Name: simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers
Uploaded: 2022-04-08T13:00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers at JoVE.com

עבודת המעבדה נערכה בתמיכת משאב ההקרנה המשותף המולקולרי של UCLA (MSSR) שבו פורסייט מממנת פעילויות מחקר, וחממת ההגדלה במכון NanoSystems בקליפורניה (CNSI), שם פורסייט ביוטכנולוגיה בע"מ היא חברה תושבת. המחברים יעניקו גישה למודול ניתוח FLECS Biodock.ai לכל החוקרים האקדמיים על פי בקשה. ל.ה. ואיי.פי תרמו באופן שווה לעבודה זו.

1. יום 1: הכנת צלחת 24 באר
<ol><li>התחל את ההליך על ידי הוספת 20 מ"ל של מדיום תרבית התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. בניסוי זה, F12 Ham מבוסס מדיום בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) משמש.</li>
	<li>להשיג צלחת 24 היטב שנועדה לבדוק התכווצות התא. הגדר את פיפטה ל 500 μL ולקבל מסננת תא עבור העברת תאים. הערה: הצלחת זמינה מהמחברים על פי בקשה.</li>
	<li>הרימו והחזקו את הצלחת ביד אחת והמשיכו לקלף בעדינות את סרט הפלסטיק מראש הצלחת. ואז בזהירות להגדיר את הצלחת בחזרה למטה.</li>
	<li>הפעל שואב אבק ושאף את השכבה העליונה של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) מהבארות כדי למנוע שפיכה. הסר את ה- PBS שורה אחת בכל פעם. ברגע הבארות כבר לא מלא לחלוטין, להחזיק את הצלחת ביד אחת ולהסיר בזהירות את שאר PBS מן הבארות. מלא במהירות עם 500 μL של מדיום תרבית תאים. יש להקפיד להימנע ממגע בין השאיפה לתחתית הבאר.</li>
	<li>יש לנער את הצלחת בעדינות ולהקיש על הצד כדי להבטיח שכל תחתית הבאר מכוסה בתמיסה. לאחר שכל הבארות מלאות בינוני, הגדר את הצלחת בצד.</li>
</ol>2. יום 1: זריעת תאים
<ol><li>לאחזר את בקבוקון התרבות עם מעבר 7 או נמוך יותר שלפוחית השתן האנושית העיקרית חלקה תאים (BSM) מן החממה 37 °C (37 °C). תחת מיקרוסקופ, בדוק את המורפולוגיה של התאים וודא שהתאים גדלו לפחות 90% מפגש אבל פחות מ 100% מפגש.</li>
	<li>נהל את פרוטוקול ניתוק התא. בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי, טריפסין התאים במשך 2.5 דקות עד התאים מנותקים לפני מרווה אותם עם מדיום בתוספת סרום (10% FBS).</li>
	<li>לאחר שהתאים מנותקים, השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים ולדלל את ההשעיה של התא לכ -50,000 תאים / מ"ל במדיום בתוספת סרום. חשוב לציין, תאים דורשים לפחות 2% סרום כדי להתחבר micropatterns.</li>
	<li>לפני זריעה, במהירות לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 או 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם פיפטה סרולוגית כדי לשבור גושים של תאים לתאים בודדים.</li>
	<li>הוסף בזהירות 500 μL של 50,000 תאים / השעיית תא מ"ל לתוך כל אחת מ -24 הבארות על הצלחת באמצעות פיפטה P1000 על ידי חלוקת הפתרון dropwise על פני עמדות שונות בבארות.</li>
	<li>לאחר זריעת התא, תן לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת כדי לאפשר לתאים להתיישב ישירות על המיקרו-פאטרנים מבלי להיות מושפעים ממיקרו-זרמים הנוצרים על ידי אידוי. לאחר 1 שעות, מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 °C (37 °F) לילה. התאים יתאספו בעצמם ויתפשטו על פני המיקרו-פאטרנים הדביקים בתקופה זו ויתחילו להפעיל רמות התכווצות בסיסית.</li>
</ol>3. יום 2: תוספת של תרופה לבדיקה
הערה: הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בבארות המכילות תאים דבוקים לא יכול לעלות על 1% ולא ניתן להוסיף סמים / DMSO ישירות לתאים, אך יש לדלל תחילה אותו ולערבב אותו לפתרון ביניים של מדיום התא.
