

NOT: Tüm deneysel tasarıma genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Şekil 1: Kolorimetrik reaksiyon için bir substrat olarak CPRG kullanan Trypanosoma cruzi Dm28c / pLacZ hattının in vitro tarama testine genel bakış. Tahlil, parazitlerin (1) tohumlanmasından, BZN (2 ve...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+a+bug+and+a+hard+place:+Trypanosoma+cruzi+genetic+diversity+and+the+clinical+outcomes+of+Chagas+disease.">Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).</li><li>Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Chagas+disease.">The history of Chagas disease.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 317 (2014).</li><li>Viotti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+paradigm+shift+in+the+treatment+of+chronic+Chagas+disease.">Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).</li><li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas’+Disease.">Chagas’ Disease.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).</li><li>Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

Bu yazıda, substrat CPRG varlığında T. cruzi epimastigotların, tripomastigotların veya amastigotlarla enfekte olmuş hücrelerin membran lizisine bağlı olarak salınan sitoplazmik β-galaktosidaz aktivitesinin belirlenmesine dayanan bir test açıklanmaktadır. Buckner ve ortak yazarlar10 tarafından inşa edilen β-galaktosidaz taşıyan plazmid ile transfeksiyondan sonra elde edilen kararlı bir parazit suşu olan T. cruzi Dm28c / pLacZ parazitlerini kullandık. Bu tahl...

Chagas hastalığı (ChD) veya Amerikan tripanosomiasis, kamçılı protozoan Trypanosoma cruzi'nin (T. cruzi) neden olduğu paraziter bir hastalıktır. ChD, genellikle teşhis edilmeyen asemptomatik veya oligosemptomatik akut faz ile başlar, bunu yaşam boyu süren kronik bir faz izler. Kroniklikte, hastaların ~% 30'u enfeksiyondan on yıllar sonra ortaya çıkar - miyokardiopati, mega-sindirim sendromları veya her ikisi de dahil olmak üzere çeşitli zayıflatıcı koşullar,% 0.2 ila% 20 arasında değişen bir ölüm oranı1,2,3. Asemptomatik kronik hastaların klinik bulguları olmayabilir, ancak yaşamları boyunca seropozitif kalırlar.
Tahminler, dünya çapında ~ 7 milyon insanın, çoğunlukla ChD'nin endemik olduğu Latin Amerika'dan enfekte olduğunu göstermektedir. Bu ülkelerde, T. cruzi esas olarak enfekte kan emici triatomin böcekleri (vektör kaynaklı bulaşma) yoluyla ve daha az sıklıkla parazitleri içeren triatomin dışkısı ile kontamine olmuş gıdaların yutulması yoluyla oral yolla bulaşır. Ek olarak, parazit plasenta yoluyla chagasic annelerden yenidoğanlara, kan nakli yoluyla veya organ nakli sırasında bulaşabilir. Enfeksiyonu ve insan göçünü elde etmenin bu vektörden bağımsız yolları, Kuzey Amerika, Avrupa ve bazı Afrika, Doğu Akdeniz ve Batı Pasifik ülkelerinde artan sayıda vaka ile kanıtlanan hastalığın dünya çapında yayılmasına katkıda bulunmuştur4. ChD, vektör kaynaklı bulaşma yoksullukla yakından ilişkili olduğu ve özellikle Latin Amerika düşük gelirli ülkelerinde önde gelen bir halk sağlığı sorunu olduğu için ihmal edilmiş bir hastalık olarak kabul edilir. Mevcut tedaviler olmasına rağmen, Latin Amerika'da ChD'ye bağlı mortalite, sıtma2 de dahil olmak üzere paraziter hastalıklar arasında en yüksektir.
