Name: simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers
Uploaded: 2022-04-08T13:00:00
Duration: 14 min 33 s
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实验室工作是在加州大学洛杉矶分校分子共享筛选资源（MSSR）的支持下进行的，Forcyte赞助研究活动，以及加州纳米系统研究所（CNSI）的Magnify孵化器，其中Forcyte Biotechnologies，Inc.是常驻公司。作者将根据要求向所有学术研究人员授予对 Biodock.ai FLECS分析模块的访问权限。L.H.和IP对这项工作做出了同样的贡献。

1. 第1天：准备24孔板
<ol><li>通过将20mL细胞培养基加入50mL锥形管中开始该过程。在这个实验中，使用F12火腿基培养基补充10%胎牛血清（FBS）。</li>
	<li>获得设计用于测定细胞收缩性的24孔板。将移液器设置为500μL，并获得用于细胞传代的细胞过滤器。 注：该图版可根据作者要求提供。</li>
	<li>用一只手抬起并握住盘子，然后继续从盘子顶部轻轻剥离塑料薄膜。然后小心地将盘子放回原处。</li>
	<li>打开真空吸气器，从孔中吸出顶层的磷酸盐缓冲盐水（PBS），以防止溢出。一次删除一行 PBS。一旦孔不再完全充满，请用一只手握住板，然后小心地从孔中取出其余的PBS。快速填充500μL细胞培养基。注意避免吸气器与孔底部接触。</li>
	<li>轻轻摇晃板并点击侧面，以确保孔的整个底部都用溶液覆盖。一旦所有孔都装满了介质，将板放在一边。</li>
</ol>2. 第1天：细胞接种
<ol><li>从37°C培养箱中取出带有传代7或更低的原代人膀胱平滑肌（BSM）细胞的培养瓶。在显微镜下，检查细胞形态，确保细胞已经生长到至少90%的汇合度，但汇合度低于100%。</li>
	<li>进行细胞解离方案。在无菌生物安全柜中，胰蛋白酶消化细胞2.5分钟，直到细胞分离，然后用补充血清的培养基（10%FBS）淬灭它们。</li>
	<li>一旦细胞解离，使用血细胞计数器计数细胞，并在补充血清的培养基中将细胞悬浮液稀释至约50，000个细胞/ mL。重要的是，细胞需要至少2%的血清才能附着在微图案上。</li>
	<li>在接种之前，通过40或100μm细胞过滤器将细胞悬浮液快速过滤到带有血清学移液管的50mL锥形管中，以将细胞团块分解成单个细胞。</li>
	<li>使用P1000移液器将溶液滴加到孔中的不同位置，将500μL的50，000个细胞/ mL细胞悬浮液小心地加入到板上的24个孔中的每一个中。</li>
	<li>细胞接种后，让板在室温下静置1小时，让细胞直接沉降到微图案上，而不会受到蒸发产生的微电流的影响。1小时后，将板放入37°C培养箱中过夜。在此期间，细胞将自组装并铺展在粘附微图案上，并开始发挥基础收缩水平。</li>
</ol>3. 第2天：添加测试药物
注意：含有粘附细胞的孔中二甲基亚砜（DMSO）的最终浓度不能超过1%，药物/ DMSO不能直接添加到细胞中，但应首先稀释并混合到细胞培养基的中间溶液中。
<ol><li>通过将30μL原药转移到连续的210μL体积的DMSO中并在每个转移步骤之间彻底混合，创建六步，八倍药物稀释系列。在这项工作中，在DMSO中以40μM至1nM的剂量制备了六步，八倍稀释的blebbistatin系列。</li>
	<li>对于每个储备药物溶液（从步骤3.1开始），将30μL药物混合到470μL细胞培养基中。中间溶液产生16.7倍稀释的DMSO。</li>
	<li>将200μL每种中间溶液转移到24孔板上的适当孔中（每个孔中已包含100μL培养基）。这会产生额外的六倍稀释DMSO。</li>
	<li>步骤3.2和3.3在井中共产生1%的DMSO最终浓度。</li>
	<li>将处理过的板放入37°C培养箱中适当的持续时间。对于该实验，使用30分钟的孵育。</li>
	<li>在成像之前，将Hoechst 33342活核染色液加入每个孔中（1：10，000最终稀释）。让它再孵育15分钟以标记细胞核。</li>
</ol>4. 第2天：对孔板进行成像
<ol><li>访问配备细胞核（DAPI）和微模式（TRITC）通道成像的显微镜。</li>
	<li>首先仅使用DMSO对细胞进行成像。</li>
	<li>然后聚焦并成像微模式和标记的细胞核，以识别单个细胞并确保两个通道完美对齐，以实现自动图像分析。</li>
	<li>在板上24个孔中的每个孔中的多个位置重复。可以使用4倍物镜（或可选更高）拍摄图像，以加快成像速度并获取每张图像的最大数据点。</li>
	<li>将图像导出为TIF文件，并使用ImageJ在连接Web的计算机上打开它们以分析数据。</li>
</ol>5. 实验后：图像分析
注：图像分析是使用 Biodock.ai 门户和成像软件执行的。
<ol><li>将采集的图像上传到计算机。<ol>
<li>确保对应的微图案和核图像正确命名。</li>
		<li>确保微模式映像名称全部采用“sharedCoreName_pt.tif”的形式。</li>
		<li>确保核映像名称全部采用“sharedCoreName_dapi.tif”的形式。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用 ImageJ 将图像从 TIF 转换为 PNG。<ol>
<li>打开 ImageJ 后，一次加载一个通道。对于此实验，首先将微模式图像作为堆栈加载到 ImageJ 中。</li>
		<li>使用 图像>调整>亮度/对比度，调整图像亮度以强调微图案并将背景减少为黑色。除此之外，还要平滑图像。</li>
		<li>使用 图像>类型> 8 位， 将图像转换为 8 位。</li>
		<li>然后将图像导出为 PNG 类型，并选中切片级别作为文件名的框。现在创建一个新的文件夹PNG，并以相同的名称保存其中的PNG文件。</li>
		<li>对原子核图像重复此过程。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将PNG图像对上传到图像处理软件中进行分析。<ol>
<li>创建并验证帐户。作者有一个帐户，用于启用对学术用户的开放访问。</li>
		<li>通过联系作者来验证帐户。</li>
		<li>登录软件。</li>
		<li>在左侧 的数据 选项卡下，单击 批量上传。</li>