<ol><li>צור סדרה של שישה שלבים, שמונה פי שמונה דילול סמים על ידי העברת 30 μL של התרופה המלאי לתוך כרכים רצופים 210 μL של DMSO וערבוב יסודי בין כל שלב העברה. בעבודה זו, סדרה של שישה שלבים, שמונה פי שמונה דילול של blebbistatin מוכן במינונים הנעים בין 40 μM ל 1 nM, ב- DMSO.</li>
	<li>עבור כל פתרון תרופה מלאי (משלב 3.1), לערבב 30 μL של תרופה לתוך 470 μL של מדיום תרבית התא. פתרון הביניים מניב דילול של DMSO פי 16.7.</li>
	<li>העבר 200 μL של כל פתרון ביניים לבאר המתאימה על צלחת 24 באר (אשר כבר מכיל 100 μL של בינוני בכל באר). זה מניב דילול נוסף של פי שישה של DMSO.</li>
	<li>שלבים 3.2 ו-3.3 מניבים ביחד ריכוז סופי של 1% של DMSO בבארות.</li>
	<li>מניחים את הצלחת המטופלת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן המתאים. לניסוי זה, דגירה של 30 דקות משמשת.</li>
	<li>מיד לפני ההדמיה, הוסיפו את פתרון הכתמים הגרעיניים החיים Hoechst 33342 לכל באר (דילול סופי של 1:10,000). אפשר לו לדגור במשך 15 דקות נוספות כדי לתייג את גרעיני התא.</li>
</ol>4. יום 2: הדמיית צלחת הבאר
<ol><li>גש למיקרוסקופ המצויד כדי לדמות את הערוצים הן עבור גרעיני התא (DAPI) והן עבור המיקרו-פאטרנים (TRITC).</li>
	<li>תמונה ראשונה של התאים עם DMSO בלבד.</li>
	<li>לאחר מכן התמקדו הן במיקרו-פאטרנים והן בגרעין התא המסומן בתווית כדי לזהות תאים בודדים ולוודא ששני הערוצים מיושרים באופן מושלם כדי לאפשר ניתוח תמונה אוטומטי.</li>
	<li>חוזרים על הפעולה במיקומים מרובים בכל אחת מ-24 הבארות שעל הצלחת. ניתן לצלם תמונות עם מטרה 4x (או באופן אופציונלי גבוה יותר כדי לזרז הדמיה ולרכוש נקודות נתונים מקסימליות לכל תמונה).</li>
	<li>יצא את התמונות כקבצי TIF ופתח אותן במחשב המחובר לאינטרנט באמצעות ImageJ כדי לנתח את הנתונים.</li>
</ol>5. לאחר הניסוי: ניתוח תמונה
הערה: ניתוח תמונה בוצע באמצעות פורטל Biodock.ai ותוכנת הדמיה.