1960'ların sonlarında ve 1970'lerin başında ChD tedavisi için iki kayıtlı ilaç vardır: nifurtimox ve benznidazol5. Her iki ilaç da yetişkinlerde, çocuklarda ve doğuştan enfekte olmuş yenidoğanlarda ve ayrıca kronik enfeksiyonu olan çocuklarda hastalığın akut fazında etkilidir. Bununla birlikte, sadece birkaç kişiye zamanında tedavi edilecek kadar erken teşhis konur. Son klinik çalışmalara göre, her iki ilacın da yetişkinlerde önemli sınırlamaları vardır ve kronik hastalığı olan kişilerde semptomları azaltmada etkisizdir; Bu nedenle, bu aşamada kullanımları tartışmalıdır. Diğer dezavantajlar, gerekli olan uzun tedavi süreleri (60-90 gün) ve gözlenen sık, ciddi yan etkilerdir ve bu da enfekte kişilerin bir oranında tedavinin kesilmesine yol açmaktadır 6,7. ChD'li kişilerin% 10'undan daha azının teşhis edildiği ve hatta daha azının tedaviye erişimi olduğu tahmin edilmektedir, çünkü etkilenen birçok birey sağlık hizmetlerine erişimi olmayan veya az olan kırsal alanlarda yaşamaktadır8. Bu gerçekler, özellikle kronik faz için daha verimli, güvenli ve sahaya uygulanabilir tedavilere izin vermek için T. cruzi'ye karşı yeni ilaçların acilen bulunması gerektiğini vurgulamaktadır. Bu bağlamda, daha etkili bileşiklerin geliştirilmesindeki bir diğer zorluk, in vitro ve in vivo9 ilaç etkinliğini değerlendirmek için sistemlerin sınırlandırılmasıdır.
Kinetoplastid parazitlerde potansiyel ilaç hedeflerinin belirlenmesi için kimyasal biyoloji ve genomik yaklaşımlar kullanılmasına rağmen, T. cruzi'deki mevcut genomik araçlar T. brucei veya Leishmania'nın aksine sınırlıdır. Bu nedenle, tripanosidal aktiviteye sahip bileşiklerin taranması, ChD'ye karşı yeni kemoterapötik ilaç adaylarının araştırılmasında hala en çok kullanılan yaklaşımdır. genellikle, T. cruzi'deki ilaç keşfi, yeni bir ilacın in vitro testinde epimastigot aşamasına karşı etkilerini test etmekle başlamalıdır. On yıllar boyunca, aday bileşiklerin T. cruzi üzerindeki inhibitör etkilerini ölçmenin tek yolu, zahmetli, zaman alıcı ve operatöre bağımlı olan manuel mikroskobik sayımdı. Dahası, bu yaklaşım az sayıda bileşiğin tahlili için uygundur, ancak büyük bileşik kütüphanelerinin yüksek verimli taranması için kabul edilemez. Günümüzde, birçok araştırma, in vitro olarak test edilen ve parazit büyümesini inhibe etme kapasitelerini test eden farklı kökenlerden çok sayıda bileşiğin analizi ile başlamaktadır. Bu tahlillerde verimi artırmak, taramanın nesnelliğini geliştirmek ve tüm süreci daha az sıkıcı hale getirmek için hem kolorimetrik hem de florometrik yöntemler geliştirilmiştir9.
En yaygın kullanılan kolorimetrik yöntemlerden biri, ilk olarak Bucknet ve işbirlikçileri10 tarafından tanımlanan transfekte parazitlerin β-galaktosidaz aktivitesine dayanmaktadır. Rekombinant parazitler tarafından eksprese edilen β-galaktosidaz enzimi, kromojenik substratı, klorofenol kırmızısını β-D-galaktopiranosid (CPRG), bir mikroplaka spektrofotometresi kullanılarak kolorimetrik olarak kolayca ölçülebilen klorofenol kırmızısına hidrolize eder. Böylece, çeşitli bileşiklerin varlığında parazit büyümesi, mikrotitre plakalarında aynı anda değerlendirilebilir ve ölçülebilir. Bu yöntem, epimastigot formlarındaki (böcek vektöründe bulunur), tripomastigotlar ve hücre içi amastigotlar, parazitin memeli evreleri olan ilaçları test etmek için uygulanmıştır. Ayrıca, Escherichia coli β-galaktosidaz enzimini eksprese etmek için pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 plazmid (pLacZ)10 ile transfekte edilen birkaç rekombinant T. cruzi suşu zaten mevcuttur (ve yenileri inşa edilebilir), bu da aynı bileşiklere karşı eşit davranmayabilecek farklı ayrık tipleme birimlerinden (DTU'lar) parazitlerin değerlendirilmesine izin verir10,11,12,13 . Bu yöntem, düşük ve yüksek verimli tarama12,13'te T. cruzi'ye karşı aktivite için bileşikleri değerlendirmek için zaten başarıyla kullanılmıştır. Benzer yaklaşımlar, Toxoplasma gondii ve Leishmania mexicana14,15 dahil olmak üzere diğer protozoan parazitlerde de kullanılmıştır.
