Name: simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers
Uploaded: 2022-04-08T13:00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers at JoVE.com

تم إجراء العمل المختبري بدعم من مورد الفحص الجزيئي المشترك بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (MSSR) حيث ترعى Forcyte الأنشطة البحثية ، وحاضنة Magnify في معهد California NanoSystems Institute (CNSI) ، حيث Forcyte Biotechnologies، Inc. هي شركة مقيمة. سيمنح المؤلفون إمكانية الوصول إلى وحدة تحليل FLECS Biodock.ai لجميع الباحثين الأكاديميين عند الطلب. ساهم L.H. و I.P. بالتساوي في هذا العمل.

1. اليوم الأول: إعداد لوحة البئر 24
<ol><li>ابدأ الإجراء بإضافة 20 مل من وسط زراعة الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. في هذه التجربة ، يتم استخدام الوسط القائم على F12 Ham مع 10٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS).</li>
	<li>احصل على لوحة بئر 24 مصممة لفحص انقباض الخلايا. اضبط الماصة على 500 ميكرولتر واحصل على مصفاة خلية لتمرير الخلايا. ملاحظة: اللوحة متاحة من المؤلفين عند الطلب.</li>
	<li>ارفع اللوحة وأمسكها بيد واحدة واستمر في تقشير الفيلم البلاستيكي بلطف من أعلى اللوحة. ثم اضبط اللوحة بعناية مرة أخرى.</li>
	<li>قم بتشغيل شفاط فراغ وقم بشفط الطبقة العليا من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) من الآبار لمنع الانسكاب. قم بإزالة PBS صف واحد في كل مرة. بمجرد أن تصبح الآبار غير ممتلئة تماما ، أمسك اللوحة بيد واحدة وقم بإزالة بقية PBS بعناية من الآبار. املأ بسرعة 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا. احرص على تجنب الاتصال بين الشافط وأسفل البئر.</li>
	<li>رج الطبق بلطف واضغط على الجانب لضمان تغطية الجزء السفلي بالكامل من البئر بالمحلول. بمجرد ملء جميع الآبار بالوسط ، اضبط اللوحة على الجانب.</li>
</ol>2. اليوم الأول: بذر الخلايا
<ol><li>استرجع قارورة المزرعة باستخدام الممر 7 أو أقل من خلايا العضلات الملساء البشرية الأولية (BSM) من حاضنة 37 درجة مئوية. تحت المجهر ، تحقق من مورفولوجيا الخلايا وتأكد من نمو الخلايا إلى 90٪ على الأقل من الالتقاء ولكن أقل من 100٪ من التقاء.</li>
	<li>إجراء بروتوكول تفكك الخلية. داخل خزانة السلامة البيولوجية المعقمة، قم بالتربسين في الخلايا لمدة 2.5 دقيقة حتى يتم فصل الخلايا قبل إخمادها بوسط مكمل بالمصل (10٪ FBS).</li>
	<li>بمجرد انفصال الخلايا ، استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا وتخفيف تعليق الخلية إلى ما يقرب من 50000 خلية / مل في وسط مكمل بالمصل. الأهم من ذلك ، تتطلب الخلايا مصل 2٪ على الأقل للالتصاق بالأنماط الدقيقة.</li>
	<li>قبل البذر ، قم بإجهاد تعليق الخلية بسرعة من خلال مصفاة خلية 40 أو 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مل مع ماصة مصلية لتفتيت كتل الخلايا إلى خلايا واحدة.</li>
	<li>أضف بعناية 500 ميكرولتر من تعليق الخلايا 50,000 / مل في كل بئر من الآبار ال 24 الموجودة على اللوحة باستخدام ماصة P1000 عن طريق توزيع المحلول بقطرة عبر مواقع مختلفة في الآبار.</li>
	<li>بعد بذر الخلايا ، دع اللوحة تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة للسماح للخلايا بالاستقرار مباشرة على الأنماط الدقيقة دون أن تتأثر بالتيارات الدقيقة الناتجة عن التبخر. بعد 1 ساعة ، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. سوف تتجمع الخلايا ذاتيا وتنتشر على الأنماط الدقيقة اللاصقة خلال هذا الوقت وتبدأ في ممارسة مستويات الانكماش القاعدي.</li>
</ol>3. اليوم الثاني: إضافة دواء الاختبار
ملاحظة: لا يمكن أن يتجاوز التركيز النهائي لثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في الآبار التي تحتوي على خلايا ملتصقة 1٪ ولا يمكن إضافة الدواء / DMSO مباشرة إلى الخلايا ولكن يجب أولا تخفيفه وخلطه في محلول وسيط من وسط الخلية.
<ol><li>قم بإنشاء سلسلة تخفيف دوائية من ست خطوات وثمانية أضعاف عن طريق نقل 30 ميكرولتر من عقار المخزون إلى أحجام متتالية من 210 ميكرولتر من DMSO والخلط الدقيق بين كل خطوة نقل. في هذا العمل ، يتم تحضير سلسلة تخفيف من ست خطوات وثمانية أضعاف من blebbistatin بجرعات تتراوح من 40 ميكرومتر إلى 1 نانومتر ، في DMSO.</li>
	<li>لكل محلول دوائي مخزون (من الخطوة 3.1) ، امزج 30 ميكرولتر من الدواء في 470 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا. ينتج عن المحلول الوسيط تخفيف 16.7 ضعف DMSO.</li>
	<li>انقل 200 ميكرولتر من كل محلول وسيط إلى البئر المناسب على لوحة البئر 24 (التي تحتوي بالفعل على 100 ميكرولتر من الوسط في كل بئر). وهذا يؤدي إلى تخفيف إضافي بمقدار ستة أضعاف ل DMSO.</li>
	<li>تسفر الخطوتان 3.2 و 3.3 مجتمعتين عن تركيز نهائي بنسبة 1٪ من DMSO في الآبار.</li>
	<li>ضع اللوحة المعالجة في حاضنة 37 درجة مئوية للمدة المناسبة. لهذه التجربة ، يتم استخدام حضانة لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>قبل التصوير مباشرة ، أضف محلول البقع النووية الحية Hoechst 33342 إلى كل بئر (1: 10000 تخفيف نهائي). اسمح لها بالاحتضان لمدة 15 دقيقة إضافية لتسمية نوى الخلية.</li>
</ol>4. اليوم الثاني: تصوير لوحة البئر
<ol><li>الوصول إلى مجهر مجهز لتصوير القنوات لكل من نوى الخلية (DAPI) والأنماط الدقيقة (TRITC).</li>
	<li>قم أولا بتصوير الخلايا باستخدام DMSO فقط.</li>
	<li>ثم ركز على كل من الأنماط الدقيقة ونوى الخلايا المصنفة وصورها من أجل تحديد الخلايا المفردة وضمان محاذاة كلتا القناتين تماما لتمكين التحليل الآلي للصور.</li>
	<li>كرر في مواضع متعددة في كل بئر من الآبار ال 24 على اللوحة. يمكن التقاط الصور بهدف 4x (أو أعلى اختياريا لتسريع التصوير والحصول على أقصى نقاط بيانات لكل صورة).</li>
	<li>قم بتصدير الصور كملفات TIF وافتحها على جهاز كمبيوتر متصل بالويب باستخدام ImageJ لتحليل البيانات.</li>
</ol>5. ما بعد التجربة: تحليل الصور
ملاحظة: تم إجراء تحليل الصور باستخدام بوابة Biodock.ai وبرنامج التصوير.
<ol><li>قم بتحميل الصور التي تم الحصول عليها إلى جهاز كمبيوتر.<ol>
<li>تأكد من تسمية الأزواج المقابلة من الصور الدقيقة والنووية بشكل صحيح.</li>
		<li>تأكد من أن جميع أسماء الصور ذات الأنماط الدقيقة تأخذ شكل "sharedCoreName_pt.tif".</li>
		<li>تأكد من أن جميع أسماء صور النوى تأخذ شكل "sharedCoreName_dapi.tif".</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحويل الصور من TIF إلى PNG باستخدام ImageJ.<ol>
<li>بمجرد فتح ImageJ ، قم بالتحميل في قناة واحدة في كل مرة. بالنسبة لهذه التجربة، قم أولا بتحميل صور الأنماط الدقيقة كمكدس في ImageJ.</li>
		<li>باستخدام Image > ضبط سطوع / تباين > ، اضبط سطوع الصورة للتأكيد على الأنماط الدقيقة وتقليل الخلفية إلى اللون الأسود. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتنعيم الصور.</li>
		<li>باستخدام نوع > الصورة > 8 بت، قم بتحويل الصور إلى 8 بت.</li>
		<li>ثم قم بتصدير الصورة إلى نوع PNG وحدد مستوى شريحة المربع كاسم ملف. الآن قم بإنشاء مجلد جديد PNGs واحفظ ملفات PNG هناك بنفس الاسم.</li>