<ol><li>העלה את התמונות שנרכשו למחשב.<ol>
<li>ודא שזוגות תואמים של מיקרו-פאטרן ותמונות גרעיניות נקראים כראוי.</li>
		<li>ודא ששמות תמונות micropattern כולם לובשים את הטופס "sharedCoreName_pt.tif".</li>
		<li>ודא ששמות תמונות גרעינים מקבלים את הטופס "sharedCoreName_dapi.tif".</li>
	</ol>
</li>
	<li>המר תמונות מ- TIF ל- PNG באמצעות ImageJ.<ol>
<li>לאחר פתיחת ImageJ, טען בערוץ אחד בכל פעם. עבור ניסוי זה, טען תחילה תמונות micropattern כערימה לתוך ImageJ.</li>
		<li>באמצעות image > Adjust > בהירות/ניגודיות, התאם את בהירות התמונה כדי להדגיש את המיקרו-פאטרנים ולהפחית את הרקע לשחור. בנוסף לכך, להחליק את התמונות.</li>
		<li>באמצעות תמונה > סוג > 8 סיביות, המר את התמונות ל- 8 סיביות.</li>
		<li>לאחר מכן יצא את התמונה לסוג PNG וסמן את רמת פרוסת התיבה כשם קובץ. כעת צור תיקיה חדשה PNGs ושמור את קבצי PNG שם באותו שם עם אותו שם.</li>
		<li>חזור על תהליך זה עבור תמונות גרעינים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העלה זוגות תמונות PNG לתוכנת עיבוד התמונה לצורך הניתוח.<ol>
<li>צור ואמת את החשבון. למחברים יש חשבון המאפשר גישה פתוחה למשתמשים אקדמיים.</li>
		<li>אמת את תיק הלקוח על-ידי יצירת קשר עם המחברים.</li>
		<li>היכנס לתוכנה.</li>
		<li>תחת הכרטיסיה נתונים מימין, לחץ על העלה אצווה.</li>
		<li>יבא את התמונות על-ידי גרירה ושחרור של זוגות תמונות לתוך החלון שמופיע ונותן שם לאצווה. לחץ על אישור.</li>
		<li>סמן את התיבה לצד שם האצווה ולחץ על נתח.</li>
		<li>במסך הבא, גלול מטה וסמן את התיבה לצד ניתוח התכווצות ולחץ על בחר. בהמשך העמוד, בחר 10x כהגדלה ששימשה להדמיה מתפריט נפתח.<ol>
<li>לחץ על שלח. לאחר ניתוח הנתונים קורא הושלם, לחץ על שם האצווה. במסך הבא, לחץ על הורד נתונים בצד השמאלי של הדף. הערה: הקבצים שהורדו יכילו תמונות שנותחו, תוצאות סיכום המדווחות על התכווצות ממוצעת בכל תמונה וניתוח מפורט של כל מיקרו-פאטרן שזוהה בכל תמונה, תוך דיווח על גודלם, מיקומם, מספר התאים שנדבקו והתכווצותם.</li>
			<li>ערכי התכווצות התוויית נגד ריכוזי תרופות כדי ליצור עקומת תגובת ריכוז ולקבוע את העוצמה היחסית של טיפולים שונים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+abnormal+intestinal+motility+in+inflammatory+bowel+disease:+How+smooth+muscle+contraction+is+reduced.">Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).</li><li>Peyronnet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+review+of+overactive+bladder+pathophysiology:+On+the+way+to+tailored+treatment.">A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment.</a> European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).</li><li>Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underactive+bladder:+Pathophysiology+and+clinical+significance.">Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance.</a> Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).</li><li>Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+cell+contractility+by+Ca2++signaling+and+sensitivity.">Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).</li><li>Brozovich, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+smooth+muscle+contraction+and+the+basis+for+pharmacologic+treatment+of+smooth+muscle+disorders.">Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders.</a> Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+an+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Rokhzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+measurements+of+cell+contraction+and+endothelial+barrier+function.">high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function.</a> Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).</li><li>Park, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell+microarray+platform+for+correlative+analysis+of+cell+differentiation+and+traction+forces.">A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55362 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+with+optimized+regularization+and+automated+Bayesian+parameter+selection+for+comparing+cells.">Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells.</a> Scientific Reports. 9, 539 (2019).