		<li>通过将图像对拖放到弹出的窗口中并命名批来处理图像，导入图像。单击“ 确定”。</li>
		<li>选中批次名称旁边的框，然后单击 分析。</li>
		<li>在下一个屏幕上，向下滚动并选中 “收缩力分析 ”旁边的框，然后单击“ 选择”。在页面下方，从下拉菜单中选择 10x 作为用于成像的放大倍率。<ol>
<li>单击“提交”。数据分析显示为“已完成”后，单击批次名称。在下一个屏幕上，单击页面右侧的下载数据。 注意：下载的文件将包含分析的图像，报告每个图像中平均收缩的摘要结果，以及对任何图像中检测到的每个微图案的详细分析，报告它们的大小，位置，粘附的细胞数量和收缩。</li>
			<li>根据药物浓度绘制收缩值，以生成浓度 - 响应曲线并确定不同处理的相对效力。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+abnormal+intestinal+motility+in+inflammatory+bowel+disease:+How+smooth+muscle+contraction+is+reduced.">Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).</li><li>Peyronnet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+review+of+overactive+bladder+pathophysiology:+On+the+way+to+tailored+treatment.">A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment.</a> European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).</li><li>Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underactive+bladder:+Pathophysiology+and+clinical+significance.">Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance.</a> Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).</li><li>Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+cell+contractility+by+Ca2++signaling+and+sensitivity.">Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).</li><li>Brozovich, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+smooth+muscle+contraction+and+the+basis+for+pharmacologic+treatment+of+smooth+muscle+disorders.">Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders.</a> Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+an+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Rokhzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+measurements+of+cell+contraction+and+endothelial+barrier+function.">high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function.</a> Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).</li><li>Park, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell+microarray+platform+for+correlative+analysis+of+cell+differentiation+and+traction+forces.">A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces.</a> Journal of Visualized Experiments. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+integrin-mediated+cell+contractility+by+fibronectin+polymerization.">Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).</li><li>Toli&#263;-N&#248;rrelykke, I. M., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+in+smooth+muscle+cells+varies+with+cell+spreading.">Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading.</a> Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).</li><li>Ye, G. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+strength+of+vascular+smooth+muscle+myocytes+is+shape+dependent.">The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent.</a> Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).</li></ol>