		<li>كرر هذه العملية لصور النوى.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قم بتحميل أزواج صور PNG إلى برنامج معالجة الصور للتحليل.<ol>
<li>إنشاء الحساب والتحقق من صحته. يمتلك المؤلفون حسابا لتمكين الوصول المفتوح للمستخدمين الأكاديميين.</li>
		<li>تحقق من صحة الحساب عن طريق الاتصال بالمؤلفين.</li>
		<li>قم بتسجيل الدخول إلى البرنامج.</li>
		<li>ضمن علامة التبويب بيانات على يمين الصفحة، انقر على تحميل الدفعة.</li>
		<li>قم باستيراد الصور عن طريق سحب وإسقاط أزواج الصور في النافذة التي تنبثق وتسمية الدفعة. انقر فوق موافق.</li>
		<li>حدد المربع المجاور لاسم الدفعة وانقر على تحليل.</li>
		<li>في الشاشة التالية، مرر لأسفل وحدد المربع المجاور لتحليل الانقباض وانقر فوق تحديد. أسفل الصفحة، حدد 10x كتكبير تم استخدامه للتصوير من قائمة منسدلة.<ol>
<li>انقر على إرسال. بمجرد أن يقرأ تحليل البيانات مكتمل ، انقر فوق اسم الدفعة. في الشاشة التالية، انقر فوق تنزيل البيانات على الجانب الأيسر من الصفحة. ملاحظة: ستحتوي الملفات التي تم تنزيلها على صور تم تحليلها، ونتائج ملخصة تبلغ عن متوسط الانكماش في كل صورة، وتحليل مفصل لكل نمط مجهري تم اكتشافه في أي صورة، مع الإبلاغ عن أحجامها ومواقعها وعدد الخلايا التي تم الالتزام بها وانكماشها.</li>
			<li>رسم قيم الانكماش مقابل تركيزات الدواء لتوليد منحنى استجابة التركيز وتحديد القدرات النسبية للعلاجات المختلفة.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+abnormal+intestinal+motility+in+inflammatory+bowel+disease:+How+smooth+muscle+contraction+is+reduced.">Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).</li><li>Peyronnet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+review+of+overactive+bladder+pathophysiology:+On+the+way+to+tailored+treatment.">A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment.</a> European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).</li><li>Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underactive+bladder:+Pathophysiology+and+clinical+significance.">Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance.</a> Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).</li><li>Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+cell+contractility+by+Ca2++signaling+and+sensitivity.">Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).</li><li>Brozovich, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+smooth+muscle+contraction+and+the+basis+for+pharmacologic+treatment+of+smooth+muscle+disorders.">Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders.</a> Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+an+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Rokhzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+measurements+of+cell+contraction+and+endothelial+barrier+function.">high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function.</a> Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).</li><li>Park, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell+microarray+platform+for+correlative+analysis+of+cell+differentiation+and+traction+forces.">A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55362 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+with+optimized+regularization+and+automated+Bayesian+parameter+selection+for+comparing+cells.">Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells.</a> Scientific Reports. 9, 539 (2019).</li><li>Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+traction+force+microscopy:+A+new+tool+for+quantifying+cell-matrix+interactions.">Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions.</a> PLOS ONE. 6, 17833 (2011).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Pushkarsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLECS+technology+for+high-throughput+single-cell+force+biology+and+screening.">FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).</li><li>Koziol-White, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PI3K+promotes+dilation+of+human+small+airways+in+a+rho+kinase-dependent+manner.">Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).</li><li>Orfanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+airway+smooth+muscle+responses+to+contractile+agonists.">Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).</li><li>Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallization+and+biopatterning+on+ultra-flexible+substrates+via+dextran+sacrificial+layers.">Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers.</a> PLOS ONE. 9, 106091 (2014).</li><li>Yoo, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;12+facilitates+shortening+in+human+airway+smooth+muscle+by+modulating+phosphoinositide+3-kinase-mediated+activation+in+a+RhoA-dependent+manner.">G&#945;12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).</li><li>MacGlashan, D., Vilari&#241;o, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerization+of+actin+does+not+regulate+desensitization+in+human+basophils.">Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).</li><li>Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+integrin-mediated+cell+contractility+by+fibronectin+polymerization.">Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).</li><li>Toli&#263;-N&#248;rrelykke, I. M., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+in+smooth+muscle+cells+varies+with+cell+spreading.">Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading.</a> Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).</li><li>Ye, G. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+strength+of+vascular+smooth+muscle+myocytes+is+shape+dependent.">The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent.</a> Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).</li></ol>

I.P. هو مخترع في عائلة براءات اختراع صادرة تحمي أساليب وأنظمة تكنولوجيا FLECS. I.P., Y.W., J.Z., E.C., and R.H. جميعهم موظفون في Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. هو أستاذ في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس وأحد مؤسسي Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z., و R.D. لديهم مصالح مالية في Forcyte Biotechnologies, Inc., وهو المرخص له الحصري لبراءات الاختراع المذكورة أعلاه ويقوم بتسويق FLECS Technology.