</li><li>Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+traction+force+microscopy:+A+new+tool+for+quantifying+cell-matrix+interactions.">Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions.</a> PLOS ONE. 6, 17833 (2011).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Pushkarsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLECS+technology+for+high-throughput+single-cell+force+biology+and+screening.">FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).</li><li>Koziol-White, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PI3K+promotes+dilation+of+human+small+airways+in+a+rho+kinase-dependent+manner.">Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).</li><li>Orfanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+airway+smooth+muscle+responses+to+contractile+agonists.">Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).</li><li>Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallization+and+biopatterning+on+ultra-flexible+substrates+via+dextran+sacrificial+layers.">Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers.</a> PLOS ONE. 9, 106091 (2014).</li><li>Yoo, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;12+facilitates+shortening+in+human+airway+smooth+muscle+by+modulating+phosphoinositide+3-kinase-mediated+activation+in+a+RhoA-dependent+manner.">G&#945;12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).</li><li>MacGlashan, D., Vilari&#241;o, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerization+of+actin+does+not+regulate+desensitization+in+human+basophils.">Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).</li><li>Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+integrin-mediated+cell+contractility+by+fibronectin+polymerization.">Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).</li><li>Toli&#263;-N&#248;rrelykke, I. M., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+in+smooth+muscle+cells+varies+with+cell+spreading.">Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading.</a> Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).</li><li>Ye, G. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+strength+of+vascular+smooth+muscle+myocytes+is+shape+dependent.">The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent.</a> Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).</li></ol>

I.P. הוא ממציא על משפחת פטנטים שהונפקה הגנה על השיטות והמערכות של טכנולוגיית FLECS. I.P., Y.W., J.Z., E.C., ו- R.H. הם כולם עובדים של Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. הוא פרופסור באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס ומייסד שותף של Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z., ו R.D. מחזיקים באינטרסים פיננסיים ב Forcyte Biotechnologies, Inc. , שהוא בעל הרישיון הבלעדי של הפטנטים לעיל ומסחור טכנולוגיית FLECS.

שיטה פשוטה זו למדידת התכווצות כמותית במאות אלפי תאים בכל פעם בתנאי טיפול שונים ושימוש במכשירי מיקרוסקופיה סטנדרטיים בלבד מספקת חלופה נגישה ל- TFM המסורתי לחוקרים ללמוד ביולוגיה של הכוח התאי. מכיוון שהטכנולוגיה המוצגת מספקת תצוגה חזותית של התכווצות תאים על ידי ניתוח שינויים במיקרו-פאטרנים פלואורסצנטיים בעלי צורה קבועה, גודל ההתכווצות המיוצרת על ידי כל תא נתון מובן באופן אינטואיטיבי - ככל שהמיקרו-פאטרן קטן יותר, כך גדל כוח ההתכווצות המופעל על ידי התא.
ראוי לציין, על ידי מתן שליטה על גורמים כגון צורה, אזור התפשטות, ומולקולת הידבקות המרכיבה את micropatterns (כל הגורמים הידועים לווסת התכווצות התא22,23,24), הטכנולוגיה המוצגת מבטלת באופן שיטתי משתנים נוספים שעשויים לבלבל פרשנויות של מחקרי התכווצות תאים.
בניסוי זה, 10 kPa נוקשות שימשה בג'ל ו 70 מיקרופטרן (אורך אלכסוני) שימש מורכב סוג של קולגן IV. מלבד פרמטרים אלה, ניתן להחליף את מולקולת הדבק בקולגנים שונים, פיברונקטין, ג'לטין ומטריצה חוץ-תאית אחרת (ECM). ניתן לכוונן את הנוקשות של הג'ל ל-0.1 kPa, ולעלות לטווח ה-MPa. ניתן לעצב את הגיאומטריה micropattern דה נובו להיות כל צורה עם גודל תכונה מינימלי של ~ 5 מיקרומטר. פרמטרים אלה מנותקים וניתן למטב אותם באופן עצמאי להקשר ביולוגי מסוים.