Bu yazıda, β-galaktosidaz eksprese eden parazitler kullanılarak T. cruzi'nin tüm yaşam döngüsü aşamalarına karşı in vitro ilaç taraması için ayrıntılı bir yöntem açıklanmakta ve gösterilmektedir. Burada sunulan tahliller, DTU I13'ten T. cruzi Dm28c suşunun pLacZ plazmidi (Dm28c/pLacZ) ile transfeksiyonu ile elde edilen β-galaktosidaz eksprese eden T. cruzi hattı ile gerçekleştirilmiştir. Ek olarak, aynı protokol, bileşikler arasındaki ve T. cruzi suşları veya DTU'lar arasındaki performansı karşılaştırmak için diğer suşlara kolayca uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi , Latin Amerika'da halk sağlığı açısından önem taşıyan endemik bir hastalık olan Chagas hastalığının (ChD) etken maddesidir ve göçün artması nedeniyle endemik olmayan birçok ülkeyi de etkilemektedir. Bu hastalık yaklaşık 8 milyon insanı etkilemektedir ve yeni vakaların yılda 50.000 olduğu tahmin edilmektedir. 1960'larda ve 70'lerde, ChD tedavisi için iki ilaç tanıtıldı: nifurtimox ve benznidazol (BZN). Her ikisi de yenidoğanlarda ve hastalığın akut fazında etkilidir, ancak kronik fazda değildir ve kullanımları önemli yan etkilerle ilişkilidir. Bu gerçekler, T. cruzi'ye karşı yeni ilaç arayışını yoğunlaştırmanın acil ihtiyacının altını çizmektedir.
T. cruzi , Reduviidae ve Hemiptera familyalarının hematofajöz böcek vektörleri yoluyla bulaşır. Memeli konağına girdikten sonra, kamçılanmamış amastigot formu olarak hücre içi olarak çoğalır ve kan dolaşımı replikatif olmayan enfektif form olan tripomastigote farklılaşır. Böcek vektörünün içinde, tripomastigotlar epimastigot aşamasına dönüşür ve ikili fisyon yoluyla çoğalır.
Bu yazıda, substrat, klorofenol kırmızısı β-D-galaktopiranosid (CPRG) kullanılarak parazit lizisi nedeniyle kültüre salınan sitoplazmik β-galaktosidaz aktivitesinin ölçülmesine dayanan bir test açıklanmaktadır. Bunun için, T. cruzi Dm28c suşu β-galaktosidaz aşırı eksprese eden plazmid ile transfekte edildi ve epimastigote, tripomastigote ve amastigot aşamalarında in vitro farmakolojik tarama için kullanıldı. Bu yazıda ayrıca, kültürlenmiş epimastigotlarda, amastigotlarla enfekte Vero hücrelerinde ve referans ilaç benznidazol kullanılarak kültürlenmiş hücrelerden salınan tripomastigotlarda enzimatik aktivitenin nasıl ölçüleceği açıklanmaktadır. Bu kolorimetrik analiz kolayca gerçekleştirilir ve yüksek verimli bir formata ölçeklendirilebilir ve diğer T. cruzi suşlarına uygulanabilir.