توفر هذه الطريقة المبسطة لقياس الانكماش كميا في مئات الآلاف من الخلايا في وقت واحد في ظل ظروف معالجة مختلفة واستخدام أدوات الفحص المجهري القياسية فقط بديلا يمكن الوصول إليه ل TFM التقليدي للباحثين لدراسة بيولوجيا القوة الخلوية. نظرا لأن التكنولوجيا المقدمة توفر عرضا مرئيا لتقلص الخلية من خلال تحليل التغيرات في الأنماط الدقيقة الفلورية ذات الشكل المنتظم ، فإن حجم الانكماش الذي تنتجه أي خلية معينة مفهوم بشكل حدسي - كلما كان النمط المجهري أصغر ، زادت قوة الانقباض التي تمارسها الخلية.
ومن الجدير بالذكر أنه من خلال توفير السيطرة على عوامل مثل الشكل ومنطقة الانتشار وجزيء الالتصاق الذي يضم الأنماط الدقيقة (جميع العوامل المعروفة بتنظيم انقباض الخلايا22،23،24) ، فإن التكنولوجيا المقدمة تقضي بشكل منهجي على المتغيرات الإضافية التي قد تربك تفسيرات دراسات تقلص الخلايا.
في هذه التجربة ، تم استخدام صلابة 10 كيلو باسكال في الجل وتم استخدام نمط مجهري 70 ميكرومتر (طول قطري) يتكون من الكولاجين من النوع الرابع. إلى جانب هذه المعلمات ، يمكن استبدال الجزيء اللاصق بالعديد من الكولاجين والفيبرونيكتين والجيلاتين والمصفوفة الأخرى خارج الخلية (ECM). يمكن ضبط صلابة الجل إلى 0.1 كيلو باسكال ، وحتى في نطاق MPa. يمكن تصميم هندسة micropattern de novo لتكون أي شكل مع الحد الأدنى من حجم الميزة من ~ 5 ميكرومتر. يتم فصل هذه المعلمات ويمكن تحسينها بشكل مستقل لسياق بيولوجي معين.
تم التحقق من صحة هذه التقنية على نطاق واسع لتكون متوافقة مع أنواع الخلايا شديدة اللصق والانقباض من النمط الظاهري الوسيط بما في ذلك أنواع مختلفة من خلايا العضلات الملساء (المثانة البشرية الأولية ، الأمعاء ، القصبة الهوائية ، الشعب الهوائية ، الرحم ، الأبهري ، والشرايين) ، والخلايا الجذعية الوسيطة وذريتها المتمايزة ، والخلايا الليفية المختلفة (الرئوية والجلدية والقلبية) ، والخلايا الليفية العضلية ، والخلايا البطانية. بالإضافة إلى ذلك ، ستنتج البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية أيضا قوة بلعمة كبيرة قابلة للقياس على الأنماط الدقيقة ، خاصة إذا كان النمط الدقيق يتكون من أوبسونين معروف. يمكن أيضا فحص خطوط السرطان المختلفة باستخدام الطريقة.
قد تشكل هذه الطريقة بعض التحديات للاستخدام مع الخلايا التي تكون إما صغيرة نسبيا مثل الخلايا التائية والعدلات ، أو أنواع الخلايا ذات النمط الظاهري الظهاري في الغالب. السبب الرئيسي لذلك هو أن الطريقة تعتمد على الالتصاق القوي والانتشار الكامل للخلايا عبر النمط المجهري من أجل توليد إشارة الانقباض القابلة للقياس. الخلايا التي ترتبط بشكل ضعيف ، أو ترتبط ببعضها البعض ، أو لا تنتشر تماما لن تنتج إشارات انقباضية قابلة للقياس. يمكن تخفيف هذه السلوكيات ، النادرة نسبيا ، عن طريق ضبط حجم النمط الدقيق ليكون أصغر ، أو باستخدام جزيئات لاصقة بديلة داخل الأنماط الدقيقة التي من شأنها تعزيز الالتصاق والانتشار بشكل أفضل في تلك الخلايا.
يجب على مستخدمي التكنولوجيا تقييم مختلف التركيبات المتوسطة المحتملة لزراعة الخلايا بعناية لنوع الخلية الخاص بهم ، حيث أن المكونات المختلفة وعوامل النمو ومستويات المصل وحساسيات الأس الهيدروجيني قد تؤدي إلى سلوكيات متغيرة في خلايا مختلفة. يجب أن يسبق تحسين البروتوكول توسيع نطاق أي سير عمل تجريبي ، ويجب أن تكون مكونات الوسائط دائما جديدة ومعقمة ومتسقة مع الدفعات السابقة.
في نهاية المطاف، إذا لم تكن دقة الخلية الواحدة ضرورية لأهداف المستخدم، أو إذا كان نوع الخلية المستهدفة لديه الحد الأدنى من القدرة على الانتشار، فقد تكون TFM التقليدية مناسبة بنفس القدر أو أكثر لمثل هذه التجارب. هدف المؤلفين وأملهم هو أن توفر هذه الأداة وسيلة إضافية لعلماء الأحياء الخلوية لدراسة الانكماش الخلوي ، لا سيما في سياق شاشات الأدوية الظاهرية الآلية عالية الإنتاجية.
خاصة بالاستخدامات المستقبلية في شاشات الأدوية ، يمكن استخدام لوحات إنتاجية أعلى مثل لوحة FLECS ذات 384 بئرا. في مثل هذه الصفائح ، يمكن لأهداف 4x على العديد من المجاهر التقاط بئر واحد كامل في مجال رؤيتها ، مما يضمن التقاط جميع الاستجابات الانقباضية الخلوية. باستخدام نظام تصوير عالي الإنتاجية ، يمكن تصوير لوحة كاملة من 384 بئرا في حوالي 5 دقائق ، مما يجعل هذا النظام أسرع بشكل كبير من الخيارات الأخرى ، وبالتالي ، مناسب لاكتشاف الأدوية ذات النمط الظاهري عالي الإنتاجية. في الواقع ، يقوم المؤلفون بشكل روتيني بتشغيل شاشات الأدوية الأسبوعية على حوالي 50 384 بئرا (يبلغ مجموعها أكثر من 19000 بئر) باستخدام الأتمتة.