I.P.是保护FELCS技术方法和系统的已颁发专利家族的发明人。I.P.，Y.W.，J.Z.，E.C.和R.H.都是Forcyte Biotechnologies，Inc.的员工，R.D.是加州大学洛杉矶分校的教授，也是Forcyte Biotechnologies，Inc.的联合创始人。

这种简化的方法可以在不同的处理条件下一次定量测量数十万个细胞的收缩，并且仅使用标准的显微镜仪器，为研究人员研究细胞力生物学提供了传统TFM的可访问替代方案。由于所提出的技术通过分析规则形状的荧光微图案的变化提供了细胞收缩的视觉显示，因此可以直观地理解任何给定细胞产生的收缩幅度 - 微模式越小，细胞施加的收缩力就越大。
值得注意的是，通过提供对构成微图案的形状，扩散面积和粘附分子（已知调节细胞收缩性的所有因素22，23，24）等因素的控制，所提出的技术系统地消除了可能混淆细胞收缩研究解释的其他变量。
在该实验中，凝胶中使用10 kPa刚度，并使用由IV型胶原蛋白组成的70μm（对角线长度）微胶管。除了这些参数外，粘合分子还可以用各种胶原蛋白，纤连蛋白，明胶和其他细胞外基质（ECM）代替。凝胶的刚度可以调低至0.1 kPa，并达到MPa范围。微图案几何形状可以从头设计为任何形状，最小特征尺寸约为5μm。这些参数是解耦的，可以针对特定的生物学环境进行独立优化。
该技术已被广泛验证与间充质表型的高度粘附性和收缩性细胞类型相容，包括各种平滑肌细胞类型（原发性人膀胱，肠，气管，支气管，子宫，主动脉和动脉），间充质干细胞及其分化后代，各种成纤维细胞（肺，真皮和心脏），肌成纤维细胞和内皮细胞。此外，单核细胞衍生的巨噬细胞也会在微胶片上产生较大的可测量吞噬力，特别是如果微胶片由已知的调取素组成。也可以使用该方法测定各种癌症谱系。
该方法可能对相对较小的细胞（例如T细胞和嗜中性粒细胞）或具有主要上皮表型的细胞类型的使用构成一些挑战。其主要原因是该方法依赖于细胞在微图案上的强粘附力和完全扩散，以产生可测量的收缩信号。结合弱，相互结合或未完全扩散的细胞不会产生可测量的收缩信号。这些行为相对罕见，可以通过将微图案大小调整得更小，或者通过在微图案内使用替代粘合剂分子来缓解，这些分子将更好地促进这些细胞中的粘附和扩散。
该技术的用户必须仔细评估不同可能的细胞培养基配方，以适应他们感兴趣的特定细胞类型，因为不同的组分，生长因子，血清水平和pH敏感性可能驱动不同细胞中的可变行为。方案的优化应在任何实验工作流程的缩放之前进行，并且培养基组件应始终是新鲜的，无菌的，并且与先前的批次一致。
最终，如果单细胞分辨率对于用户的目标不是必需的，或者如果目标细胞类型具有最小的扩散能力，那么传统的TFM可能同样或更适合这样的实验。作者的目标和希望是，该工具为细胞生物学家研究细胞收缩提供了另一条途径，特别是在自动化高通量表型药物筛选的背景下。
具体到药物筛选的未来用途，可以使用更高通量的板，例如384孔FLECS板。在这样的板中，许多显微镜上的4倍物镜可以在其视野中捕获整个单个孔，确保捕获所有细胞收缩反应。通过使用高通量成像系统，可以在大约5分钟内对整个384孔板进行成像，使该系统比其他选项快得多，因此适用于高通量表型药物的发现。事实上，作者经常使用自动化在约50个384孔板（总计超过19，000个孔）上每周运行药物筛选。