טכנולוגיה זו אומתה בהרחבה כדי להיות תואמת לסוגי תאים דביקים ומתכווצים מאוד של פנוטיפ מזנכימלי כולל סוגים שונים של תאי שריר חלקים (שלפוחית השתן האנושית העיקרית, מעיים, קנה הנשימה, הסימפונות, הרחם, אבי העורקים ועורקים), תאי גזע מזנכימליים וצאצאיהם המובחנים, פיברובלסטים שונים (ריאתי, עור ולב), מיופיברובלסטים ותאי אנדותל. בנוסף, מקרופאגים שמקורם במונוציטים ייצרו גם כוח פאגוציטי גדול מדיד על המיקרו-פאגוטרנים, במיוחד אם המיקרו-פאטרן מורכב מאופסונין ידוע. קווי סרטן שונים ניתן גם לבדוק באמצעות השיטה.
השיטה עשויה להציב כמה אתגרים לשימוש עם תאים קטנים יחסית כגון תאי T ונויטרופילים, או סוגי תאים עם פנוטיפ אפיתל בעיקר. הסיבה העיקרית לכך היא כי השיטה מסתמכת על הידבקות חזקה והתפשטות מלאה של תאים על פני micropattern על מנת ליצור את אות התכווצות מדיד. תאים שנקשרים בצורה חלשה, נקשרים זה לזה או אינם מתפשטים לחלוטין לא ייצרו אותות התכווצות מדידים. התנהגויות אלה, שהן נדירות יחסית, ניתנות להקלה על ידי התאמת גודל המיקרו-פאטרן כך שיהיה קטן יותר, או באמצעות מולקולות דבק חלופיות בתוך המיקרו-פאטרנים שיקדמו טוב יותר הידבקות והתפשטות בתאים אלה.
משתמשי הטכנולוגיה חייבים להעריך בקפידה ניסוחים בינוניים שונים של תרבית תאים אפשרית עבור סוג העניין המסוים שלהם, שכן רכיבים שונים, גורמי גדילה, רמות סרום ורגישויות pH עשויים להניע התנהגויות משתנות בתאים שונים. אופטימיזציה של הפרוטוקול צריכה להקדים שינוי קנה מידה של כל זרימות עבודה ניסיוניות, ורכיבי מדיה צריכים תמיד להיות טריים, סטריליים ועקביים עם אצוות קודמות.
בסופו של דבר, אם רזולוציה של תא בודד אינה נחוצה למטרות המשתמש, או אם לסוג תא היעד יש יכולת התפשטות מינימלית, ייתכן ש- TFM המסורתי מתאים באותה מידה או יותר לניסויים כאלה. מטרת המחברים ותקוותם היא כי כלי זה מספק שדרה נוספת עבור ביולוגים תא ללמוד התכווצות הסלולר, במיוחד בהקשר של מסכי סמים פנוטיפיים אוטומטיים בעלי תפוקה גבוהה.
ספציפי לשימושים עתידיים במסכי סמים, לוחות תפוקה גבוהים יותר כגון צלחת FLECS 384-well ניתן להשתמש. בלוחות כאלה, מטרות 4x על מיקרוסקופים רבים יכול ללכוד באר אחת שלמה בשדה הראייה שלהם, להבטיח כי כל התגובות התכווצות התאים נלכדים. על ידי שימוש במערכת הדמיה בעלת תפוקה גבוהה, ניתן לצלם צלחת שלמה של 384 בארות תוך כ-5 דקות, מה שהופך את המערכת הזו למהירה באופן דרמטי מאפשרויות אחרות, ולכן מתאימה לגילוי תרופות פנוטיפיות בעלות תפוקה גבוהה. ואכן, המחברים מריצים באופן שגרתי מסכי סמים שבועיים על ~ 50 384-wellplates (בסך הכל יותר מ -19,000 בארות) באמצעות אוטומציה.