القوى الميكانيكية الناتجة عن الخلايا ضرورية للوظيفة المناسبة في مختلف الأعضاء في جميع أنحاء الجسم مثل الأمعاء والمثانة والقلب وغيرها. يجب أن تولد هذه الأعضاء أنماطا مستقرة من تقلص الخلايا والاسترخاء للحفاظ على حالة الاستتباب الداخلية. يمكن أن يؤدي تقلص خلايا العضلات الملساء غير الطبيعي (SMC) إلى ظهور اضطرابات مختلفة، بما في ذلك، على سبيل المثال، خلل الحركة المعوي، الذي يتميز بأنماط غير طبيعية من تقلص العضلات الملساء المعوية1، فضلا عن الظروف البولية لفرط النشاط2 أو المثانة غير النشطة3. داخل الشعب الهوائية، يمكن أن تؤدي SMCs التي تظهر أنماط انكماش غير منتظمة إلى فرط الاستجابة الربوية4، مما قد يؤدي إلى تشديد الشعب الهوائية وتقليل تدفق الهواء من الأكسجين إلى الرئتين. وهناك حالة جسدية أخرى واسعة الانتشار، وهي ارتفاع ضغط الدم، ناجمة عن تقلبات في تقلص العضلات الملساء داخل الأوعية الدموية5. من الواضح أن آليات الانقباض داخل الخلايا والأنسجة يمكن أن تؤدي إلى أمراض تتطلب خيارات علاجية. نظرا لأن هذه الحالات تنبع بشكل لا لبس فيه من السلوكيات الانقباضية المختلة وظيفيا للخلايا ، يصبح من المنطقي والضروري قياس وظيفة انقباض الخلية نفسها ، عند فحص الأدوية المرشحة المحتملة.
إدراكا للحاجة إلى أدوات لدراسة قوة الانقباض الخلوي ، تم تطوير العديد من طرق فحص الانكماش الكمي من قبل الباحثين الأكاديميين بما في ذلك الفحص المجهري لقوة الجر (TFM) 6 ، و TFM7 المجهري ، ومقايسات الجل العائم 8 ، والمقايسات المجهرية المطاطية 9. وقد استخدمت هذه التقنيات في شكل طبق واحد وكذلك شكل متعدد الصحون في العديد من الدراسات وحتى تم اقتراحها لقياسات القوة ثلاثية الأبعاد10،11،12،13،14. في حين أن هذه التقنيات قد مكنت من إجراء أبحاث رائدة في المجال الواسع لبيولوجيا قوة الخلية ، فقد اقتصرت جميعها إلى حد كبير على المختبرات التي تمتلك قدرات وموارد محددة ، على وجه الخصوص: القدرة على تصنيع ركائز TFM ، والقدرة على تطبيق خوارزميات معقدة وغير بديهية بشكل صحيح لحل خرائط إزاحة TFM ، وأنظمة الفحص المجهري الدقيقة نسبيا التي يمكنها تسجيل الصور الملتقطة قبل وبعد إزالة العينات من المرحلة (لتفكك الخلايا). وبالتالي ، بالنسبة للباحث غير المدرب ، يمكن أن يكون حاجز الدخول لاستخدام هذه الأساليب مرتفعا جدا نظرا لمجموعة واسعة من المتطلبات لتطبيق هذه التقنيات. بالإضافة إلى ذلك، فإن دقة التصوير المطلوبة للعديد من التقنيات الحالية (أهداف 40x أو أكثر) يمكن أن تحد بشكل كبير من الإنتاجية التجريبية، في حين أن تقنيات القياس السائبة يمكن أن تخفي مساهمات الخلايا المتطرفة وتمنع اكتشاف اختلافات انقباضية أكثر اعتدالا. ومن الجدير بالذكر أنه على حد علم المؤلفين، فإن نهج فحص الجل العائم منخفض الإنتاجية وشبه الكمي هو الوحيد الذي نضج بما فيه الكفاية ليصبح متاحا للباحثين (انظر الشكل 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig01.jpg"> الشكل 1: المخطط العام لطريقة تقنية FLECS . (أ) يتم الالتزام بالخلايا بالأنماط الدقيقة للبروتين اللاصق التي يتم تضمينها تساهميا في طبقة مرنة رقيقة مدعومة بالزجاج. (ب) عرض علوي لمختلف أشكال الأنماط الدقيقة المحتملة وانفجار خلية تتقلص على شكل نمط مجهري على شكل حرف "X". (ج) تراكب الأنماط الدقيقة الفلورية وصور تباين الطور للخلية المتعاقدة. (د) صور زمنية لخلية متعاقدة واحدة. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. تم تكييف هذا الرقم بإذن من بوشكارسكي وآخرون15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
بعد التطورات الحديثة في التكنولوجيا الدقيقة ، طور المؤلفون تقنية قائمة على الصفائح الدقيقة تمكن من إجراء قياسات كمية لتقلص الخلية الواحدة في مئات الآلاف من الخلايا تسمى FLECS (الأسطح القابلة للانكماش المطاطي الموسومة بالفلورسنت) 15،16،17،18،19،20 ، كبديل ل TFM. في هذا النهج ، يتم تضمين الأنماط الدقيقة للبروتين الفلورسنت في الأفلام اللينة التي تشوه وتتقلص عندما تطبق الخلايا قوى الجر عليها ، بطريقة بديهية وقابلة للقياس. الأهم من ذلك ، أن الأنماط الدقيقة للبروتين تقيد موضع الخلية وشكلها ومنطقة انتشارها ، مما يؤدي إلى ظروف اختبار موحدة. تسمح هذه القياسات البسيطة بناء على تغييرات الأبعاد الخاصة بها فقط ، والتي يتم حلها بشكل كبير مكانيا حتى في صور التكبير 4x. تتضمن هذه الطريقة وحدة تحليل صور قائمة على المتصفح وتمكن من التحليل المباشر لقوة الخلايا الانقباضية دون الحاجة إلى إجراءات معالجة دقيقة أو تسجيل علامات ائتمانية ، بحيث يجب أن تكون قابلة للتشغيل من قبل أي باحث لديه مرفق أساسي لزراعة الخلايا ومجهر فلورسنت بسيط مع تكبير منخفض (الشكل 2 ). تم تصميم هذه التكنولوجيا ، الجاهزة على الرف والمتاحة تجاريا ، مع وضع المستخدم النهائي في الاعتبار وتهدف إلى تقليل حاجز الدخول أمام أي عالم مختبر لدراسة بيولوجيا القوة الخلوية.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig02.jpg"> الشكل 2: مخطط لشكل لوحة 24 بئرا لفحص انقباض الخلية الواحدة. تم استخدام هذا التنسيق في التجارب الموضحة هنا والموضحة في جزء الفيديو من المقالة. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا لتطبيق تنسيق لوحة البئر 24 لمنصة FLECS Technology لتحديد آثار الأدوية المعدلة بالقوة على الانقباض الخلوي في خلايا العضلات الملساء الأولية للمثانة. يمكن تكييف هذا البروتوكول للأغراض العامة وتعديله حسب الحاجة لمراعاة مختلف الجداول الزمنية الأخرى وأنواع الخلايا وظروف العلاج ذات الأهمية ، وتوسيع نطاقه للإجابة على أسئلة أخرى في بيولوجيا القوة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bladder smooth muscle cell culture</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td>Ham&#39;s F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7201432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FB012941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>ImageXpress Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcyte-manufactured 24-well plate</td>
			<td>Forcyte Biotechnologies</td>
			<td>24-HC4R-X1-QB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 3342 Live Nuclear Stain</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers

توليد قوة الانقباض الخلوي هو سمة أساسية مشتركة بين جميع الخلايا تقريبا. هذه القوى الانقباضية ضرورية للتنمية السليمة ، وتعمل على كل من المستويات الخلوية والأنسجة ، وتنظيم الأنظمة الميكانيكية في الجسم. تعتمد العديد من العمليات البيولوجية على القوة ، بما في ذلك الحركة والالتصاق وانقسام الخلايا المفردة ، بالإضافة إلى تقلص واسترخاء أعضاء مثل القلب والمثانة والرئتين والأمعاء والرحم. نظرا لأهميته في الحفاظ على الوظيفة الفسيولوجية المناسبة ، يمكن أن يؤدي الانقباض الخلوي أيضا إلى دفع عمليات المرض عند المبالغة فيه أو تعطيله. الربو وارتفاع ضغط الدم والمخاض المبكر والتندب الليفي والمثانة غير النشطة كلها أمثلة على عمليات المرض المدفوعة ميكانيكيا والتي يمكن تخفيفها من خلال التحكم السليم في قوة الانقباض الخلوية. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لاستخدام تقنية جديدة لفحص الانقباض القائم على الصفائح الدقيقة تعرف باسم الأسطح القابلة للانكماش المطاطي (FLECS) ، والتي توفر تحليلا مبسطا وبديهيا لانقباض الخلية الواحدة بطريقة واسعة النطاق. هنا ، نقدم بروتوكولا تدريجيا للحصول على منحنيين من ست نقاط للجرعة والاستجابة يصفان تأثيرات اثنين من مثبطات الانقباض على تقلص خلايا العضلات الملساء الأولية للمثانة البشرية في إجراء بسيط باستخدام صفيحة دقيقة واحدة فقط من فحص FLECS ، لإظهار التقنية المناسبة لمستخدمي الطريقة. باستخدام تقنية FLECS ، يمكن لجميع الباحثين الذين لديهم مختبرات بيولوجية أساسية وأنظمة الفحص المجهري الفلوري الوصول إلى دراسة هذا النمط الظاهري الأساسي للخلية الوظيفي ولكن يصعب تحديده كميا ، مما يقلل بشكل فعال من حاجز الدخول إلى مجال بيولوجيا القوة والفحص الظاهري لقوة الخلية الانقباضية.

ويبين الشكل 3 مناطق الصور التي تم الحصول عليها من الآبار التي عولجت ب DMSO فقط وتلك التي عولجت ب 40 ميكرومتر من البليبيستاتين. يمكن ملاحظة بوضوح أن الخلايا المعالجة ب DMSO فقط تظهر مستوى كبيرا من الانكماش بناء على التشوهات البارزة جدا للأنماط الدقيقة التي تلتزم بها خلايا العضلات الملساء في المثانة (BSMCs) في هذا البئر. وعلى العكس من ذلك، في صورة المعالج جيدا ب 40 ميكرومتر بليبيستاتين، لوحظ استرخاء كبير للخلايا7 حيث أن الأنماط الدقيقة التي تلتزم بها BSMCs لا يمكن تمييزها تقريبا في الحجم عن الأنماط الدقيقة التي لا تلتزم بها الخلايا، مما يشير إلى الحد الأدنى من الانقباض. توضح هذه الصور التمثيل البصري البديهي والواضح لانقباض الخلية الواحدة الذي توفره طريقة النقش المجهري الفلورية. على عكس الطرق القائمة على TFM ، حيث تهدف الحركة متعددة الاتجاهات للعديد من جزيئات الفلورسنت الموزعة عشوائيا تحت طبقة أحادية الخلية الكثيفة إلى نقل قوة الانقباض النسبية ، هنا ، توفر الهندسة التعاقدية الموحدة والملحوظة للأنماط الدقيقة معلومات نوعية فورية وسهلة التفسير حول تقلص الخلايا الفردية. يمكن تحديد هذه الكمي مباشرة من خلال تطبيق عمليات الكائنات الثنائية القياسية على الصور.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig03.jpg"> الشكل 3: مقارنات جنبا إلى جنب للصور الملتقطة للآبار التي تحتوي إما على 1٪ فقط من معالجة DMSO (يسار) أو تحتوي على 40 ميكرومتر من blebbistatin (يمين). يمكن ملاحظة بوضوح أن العلاج باستخدام blebbistatin يقلل بشكل كبير من انقباض الخلايا المفردة كما هو موضح في الأنماط الدقيقة الأكبر وغير المتعاقد عليها. تشير النوى الزرقاء إلى الأنماط الدقيقة التي ترتبط بالخلايا. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
من خلال تطبيق وحدة التحليل القائمة على المتصفح لتحليل أزواج الصور المكتسبة من الأنماط الدقيقة ونوى الخلايا ، يتم الحصول على توزيعات انقباض الخلية الواحدة لكل مجموعة سكانية كما هو موضح في الشكل 4. ويعمل التحليل، الموصوف بالتفصيل في تقرير سابق عن منهجية FLECS15، من خلال تحديد مواقع واتجاهات كل نمط مجهري على شكل حرف "X"، وحساب عدد النوى الملتصقة مباشرة فوق مركز كل نمط مجهري، وحساب متوسط طول كل نمط مجهري، وحساب مسافة البكسل لتقلص كل نمط مجهري فيما يتعلق بمتوسط طول الأنماط الدقيقة الفارغة (مرجع الانكماش الصفري). لذلك ، تخدم الأنماط الدقيقة الفارغة غرضا مهما لتطبيع بيانات الانكماش. الأهم من ذلك ، أن الخلايا التي لا ترتبط بالأنماط الدقيقة سوف تتراكم على حدود البئر بسبب التيارات الدقيقة حيث لن تؤثر على تحليل الصور. كما رأينا في هذه المؤامرات ، فإن الانقباض غير المضطرب لسكان الخلايا الذين تتم معالجتهم فقط بعناصر تحكم DMSO يمتد على نطاق كبير يصل إلى 20 بكسل ، مع وجود مركز عند حوالي 10 بكسل. وفي الوقت نفسه ، تنقبض الخلايا المعالجة ب blebbistatin بشكل أقل بكثير ويتم دفع توزيعها إلى مركز يزيد قليلا عن 6 بكسل. الأهم من ذلك ، يتم تمثيل كل نمط مجهري واحد موجود في الصورة التي ترتبط بالضبط على الخلية في هذه التوزيعات. هذا يدل على قدرة الطريقة على نقل الاستجابات الخلوية التفاضلية للعلاجات الدوائية.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig04.jpg"> الشكل 4: رسم بياني يصور بيانات انقباض الخلية الواحدة التي تم الحصول عليها من تحليل الصور الملتقطة للآبار التي تحتوي على 1٪ DMSO فقط (أزرق) أو 40μM blebbistatin. توزيع الخلايا المعالجة ب DMSO واسع ويتمركز عند قيمة انكماش أكبر بكثير (~ 10 بكسل) من التوزيع المعالج ب blebbistatin ، مما يدل على الآثار الكمية لعلاج الخلايا مع blebbistatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
من خلال استخدام جميع الآبار على صفيحة واحدة من 24 بئرا وتصوير ما لا يقل عن 3 مواقع لكل بئر ، يتم إنشاء منحنيات استجابة الجرعة المكونة من ست نقاط في وقت واحد لمركبين دوائيين. ويبين الشكل 5 بيانات التركيز والاستجابة ل BSMCs المعالجة بنفس النطاق من جرعات blebbistatin أو cytochalasin D (كلاهما مثبطات انقباض معروفة). كما هو واضح من ملامح استجابة التركيز ، فإن cytochalasin D هو المثبط الأكثر فعالية للتقلص المنشط في هذه الخلايا. من خلال تركيب منحنى سيني مع نقاط البيانات ، يمكن حساب قيم IC50 لكل دواء. تشير تجاربنا إلى أن IC50 هي 7.9 ميكرومتر و 100 نانومتر للبليبيستاتين والسيتوكالاسين D ، على التوالي ، بعد حوالي 30 دقيقة من التعرض للأدوية. الأهم من ذلك ، بشكل عام ، أن هذه القيم تتوافق مع التقارير السابقة ، مما يؤكد الدقة الكمية للطريقة لتحديد فعالية مثبطات الانكماش7,21.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig05.jpg"> الشكل 5: منحنيات استجابة التركيز التي تصور آثار blebbistatin و cytochalasin D على الانقباض الخلوي في الخلايا المفردة. تتكون كل نقطة بيانات من ثلاث صور لهذه الحالة. كان المنحنى السيني مناسبا لكل مجموعة من البيانات. تشير النتائج إلى أن cytochalasin D أكثر قوة ، وله قيمة IC50 أقل. هذه البيانات قابلة للجمع من لوحة FLECS واحدة من 24 بئرا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers at JoVE.com