Yukarıda açıklanan protokolü takiben, β-galaktosidaz eksprese eden Dm28c epimastigotları, 72 saat boyunca 6 konsantrasyon BZN (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (veya ilgili bileşikler) ile inkübe edildi. Bu süreden sonra, hücreleri lize eden ve β-galaktosidaz salgılayan deterjanla birlikte CPRG reaktifi eklendi. CPRG, klorofenol kırmızısı üretmek için β-galaktosidaz tarafından yarılır ve rengin sarıdan kırmızımsıya değişmesine neden olur (Şekil 2A). Klorofenol kırm?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi'nin üç yaşam döngüsü aşamasında β-galaktosidaz aktivitesini ölçen yüksek verimli bir kolorimetrik tahlil tanımladık. Bu tahlil, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.

İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Bu protokol, Chagas hastalığı için yeni ilaç adaylarını belirlemek için Trypanosoma cruzi'nin üç yaşam döngüsü aşamasında yüksek verimli bir kolorimetrik testi tanımlamaktadır. Bu, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren, Pamela beşiği laboratuvarından bir laboratuvar hücre kültürü teknisyeni olan Romina Manarin olacak.Trypanosoma cruzi epimastigotlarını bir T-25 doku kültürü şişesinde eksprese eden beta galaktosidaz kültürleyerek başlayın ve aksenik olarak büyütmek için 28 santigrat derecede inkübe edin. Bir Neubauer odası kullanarak, alt kültürlemeden önce parazit büyümesini ölçün. Kültürleri bir kütük fazında tutmak için, beş mililitre LIT ortamında her 48 ila 72 saatte bir alt kültür, mililitre başına 200 mikrogramlık son bir konsantrasyonda% 10 FCS ve sülfatta genetikin ile desteklenir.Ardından, dikey konumda 28 santigrat derecede inkübe etmeden önce kapağı güvenli bir şekilde kapatın. Log faz kültüründen, mililitre başına mililitre epimastigot başına 200.000 hücrenin son konsantrasyonunda genetikin ve sülfat ile desteklenmiş LIT ortamında epimastigotun bir süspansiyonunu yapın. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına 100 mikrolitre süspansiyon dağıtıldıktan sonra, orta boy 200 mikrolitrelik kuyunun son hacmini yapın.DMEM'deki Vero hücre süspansiyonunu, mililitre başına 100.000 hücrenin son konsantrasyonunda% 2 FCS ile destekleyin. 96 kuyu doku kültürü plakasında kuyu başına süspansiyonun 100 mikrolitresini tohumlayın. Hücreleri bağlılık için gece boyunca inkübe edin ve ertesi gün mikroskop altında hücreleri gözlemleyin.Ertesi gün, Vero hücresi tek katmanını 100 mikrolitre steril PBS ile üç kez durulayın. Daha önce elde edilen metasiklik tripomastigotları ekleyin. Kuyu başına% 2FCS ile desteklenmiş 100 mikrolitre DMEM'de 10-1'lik çok sayıda enfeksiyon veya MOI ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi altı saat boyunca inkübe edin.Kuluçkanın sonunda, plakayı PBS ile iki kez yıkayın ve% 2 FCS ile desteklenmiş fenol kırmızısı olmadan 100 mikrolitre DMEM ekleyin. DMEM'de Vero hücrelerinin süspansiyonunu yaptıktan sonra, mililitre başına 1 milyon hücrenin son konsantrasyonunu ekleyin. T-25 şişelerinde ortamın beş mililitresinde 800.000 hücre tohumu ve hücre yapışması için gece boyunca kuluçkaya yatırılır.