כוחות מכניים שנוצרו על ידי תאים חיוניים לתפקוד תקין באיברים שונים בכל הגוף כגון המעיים, שלפוחית השתן, הלב ואחרים. איברים אלה חייבים ליצור דפוסים יציבים של התכווצות תאים והרפיה כדי לשמור על המצב ההומיאוסטטי הפנימי. התכווצות לא תקינה של תאי שריר חלקים (SMC) יכולה להוביל להתפרצות של הפרעות שונות, כולל, למשל, דיסמיוטיות מעיים, המאופיינת בדפוסים חריגים של התכווצות שרירים חלקה במעיים1, כמו גם את התנאים האורולוגיים של שלפוחית השתן הפרוע 2 או לא פעילה 3. בתוך דרכי הנשימה, SMCs המציגים דפוסי התכווצות לא סדירים יכולים לעורר hyperresponsiveness אסתמטי4, פוטנציאל הידוק דרכי הנשימה והפחתת זרימת האוויר של חמצן לתוך הריאות. מצב פיזי נפוץ נוסף, יתר לחץ דם, נגרם על ידי תנודות בהתכווצות שרירים חלקה בתוך כלי הדם5. ברור, מנגנוני התכווצות בתוך תאים ורקמות יכול להוביל למחלות הדורשות אפשרויות טיפול. כמו תנאים אלה ללא ספק נובעים התנהגויות התכווצות תפקודיות של תאים, זה הופך להיות הגיוני הכרחי כדי למדוד את פונקציית התכווצות התא עצמו, בעת סינון מועמדים פוטנציאליים לתרופה.
מתוך הכרה בצורך בכלים לחקר כוח התכווצות תאית, פותחו מספר שיטות בדיקת התכווצות כמותית על ידי חוקרים אקדמיים, כולל מיקרוסקופיה של כוח המתיחה (TFM)6, TFM7 micropatterned, בדיקות ג'ל צף8, ובדיקות מיקרופוסט אלסטומריות9. טכנולוגיות אלה נוצלו בפורמט מנה אחת, כמו גם בפורמט צלחת מרובת היטב במחקרים רבים ואף הוצעו למדידות כוח תלת מימדיות10,11,11,12,13,14. בעוד שטכנולוגיות אלה אפשרו מחקר חלוצי בתחום הרחב של הביולוגיה של כוח התא, כולן הוגבלו במידה רבה למעבדות בעלות יכולות ומשאבים ספציפיים, בפרט: יכולת לייצר מצעים של TFM, יכולת ליישם כראוי אלגוריתמים מורכבים ולא אינטואיטיביים כדי לפתור מפות תזוזה של TFM, ומערכות מיקרוסקופיות מדויקות יחסית שיכולות לרשום תמונות שצולמו לפני ואחרי הסרת מדגם מהבמה (לניתוק תאים). לכן, עבור חוקר לא מאומן, מחסום הכניסה להשתמש בשיטות אלה יכול להיות גבוה למדי בהתחשב בקבוצה הנרחבת של דרישות ליישם טכנולוגיות אלה. בנוסף, רזולוציית ההדמיה הנדרשת לטכנולוגיות קיימות רבות (יעדי פי 40 ומעלה) יכולה להגביל באופן משמעותי את התפוקה הניסיונית, בעוד שטכנולוגיות מדידה בתפזורת יכולות להסוות תרומות מתאים חריגים ולמנוע גילוי של הבדלי התכווצות מתונים יותר. שימו לב, ככל הידוע למחברים, רק גישת בדיקת הג'ל הצף הנמוך והכמותית למחצה הבשילה במידה מספקת כדי להיות זמינה לחוקרים (ראו איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig01.jpg"> איור 1: סכמטית כוללת של שיטת טכנולוגיית FLECS. (A) תאים דבקים במיקרו-פאטרנים של חלבונים דביקים המוטבעים באופן קוולנטי בשכבה אלסטומרית דקה הנתמכת על ידי זכוכית. (B) מבט עליון על צורות מיקרו-פטרן אפשריות שונות ופיצוץ של תא המתכווץ במיקרו-פאטרן בצורת 'X'. (ג) כיסוי של מיקרו-פטרנים פלואורסצנטיים ותמונות ניגודיות פאזה של תא מתכווץ. (D) תמונות קורס זמן של תא מכווץ יחיד. סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. נתון זה הותאם באישור פושקארסקי ואח ' 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בעקבות