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

يقدم هذا العمل بروتوكولا مرنا لاستخدام تكنولوجيا الأسطح المرنة القابلة للانكماش (FLECS) ذات العلامات الفلورية في شكل ميكروويل من أجل تحديد كمي مبسط وغير مباشر لقوى الانقباض أحادية الخلية استنادا إلى الإزاحة المرئية للأنماط الدقيقة للبروتين الفلوري.

تحليل مبسط وعالي الإنتاجية لانقباض الخلية الواحدة باستخدام اللدائن المطاطية ذات الأنماط الدقيقة

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

القوى الميكانيكية الناتجة عن الخلايا ضرورية للوظيفة المناسبة في مختلف الأعضاء في جميع أنحاء الجسم. بالإضافة إلى الأمعاء المثانة والقلب وغيرها. يجب أن تولد هذه الأعضاء أنماطا مستقرة من تقلص الخلايا والاسترخاء ، للحفاظ على حالة مرقئ داخلي.يمكن أن يؤدي تقلص خلايا العضلات الملساء غير الطبيعي إلى ظهور اضطرابات مختلفة ، بما في ذلك خلل الحركة المعوي الذي يميز الأنماط غير الطبيعية للأمعاء مع تقلص العضلات ، وكذلك حالات مثل فرط النشاط أو ضعف نشاط المثانة. وفي مجرى الهواء ، يمكن لبعض خلايا العضلات التي تنقبض على أي أنماط غير منتظمة أن تؤدي إلى فرط الاستجابة الربو. من الواضح أن آليات الانقباض داخل الخلايا والأنسجة يمكن أن تؤدي إلى أمراض تتطلب خيارات علاجية.وبما أن هذه الظروف يمكن أن تنبع مباشرة من السلوكيات الانقباضية المختلة وظيفيا للخلايا، يصبح من المنطقي والضروري قياس وظيفة انقباض الخلية نفسها، عند فحص الأدوية المرشحة المحتملة. بعد التطورات الحديثة في التكنولوجيا الدقيقة ، قمنا بتطوير اختبار قائم على الألواح الدقيقة سهل الاستخدام يتيح القياسات الكمية لتقلص الخلية الواحدة. في مئات الآلاف من الخلايا تسمى flex ، والمعروفة أيضا باسم الأسطح القابلة للانكماش المطاطية المسماة بالفلورسنت.في هذا النهج ، نقوم بتضمين أنماط البروتين الفلوري الدقيقة ، وبالتالي الأفلام الناعمة ، التي تتشوه وتتقلص عندما تطبق الخلايا قوى الجر عليها. الأهم من ذلك ، أن أنماط البروتين الدقيقة تقيد موضع الخلية وشكلها ومنطقة انتشارها. ظروف الاختبار الموحدة وتسمح بقياسات بسيطة تعتمد فقط على تغييرات أبعادها.وبشكل عام، تتيح المنصة، التي تتضمن وحدة تحليل صور تعتمد على المتصفح، تحليلا مباشرا لقوة الخلايا القابلة للتعاقد دون الحاجة إلى إجراءات معالجة دقيقة أو تسجيل علامات ائتمانية، ويمكن تشغيلها من قبل أي باحث باستخدام مزارع الخلايا الأساسية والمجهر الفلوري البسيط مع تكبير منخفض. تم تصميم هذه التقنية مع وضع المستخدم النهائي في الاعتبار ، وتهدف إلى تقليل الحاجز أمام دخول أي عالم مختبر لدراسة بيولوجيا القوة الخلوية ابدأ بإضافة 20 ملليلتر من الوسائط إلى أنبوب مزمن ، والحصول على لوحة من 24 بئرا مصممة لفحص انقباض الخلايا. اضبط ماصة على 500 ميكرولتر واحصل على مصفاة خلية لمسببات الخلايا.قم بإزالة الغطاء الموجود على اللوحة المكونة من 24 بئرا ، وأمسك اللوحة على هذا النحو ، ثم تابع خلع طبقة البلاستيك الموجودة أعلى اللوحة برفق. اضبط اللوحة بعناية مرة أخرى. قم بشفط PBS من الطبقة العليا فقط من كل بئر لمنع أي انسكاب.الآن ، صف واحد في كل مرة ، قم بإزالة PBS المتبقية من البئر واملأها بسرعة ب 500 ميكرولتر من وسائط الخلايا. رج الطبق بلطف ، واضغط على جانبه لضمان تغطية الجزء السفلي بالكامل من البئر بالمحلول. بمجرد ملء جميع الآبار بالوسائط ، اضبط اللوحة على الجانب.في هذه المرحلة ، استرجع مزرعة خلاياك من الحاضنة. سنقوم بإجراء بروتوكول ارتباط قوي. الغرض من هذا البروتوكول هو إنشاء تعليق من 50،000 خلية لكل ملليلتر.قبل بذر الخلايا ، تأكد من إجهاد خلاياك مرة واحدة من خلال المصفاة ، من أجل تفتيت كتل الخلايا إلى خلايا مفردة ، ضع بعناية 500 ميكرولتر من محلول الخلية في كل بئر. بعد بذر الخلايا ، من المهم ترك الألواح تجلس لمدة ساعة حتى تتمكن الخلايا من الاستقرار مباشرة على الأنماط. بعد مرور ساعة ، ضع اللوحة في حاضنة بين عشية وضحاها.يتكون الجزء الثاني من التجربة من إضافة الأدوية إلى صفيحة البئر 24 والتصوير الفلوري للصفيحة. بالنسبة لهذا الجزء من البروتوكول ، لدينا متطلبان مهمان لضمان بقاء الخلايا القوية واستجابتها. الأول هو أن التركيز النهائي ل DMSO في الآبار ذات الخلايا لا يزيد عن 1٪ مما يعني أننا بحاجة إلى إجراء تخفيف كامل 100 من مخزوناتنا الدوائية.