Şişe PBS ile durulandıktan sonra, tripomastigotlar ekleyin,% 2 FCS ile desteklenmiş beş mililitre DMEM'e 10-1'lik bir MOI ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi gece boyunca inkübe edin. Kuluçka sonunda, şişeyi PBS ile iki kez yıkayın. % 2 FCS ile desteklenmiş beş mililitre taze DMEM ekleyin ve dört gün boyunca inkübe edin.Kuluçkanın sonunda, optik mikroskop altında tripomastigotların varlığı için süpernatantı gözlemledikten sonra. Bir Neubauer odası kullanarak tripomastigotları sayısallaştırın. Süpernatantı 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 7.000 kez G'de santrifüj yapın.Daha sonra süpernatantı atın ve mililitre başına 1 milyon tripomastigot konsantrasyonu elde etmek için% 2 FCS ile desteklenmiş fenol kırmızısı olmadan peletin DMEM'de yeniden askıya alın. 96 kuyucuklu bir plakada kuyu başına 100 mikrolitre tripomastigot süspansiyonunun tohumu. Metin yazısında açıklandığı gibi epimastigotlara, amastigotlu Vero hücrelerine veya tripomastigotlara benznidazol çözeltisi ekleyin.Daha sonra epimastigotları inkübe edin, 72 saat boyunca 28 santigrat derece ayarlayın ve tripomastigotlar veya enfekte Vero hücreleri, 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca amastigotlarla enfekte oldu. Kolormetrik analiz için, 100 mikrolitre PBS veya karşılık gelen ortam ekleyerek boş kuyucukları kurun. Daha sonra, her bir kuyucukta 250 mikrolitrelik son hacimde 200 mikromolar CPRG ve% 0.1 deterjan nihai konsantrasyonu elde etmek için her bir kuyucuğa 40 mikrolitre CPRG substrat çözeltisi ve 10 mikrolitre deterjan çözeltisi ekleyin.Kuluçkadan sonra, iki saat boyunca 37 santigrat derecede, bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak 595 nanometrede absorbans ölçün. Yazılımda, algılama yöntemi olarak absorbansı ve okuma türü olarak bitiş noktasını seçerek yeni bir protokol oluşturun, ardından Tamam'a tıklayın. Ardından, bir okuma adımı ekleyin.Seçilen dalga boyunu yazın ve Tamam'ı tıklatın. Plaka düzeni bölümünde okunacak kuyucukları işaretleyin, tamam'ı tıklayın ve plakayı oku'ya tıklayın, değerlerin ekranda görünmesini bekleyin ve sonuçları analiz etmek ve makalede açıklandığı gibi çıkarma kullanarak absorbans değerlerini hesaplamak için bunları bir elektronik tabloya aktarın. İstatistiksel analiz yazılımında, XY tablosundaki 595 nanometredeki absorbansa karşı BZN konsantrasyonunu çizin.Analiz et'i tıklatarak, dönüştür seçeneğini belirleyerek ve Tamam'ı tıklatarak BZN konsantrasyonlarını logaritmik değerlere dönüştürün. IC50 değerlerini elde etmek için analiz et'e tıklayın ve XY analiz listesinden doğrusal olmayan regresyon eğrisi sığdırma'yı seçip Tamam'a tıklayın. Ardından, parametreler penceresine gidin, model sekmesinde, yerleşik denklemlerin doz yanıtı inhibisyon grubuna gidin, doz yanıtı yöntemi diğer tüm sekmeleri varsayılan değerlerde bıraktığından parametreler için log inhibitörü ve yanıt değişken eğimini seçin ve ardından Tamam'ı tıklayın.IC50 değerini, SD'yi ve uyumun iyiliğini bulmak için sonuçlar bölümüne tıklayın. İlacın logaritmik konsantrasyonunun absorbans değerlerine karşı XY grafiğini bulmak ve eğri uyumunun da farklı bir renkte grafiklendirildiğinden emin olmak için grafik bölümüne tıklayın. Bu çalışmada, epimastigotlar için elde edilen IC50 değeri, önceki çalışmalara benzer şekilde, yaklaşık 20 mikromolar idi.Ek olarak, sonuçlar zamanla epimastigotların liner beta galaktosidaz aktivitesini göstermiştir. Birim yönetiminde test edilen ve en aza indirilen hataların en azından çoğaltılması çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Hızlı Bir adım enzimatik sentezi ve Trehaloz Analoglarının All-sulu Arıtma

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Yalıtım F1-ATPaz paraziter Protist Trypanosoma brucei üzerinden

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...