细胞产生的机械力对于全身各个器官（如肠道，膀胱，心脏等）的正常功能至关重要。这些器官必须产生稳定的细胞收缩和松弛模式，以维持内部稳态。异常平滑肌细胞 （SMC） 收缩可导致各种疾病的发作，例如，包括肠道运动障碍，其特征在于肠平滑肌收缩模式异常1，以及膀胱过度活跃2 或膀胱功能不活跃的泌尿系统疾病3。在气道内，表现出不规则收缩模式的SMC可引发哮喘性高反应4，可能收紧气道并减少进入肺部的氧气气流。另一种普遍的身体状况，高血压，是由血管内平滑肌收缩的波动引起的5。显然，细胞和组织内的收缩机制可能导致需要治疗方案的疾病。由于这些条件明确无误地源于细胞的功能失调的收缩行为，因此在筛选潜在的候选药物时，测量细胞收缩功能本身变得合乎逻辑且必要。
认识到需要工具来研究细胞收缩力，学术研究人员已经开发了几种定量收缩测定方法，包括牵引力显微镜（TFM）6，微图案TFM7，浮动凝胶测定8和弹性微后测定9。这些技术在众多研究中已被用于单培养皿形式和多孔板形式，甚至被提议用于三维力测量10，11，12，13，14。虽然这些技术在细胞力生物学的广泛领域内实现了开创性研究，但它们在很大程度上仅限于具有特定能力和资源的实验室，特别是：制造TFM底物的能力，正确应用复杂和非直观算法来解决TFM位移图的能力，以及相对精确的显微镜系统，可以记录从载物台取出样品之前和之后拍摄的图像（用于细胞解离）。因此，对于未经培训的研究人员来说，鉴于应用这些技术的广泛要求，使用这些方法的进入门槛可能相当高。此外，许多现有技术（40倍物镜或更高）所需的成像分辨率会显着限制实验通量，而批量测量技术可能会掩盖异常细胞的贡献并阻止发现更温和的收缩差异。值得注意的是，据作者所知，只有低通量和半定量的浮动凝胶测定方法已经足够成熟，可供研究人员使用（见图1）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig01.jpg"> 图1：FLECS技术方法的整体示意图。 （A）细胞粘附在粘合蛋白微图案上，这些微图案共价嵌入到由玻璃支撑的薄弹性层中。（B）各种可能的微图案形状的俯视图和收缩“X”形微图案的细胞的爆炸。（C）覆盖收缩细胞的荧光微图案和相差图像。（D） 单个收缩单元的时程图像。比例尺 = 25 μm。这个数字是在普什卡斯基等人15的许可下改编的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
继微技术的最新进展之后，作者开发了一种基于微孔板的技术，可以定量测量数十万个细胞中的单细胞收缩，称为FLECS（荧光标记的弹性收缩表面）15，16，17，18，19，20，作为 TFM 的替代方案。在这种方法中，荧光蛋白微图案被嵌入软膜中，当细胞以直观和可测量的方式向它们施加牵引力时，软膜会变形和收缩。重要的是，蛋白质微模式限制了细胞的位置，形状和扩散区域，从而导致均匀的测试条件。这些允许仅根据其尺寸变化进行简单测量，即使在4倍放大倍率图像中，这些变化在空间上也具有高度分辨性。该方法包括基于浏览器的图像分析模块，可以直接分析收缩细胞力，而无需精细的处理程序或信托标记物的注册，因此任何具有基本细胞培养设施和低放大倍率的简单荧光显微镜的研究人员都可以操作它（图2).这项技术是现成的，可商用，在设计时考虑到了最终用户，旨在降低任何实验室科学家研究细胞力生物学的进入门槛。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig02.jpg"> 图2：用于单细胞收缩力测定的24孔板格式的示意图。 这种格式用于本文描述的实验中，并在本文的视频部分进行了描述。比例尺 = 25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
在这项工作中，我们提出了一种方案，用于应用FELCS技术平台的24孔板格式来量化力调节药物对原发性膀胱平滑肌细胞中细胞收缩力的影响。这种通用方案可以根据需要进行调整和修改，以考虑各种其他时间尺度，细胞类型和感兴趣的治疗条件，并进行缩放以回答力生物学中的其他问题。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bladder smooth muscle cell culture</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td>Ham&#39;s F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7201432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FB012941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>ImageXpress Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcyte-manufactured 24-well plate</td>
			<td>Forcyte Biotechnologies</td>
			<td>24-HC4R-X1-QB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 3342 Live Nuclear Stain</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers

细胞收缩力的产生是几乎所有细胞共有的基本特征。这些收缩力对于正常发育，在细胞和组织水平上发挥作用以及调节体内的机械系统至关重要。许多生物过程都依赖于力，包括运动，粘附和单细胞的分裂，以及心脏，膀胱，肺，肠和子宫等器官的收缩和松弛。鉴于其在维持适当生理功能方面的重要性，细胞收缩力在被夸大或破坏时也会驱动疾病过程。哮喘、高血压、早产、纤维化瘢痕形成和膀胱功能不全都是机械驱动的疾病过程的例子，通过适当控制细胞收缩力，这些过程可能会得到缓解。在这里，我们提出了一种全面的方案，用于利用一种称为荧光标记弹性收缩表面（FLECS）的新型基于微孔板的收缩力测定技术，该技术以大规模的方式提供对单细胞收缩力的简化和直观分析。在本文中，我们提供了一个逐步方案，用于获得两个六点剂量反应曲线，描述两种收缩抑制剂对原发性人膀胱平滑肌细胞收缩的影响，只需使用单个FLECS测定微孔板，即可向该方法的用户展示适当的技术。使用FLECS技术，所有拥有基础生物实验室和荧光显微镜系统的研究人员都可以研究这种基本但难以量化的功能细胞表型，从而有效地降低了进入力生物学和收缩细胞力表型筛选领域的门槛。