والثاني هو أننا لا نستطيع إضافة DMSO مباشرة إلى الآبار لأنه سوف يتحطم إلى أسفل هذا الخلط ، ثم يضر الخلايا ذات التركيز العالي المستوى. بدلا من ذلك ، يجب علينا إنشاء حل وسيط من دواء DMS0 والوسائط ، بحيث يمكننا مزجه معا تماما لتجنب التعرض المحلي العالي ل DSSO للخلايا. في هذا البروتوكول ، سنقوم بإجراء تخفيف ثماني مرات من ست خطوات يغطي نطاقا من 40 ميكرومولار وصولا إلى واحد نانو مولار إنشاء سلسلة تخفيف ثماني ثماني خطوات من ست خطوات عن طريق نقل 30 ميكرولتر من محلول الدواء المخزون إلى أحجام متتالية من 210 ميكرولتر من DMSO والخلط الدقيق بين كل خطوة نقل في تجربتنا ، سنقوم بتقييم تأثير blebbistatin.على المثانة البشرية من خلال خلايا العضلات. من أجل تلبية كلا الشرطين ، سنقوم أولا بإنشاء دواء وسيط DMSO وحل إعلامي. وهذا يؤدي إلى تخفيف 16.7 أضعاف من DMSO.ثم سنضيف هذا المحلول الدوائي الوسيط إلى خلايانا ، باستخدام نسب تنتج تخفيفا إضافيا بمقدار ستة أضعاف ، مما يؤدي إلى تخفيف إجمالي 100 كامل وتركيز نهائي بنسبة 1٪ DMSO لتحقيق ذلك ، لكل محلول دوائي مخزون ، امزج 30 ميكرولتر من الدواء في 470 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا ، ثم انقل 200 ميكرولتر من هذا المحلول الوسيط إلى البئر المناسب على لوحة 24 بئرا ، الذي يحتوي على 1000 ميكرولتر في كل بئر. ينتج عن ذلك بشكل جماعي تركيز نهائي بنسبة 1٪ من DMSO Incubate لفترة زمنية مناسبة. في تجربتنا ، نحتضن لمدة 30 دقيقة ، عندما تكون مستعدا للتصوير ، أضف بقعة نووية حية في جميع أنحاء آبارك ، أضف تخفيفا واحدا إلى 10،000 من المخزون.اتركه يحتضن لمدة 15 دقيقة إضافية. عندما تكون مستعدا للتصوير، ستحتاج إلى مجهر فلورسنت مجهز لتصوير القنوات الفلورية لكل من نوى الخلايا المسماة وصبغة الفلورسنت. يتم تصنيف الأنماط الدقيقة التي في مثالنا هي قناة tri C.الآن ، سنكون نوى blebbistatin تصوير الفلورسنت من أجل تحديد الخلايا المفردة ، تأكد من تصوير نوى الخلايا البقعة في نفس الموضع بالضبط كما ترى النمط الجزئي بحيث يمكن محاذاتها أثناء التحليل. قم بتحميل الصور التي تم الحصول عليها إلى جهاز الكمبيوتر الخاص بك ، تأكد من أن الصور يتم تصنيفها بشكل صحيح ، بحيث تنتهي قنوات النمط بتسطير PT. وتنتهي الصور في القناة النووية بتسطير دابي. الآن ، سنقوم بتحويل صور tif إلى صور PNG ، باستخدام الصورة J بمجرد فتح الصورة J ، يتم تحميلها في قناة واحدة في كل مرة.سنقوم أولا بتحميل قناة النمط وضبط التباين ، من أجل زيادة الإشارة إلى أقصى حد ، وتقليل الخلفية. بالإضافة إلى ذلك ، سنقوم بتنعيم الصورة. بمجرد تعديل الصورة حسب رغبتنا ، سنقوم بعد ذلك بتغيير نوع الصورة إلى ثمانية بت.ثم قم بتصدير الصورة كنوع PNG. ثم حدد المربع، واستخدم تسميات الشرائح كأسماء ملفات. إنشاء مجلد جديد يسمى PNGs.ثم احفظ ملفات PNG هناك ، لتحليل الصور ، انتقل إلى Biodock dot الذكاء الاصطناعي ، وقم بإنشاء حساب واتصل بالمؤلفين للحصول على وصول مجاني إلى وحدة التحليل. قم بتسجيل الدخول بمجرد إنشاء حسابك. هنا ستتمكن من تحميل صور جديدة.سنسمي هذه الدفعة الجديدة ، بيانات تجربة الويب JoVE. الآن ، يمكننا استيراد الصور عن طريق سحبها ثم إسقاطها ، والضغط على OK.At هذه النقطة ، وحدد بياناتك. ثم انقر فوق تحليل، مرر لأسفل إلى الوحدة النمطية المسماة تحليل الانقباض ثم اضغط على تحديد.اضبط التكبير على نفس القيمة التي استخدمتها للتصوير بمجرد اكتمال البيانات ، انقر فوقها ثم يمكننا تحديد تنزيل البيانات. بمجرد تنزيل البيانات ، يمكننا بعد ذلك رؤية أزواج الصور المتراكبة لكل صورة تم إدخالها. لدينا أيضا إمكانية الوصول إلى إحصائية موجزة من شأنها أن تعطينا متوسط الانكماش لكل مجموعة من الخلايا.وحدة قياس الانكماش بالبكسل. بالنظر إلى البيانات ، يمكننا أن نرى هنا أنه في الآبار المعالجة ب DMSO فقط ، كان هناك تقلص أعلى بكثير للخلايا مقارنة بتلك الخلايا التي عولجت ب blebbistatin. لدينا أيضا إمكانية الوصول إلى البيانات لكل نمط واحد ، تم اكتشافه في أي من الصور.هذا يعطينا معلومات مفصلة فيما يتعلق بموقع الصورة ، وأصل الصورة ، ونوع الموضع ، وعدد الخلايا ، إما صفر واحد أو أكثر من واحد ، وحجم النمط الجزئي ، والانكماش المحسوب للخلايا. يتكون هذا الوضع من كل نمط محدد داخل اللوحة الصغيرة. كانت أنماط الخلايا المفردة من هذه القائمة متوسطة لحساب متوسط الانكماش لصورة PNG في الملف الآخر.يمكنك فرز بيانات الخلية الواحدة وتحليلها حسب الحاجة لتجربتك. بالنسبة لهذا الجزء من الفيديو ، سنعرض بيانات تمثيلية يمكن جمعها من صفيحة من 24 بئرا تعرض بيانات الاستجابة هذه من خلايا العضلات الملساء في المثانة المعالجة بعقارين مختلفين. هذه صور للآبار المعالجة ب DMSO و blebbistatin على التوالي.هنا ، يمكننا أن نرى أن الخلايا المعالجة باستخدام DMSO فقط ، تعرض عددا كبيرا من الأنماط الدقيقة التعاقدية ولكن الخلايا المعالجة ب blebbistatin كانت أكبر ومفتوحة لملاحظة أن هناك انكماشا أقل. تعرض البيانات الواردة في هذا الرسم البياني انقباض خلية التباين نتيجة للعلاجات المختلفة للخلايا. مركز توزيع الخلايا المعالجة بالبليبيستاتين أقل من مركز توزيع الخلايا التي عولجت باستخدام DMSO.وهذا يتفق مع المعلومات المعروضة في الصور السابقة. لأن الخلايا التي عولجت ببليبيستاتين أظهرت انكماشا أصغر بكثير. هذا يدل على أن العلاج مع blebbistatin يريح الخلايا بشكل كبير.تساهم كل مجموعة من مجموعات البيانات هذه في نقطة على منحنى استجابة الجرعة يمكن جمعها من صفيحة واحدة من 24 بئرا ، باتباع البروتوكولات الموضحة في الفيديو. هنا ، يمكننا أن نرى أن cytochalasin D أكثر فعالية من blebbistan كما هو موضح في القيم المنخفضة للانكماش ، بالنظر إلى تركيزات الدواء الأعلى. إذا كنت ترغب في توسيع نطاق تجاربك بشكل كبير ، يتوفر إصدار لوحة 384 جيدا ، ويمكن استخدام ذلك مع الأتمتة لتوسيع نطاق التجارب بشكل كبير.يمكن جمع هذه البيانات من صفيحة بئر 384 ، بدلا من وجود ست خطوات تخفيف لكل دواء على لوحة البئر 24 ، تسمح لنا لوحة البئر 384 بإجراء 20 خطوة تخفيف لكل دواء مع نسخ متماثلة متعددة. تكنولوجيا رقاقات الثلج فريدة من نوعها. يسمح بتصور تقلص الخلية الواحدة باستخدام الفحص المجهري ، وهو أمر مستحيل حتى الآن.لذلك ، تعتمد التكنولوجيا على شكل مقاييس منقوشة بالبروتين المسمى بالفلورسنت. النمط المنهجي هو تشكيل للانكماش الخلوي ويسمح بقياس دقيق لتعديل عقد النمط الظاهري بواسطة أي دواء معين. بالطبع ، لا تزال هذه التكنولوجيا قيد التطوير بنشاط للتطبيقات والعديد من مجالات الأمراض المختلفة ، مثل الربو وأمراض القلب والأوعية الدموية والأورام المناعية الالتهابية ، وبالطبع ، أي من مؤشرات مرضنا حيث يلعب الانكماش الخلوي غير الطبيعي دورا رئيسيا في تطور المرض.كما نوضح هذه التكنولوجيا القائمة على النقش الجزئي لقياس انقباض الخلية ، فإنها توفر بديلا مبسطا للفحص المجهري التقليدي لقوة الجر ، مما يوفر تحليلا بديهيا ، ويراقب تقلص النمط ، ويوفر دقة خلية واحدة في مجموعات كبيرة من الخلايا. بعض الاعتبارات ، قد تشكل هذه الطريقة تحديات لاستخدام الخلايا التي تكون إما صغيرة جدا ، مثل الخلايا التائية والعدلات ، أو أنواع الخلايا التي لا تلتصق بها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخلايا التي ترتبط أسبوعيا ، أو ترتبط ببعضها البعض في الغالب أو التي لا تنتشر تماما ، لن تنتج إشارات انقباضية قابلة للقياس.يجب على مستخدمي التكنولوجيا تقييم مختلف التركيبات المتوسطة المحتملة لزراعة الخلايا بعناية لنوع الخلية الخاص بهم. كمكونات مختلفة ، قد تؤدي عوامل النمو ومستويات المصل وحساسيات الأس الهيدروجيني إلى سلوكيات متغيرة. يجب أن يستمر تحسين البروتوكولات في توسيع نطاق أي سير عمل تجريبي.في نهاية المطاف ، إذا لم تكن دقة الخلية الواحدة ضرورية ، أو إذا كان نوع الخلية المستهدفة لديه الحد الأدنى من القدرة على الانتشار ، فيمكن استخدام طرق الفحص المجهري التقليدية لقوة الجذب لمثل هذه التجارب. وإلا فإننا نأمل أن توفر هذه الأداة وسيلة إضافية لعلماء الأحياء الخلوية لدراسة الانكماش الخلوي وإجراء دراساتهم.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

تحسن التصور والتحليل الكمي لتأثيرات الدواء باستخدام خلايا Micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

ارتفاع الإنتاجية وحيدة الخلية ومتعددة الخلية الصغيرة التغليف

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

تقييم توصيل الجينات البوليمرية الجسيمات النانوية من تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر وعالية الإنتاجية قياس التدفق الخلوي

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

فحص السمية القلبية عالي الإنتاجية باستخدام أحاديات الخلايا العضلية القلبية الناضجة المستحثة بالخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...