从仅用DMSO处理的孔获得的图像区域和用40μM blebbistatin处理的图像区域并排显示在 图3中。可以清楚地观察到，仅DMSO处理的细胞表现出显着的收缩水平，这是基于该孔中膀胱平滑肌细胞（BSMC）粘附的微模式的非常突出的变形。相反，在用40μM blebbistatin处理良好的图像中，观察到显着的细胞松弛7 ，因为BSMC粘附的微图案在大小上与未被细胞粘附的微图案几乎无法区分，表明最小的收缩。这些图像展示了荧光微图案法提供的单细胞收缩性的直观和清晰的视觉表示。与基于TFM的方法不同，在TFM中，大量荧光颗粒的全向运动随机分布在致密的细胞单层下，旨在传递相对收缩力，而在这里，微模式的均匀和显着的收缩几何形状提供了关于单个细胞收缩的即时且易于解释的定性信息。这些可以通过对图像应用标准的二进制对象操作来直接量化。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig03.jpg"> 图3：仅含有1%DMSO处理（左）或含有40μM布莱比斯塔汀（右）的孔拍摄的图像的并排比较。 可以清楚地观察到，用布莱比斯塔汀治疗显着降低了单个细胞的收缩性，如较大的，未收缩的微模式所示。蓝色细胞核表示哪些微图案被细胞结合。比例尺 = 25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
通过应用基于浏览器的分析模块来分析获取的微模式和细胞核的图像对，可以获得每个群体的单细胞收缩分布，如图 4所示。在先前关于FLECS方法的报告15中详细描述，该分析的工作原理是定位每个“X”形微图案的位置和方向，计算直接粘附在每个微图案中心上的原子核数量，计算每个微图案的平均长度，并计算每个微图案收缩相对于空微图案平均长度的像素距离（零收缩参考）。因此，空的微图案对于规范化收缩数据起着重要作用。重要的是，由于微电流，不与微图案结合的细胞将积聚在孔边界上，而微电流不会影响图像分析。如这些图所示，仅使用DMSO对照处理的细胞群的无扰动收缩性跨越高达20像素的大范围，中心在10像素左右。同时，用blebbistatin处理的细胞收缩明显减少，它们的分布被推低到略高于6像素的中心。重要的是，在图像中发现的每个完全结合在细胞上的微模式都表示在这些分布中。这证明了该方法向药物治疗传达差异细胞反应的能力。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig04.jpg"> 图4：描绘单细胞收缩力数据的直方图，这些数据是从仅含有1%DMSO（蓝色）或40μM blebbistatin的孔的图像分析中获得的。 DMSO处理的细胞的分布很宽，并且比blebbistatin处理的分布大得多的收缩值（〜10像素）中心，证明了用blebbistatin处理细胞的定量效应。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
通过利用单个24孔板上的所有孔并成像每孔至少3个位点，可以同时为两种药物化合物生成六点剂量反应曲线。 图5 显示了用相同剂量的布莱比斯塔汀或胞沙拉素D（两种已知的收缩抑制剂）处理的BSMC的浓度 - 反应数据。从浓度反应谱中可以明显看出，细胞查拉素D是这些细胞中强直收缩的更有效抑制剂。通过将Sigmoid曲线拟合到数据点，可以计算每种药物的IC50 值。我们的实验表明，在暴露于药物约30分钟后，布比斯塔汀和胞沙拉素D的IC50 分别为7.9μM和100 nM。重要的是，总体而言，这些值与先前的报告一致， 验证了确定收缩抑制剂效力的方法的定量准确性7，21。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig05.jpg"> 图5：浓度 - 反应曲线，描绘了布莱比斯塔汀和细胞查拉星D对单细胞细胞收缩性的影响。 每个数据点包含该条件的三个图像。每组数据都拟合了一条sigmoid曲线。结果表明，细胞查拉素D更有效，具有较低的IC50 值。该数据可从单个24孔FLECS板收集。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

这项工作提出了一种灵活的方案，用于利用微孔格式的荧光标记弹性收缩表面（FLECS）技术，基于荧光蛋白微模式的可视化位移，对单细胞收缩力进行简化，无需干预的定量。

使用微图案弹性体对单细胞收缩力进行简化的高通量分析

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

细胞产生的机械力对于全身各个器官的正常运作至关重要。加上肠道膀胱，心脏和其他。这些器官必须产生稳定的细胞收缩和松弛模式，以维持内部止血状态。异常平滑肌细胞收缩可导致各种疾病的发作，包括肠道运动障碍的特征是肌肉收缩的肠道异常模式，以及膀胱过度活跃或功能不活跃等疾病。在气道中，一些收缩任何不规则模式的肌肉细胞会引发哮喘的超反应性。显然，细胞和组织内的收缩机制可能导致需要治疗方案的疾病。由于这些条件可能直接源于细胞的功能失调的收缩行为，因此在筛选潜在的候选药物时，测量细胞收缩功能本身变得既合乎逻辑又必要。随着微技术的最新进展，我们开发了一种用户友好的基于微孔板的测定，可以定量测量单细胞收缩。在数十万个细胞中称为flex，也称为荧光标记的弹性收缩表面。在这种方法中，我们嵌入了荧光蛋白微图案，以及软膜，当细胞对它们施加牵引力时，它们会变形和收缩。重要的是，蛋白质微观模式限制了细胞的位置，形状和扩散区域。测试条件统一，仅允许根据其尺寸变化进行简单测量。总体而言，该平台包括基于浏览器的图像分析模块，可以直接分析可收缩的细胞力，而无需精细的处理程序或信托标记物的配准，并且可以由任何研究人员使用基本细胞培养物和具有低放大倍率的简单荧光显微镜进行操作。该技术在设计时考虑到了最终用户，旨在降低任何实验室科学家研究细胞力生物学的进入门槛，首先将20毫升培养基添加到慢性管中，获得设计用于测定细胞收缩性的24孔板。将移液器设置为500微升，并获得用于细胞病原体的细胞过滤器。取下24孔板上的盖子，按原样举起板，然后继续轻轻地取下板顶部的塑料层。小心地将盘子放回原处。从每个孔中吸出顶层PBS，以防止任何溢出。现在，一次一排，从孔中取出剩余的PBS，并快速填充500微升的细胞培养基。轻轻摇晃板，然后侧轻敲，以确保整个孔的底部都覆盖着溶液。一旦所有的孔都装满了介质，将盘子放在一边。此时，从培养箱中检索细胞培养物。我们将进行一个坚实的关联协议。该协议的目的是产生每毫升50， 000个细胞的悬浮液。在接种细胞之前，请确保通过过滤器过滤一次细胞，以便将细胞团块分解成单个细胞，小心地将500微升的细胞溶液放入每个孔中。细胞接种后，重要的是让板静置一小时，以便细胞可以直接沉淀到图案上。一小时后，将盘子放入培养箱过夜。实验的第二部分包括将药物添加到24孔板中并对板进行荧光成像。对于方案的这一部分，我们有两个重要的要求来确保强大的细胞活力和反应。首先，DMSO在具有细胞的孔中的最终浓度不超过1%，这意味着我们需要从我们的药物储备中充分稀释100。第二，我们不能将DMSO直接添加到孔中，因为它会撞击到混合物的底部，然后损害高浓度的细胞。相反，我们必须创建DMS0药物和培养基的中间溶液，我们可以将其彻底混合在一起，以避免高局部DSSO暴露于细胞。在该协议中，我们将进行六步八倍稀释，涵盖从40微摩尔到一纳米摩尔的范围 通过将30微升的储备药物溶液转移到连续的210微升体积的DMSO中并在每个转移步骤之间彻底混合来创建六步八倍稀释系列在我们的实验中， 我们将评估布比司汀的效果。通过肌肉细胞在人体膀胱上。为了满足这两个要求，我们将首先创建中间药物DMSO和培养基解决方案。这产生了16.7倍的DMSO稀释度。然后，我们将该中间药物溶液添加到我们的细胞中，使用比例产生额外的六倍稀释，导致总共100个完全稀释和1%DMSO的最终浓度为了实现这一点，对于每个储备药物溶液，将30微升药物混合到470微升细胞培养基中，然后将200微升该中间溶液转移到24孔板上的适当孔中， 每个孔中含有1000微升。这总共产生1%最终浓度的DMSO孵育物，持续适当的时间。在我们的实验中，我们孵育30分钟，当您准备成像时，在您的孔上添加一个活核污渍，从储备液中加入一到10， 000稀释液。让它再孵育15分钟。当您准备成像时，您将需要一台荧光显微镜，该显微镜可以对标记的细胞核和荧光染料的荧光通道进行成像。微模式被标记为在我们的示例中是三C通道。现在，我们将对blebbistatin细胞核进行荧光成像，以识别单个细胞，确保将染色细胞核成像在与您查看微图案完全相同的位置，以便它们可以在分析过程中对齐。将采集的图像上传到您的计算机，确保图像被正确标记，以便图案通道以下划线PT结尾。核通道中的图像以下划线dapi结尾。现在，我们将使用图像 J 将 tif 图像转换为 PNG 图像 一旦图像 J 打开，一次加载一个通道。我们将首先加载图案通道并调整对比度，以便最大化信号，并最小化背景。此外，我们将平滑图像。根据我们的喜好修改图像后，我们将图像类型更改为八位。然后将图像导出为 PNG 类型。然后选中该框，使用切片标签作为文件名。创建一个名为 PNG 的新文件夹。然后将PNG文件保存在那里，要分析图像，请导航到Biodock dot AI，创建一个帐户并联系作者以免费访问分析模块。创建帐户后登录。在这里，您将能够上传新图像。我们将把这个新的批次称为Web实验数据JoVE。现在，我们可以通过拖动图像然后删除它们来导入图像，按 OK.At 此时选择您的数据。然后单击分析，向下滚动到标记为“收缩力分析”的模块，然后点击选择。将放大倍率设置为用于成像的相同值 数据完成后，单击它，然后我们可以选择下载数据。下载数据后，我们可以看到每个输入图像的叠加图像对。我们还可以访问汇总统计数据，该统计数据将为我们提供每组单元格的平均收缩率。收缩的度量单位以像素为单位。从数据中可以看出，在仅用DMSO处理的孔中，与用blebbistatin处理的细胞相比，细胞的收缩要高得多。我们还可以访问在任何图像中检测到的每个模式的数据。这为我们提供了有关图像位置，图像来源，位置类型，细胞数量，零一个或多个，微图案的大小以及细胞的计算收缩的详细信息。该铺层由微孔板内每个已识别的图案组成。此列表中的单单元格模式是平均值，用于计算其他文件中 PNG 图像的平均收缩。您可以根据实验的需要对单个细胞数据进行排序和分析。对于视频的这一部分，我们将展示从24孔板收集的代表性数据，这些数据显示了用两种不同药物治疗的膀胱平滑肌细胞的反应数据。这些是分别用DMSO和blebbistatin处理的孔的图像。在这里，我们可以看到仅用DMSO处理的细胞显示出大量的收缩微模式，但用blebbistatin处理的细胞更大，并且愿意注意到收缩较少。该直方图中的数据显示了由于对细胞的不同处理而导致的变异细胞收缩性。用布莱比司汀处理的细胞的分布中心低于用DMSO处理的细胞的分布中心。这与前面图像中显示的信息一致。因为用布莱比司汀处理的细胞表现出更小的收缩。这表明用布比司汀治疗显着放松细胞。这些数据集中的每组都有助于剂量反应曲线上的一个点，该点可以按照视频中显示的协议从单个24孔板收集。在这里，我们可以看到，鉴于药物浓度较高，胞质素D比blebbistan更有效，如较低的收缩值所示。如果您希望显著扩展实验，可以使用384孔板版本，这可以与自动化一起使用，以显着扩展实验。这些数据可以从384孔板收集，而不是对24孔板上的每种药物进行六个稀释步骤，384孔板允许我们对具有多个重复的每种药物进行20个稀释步骤。雪花技术是独一无二的。它允许使用显微镜观察单细胞收缩，这是迄今为止不可能实现的。因此，技术依赖于以荧光标记的蛋白质为图案的度量形式。系统模式是为细胞收缩而形成的，并允许精确测量任何给定药物对表型收缩的调节。当然，这项技术仍在积极开发，用于应用和许多不同的疾病领域，例如哮喘，心血管疾病，炎症免疫肿瘤学，当然还有我们的任何疾病适应症，其中异常细胞收缩在疾病进展中起着关键作用。正如我们所展示的，这种基于微观图案化的测量细胞收缩力的技术为传统的牵引力显微镜提供了一种简化的替代方案，提供了直观的分析，观察图案缩小，并在大细胞群中提供单细胞分辨率。考虑到一些因素，这种方法可能会对使用太小的细胞（例如T细胞和嗜中性粒细胞）或不粘附的细胞类型构成挑战。此外，每周结合，主要相互结合或不完全扩散的细胞不会产生可测量的收缩信号。该技术的用户必须仔细评估其特定细胞类型的不同可能的细胞培养基配方。因为不同的成分，生长因子，血清水平和pH敏感性可能驱动不同的行为。实验方案的优化应继续进行任何实验性工作流程的扩展。最终，如果不需要单细胞分辨率，或者如果目标细胞类型具有最小的扩散能力，则可以将传统的吸引力显微镜方法用于此类实验。否则，我们希望这个工具为细胞生物学家研究细胞收缩和执行研究提供额外的途径。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

改进的可视化和定量分析，药物使用Micropatterned细胞的影响

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

科研

生物工程

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

利用微流控平台的高通量蛋白质表达发生器

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