ההתפתחויות האחרונות במיקרוטכנולוגיה, המחברים פיתחו טכנולוגיה מבוססת מיקרופלט המאפשרת מדידות כמותיות של התכווצות תאים חד-תאיים במאות אלפי תאים הנקראים FLECS (משטחים אלסטומריים מכווצים בעלי תווית פלואורסצנטית)15,16,17,18,19,20 כחלופה ל-TFM., בגישה זו, מיקרו-פאטרנים של חלבונים פלואורסצנטיים מוטמעים בסרטים רכים אשר מעוותים ומתכווצים כאשר תאים מפעילים עליהם כוחות גרירה, באופן אינטואיטיבי ומדיד. חשוב לציין, מיקרופטנים חלבון להגביל את מיקום התא, צורה, ואת אזור ההתפשטות, מה שמוביל לתנאי בדיקה אחידים. אלה מאפשרים מדידות פשוטות המבוססות רק על השינויים המימדיים שלהם, אשר נפתרים מאוד מרחבית אפילו בתמונות הגדלה פי 4. השיטה כוללת מודול ניתוח תמונה מבוסס דפדפן ומאפשרת ניתוח פשוט של כוח תא מכווץ ללא צורך בהליכי טיפול עדינים או רישום של סמני נאמנות, כך שהוא צריך להיות מופעל על ידי כל חוקר עם מתקן תרבית תאים בסיסי ומיקרוסקופ פלואורסצנטי פשוט עם הגדלה נמוכה (איור 2 ). טכנולוגיה זו, המוכנה למדף וזמינה מסחרית, תוכננה תוך התחשבות במשתמש הקצה ומטרתה להפחית את מחסום הכניסה לכל מדען מעבדה לחקור ביולוגיה של כוח תאי.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig02.jpg"> איור 2: סכמטית של תבנית לוחית 24 באר עבור בדיקת התכווצות של תא יחיד. פורמט זה שימש בניסויים המתוארים במסמך זה ומתוארים בחלק הווידאו של המאמר. סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig02large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול ליישום פורמט צלחת היטב 24 היטב של פלטפורמת טכנולוגיית FLECS כדי לכמת את ההשפעות של תרופות מווסתות כוח על התכווצות התא בתאי שריר חלקים שלפוחית השתן העיקרית. ניתן להתאים ולעצב פרוטוקול כללי זה לפי הצורך כדי להסביר לוחות זמנים שונים אחרים, סוגי תאים ותנאי טיפול מעניינים אחרים, ולהגדילו כדי לענות על שאלות אחרות בביולוגיה של כוח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bladder smooth muscle cell culture</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td>Ham&#39;s F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7201432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FB012941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>ImageXpress Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcyte-manufactured 24-well plate</td>
			<td>Forcyte Biotechnologies</td>
			<td>24-HC4R-X1-QB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 3342 Live Nuclear Stain</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers

יצירת כוח התכווצות תאית היא תכונה בסיסית המשותפת כמעט לכל התאים. כוחות התכווצות אלה חיוניים להתפתחות תקינה, לתפקוד הן ברמת התא והן ברמת הרקמה, ומווסתים את המערכות המכניות בגוף. תהליכים ביולוגיים רבים תלויים בכוח, כולל תנועתיות, הידבקות וחלוקה של תאים בודדים, כמו גם התכווצות והרפיה של איברים כגון הלב, שלפוחית השתן, הריאות, המעיים והרחם. בהתחשב בחשיבותה בשמירה על תפקוד פיזיולוגי תקין, התכווצות תאית יכולה גם להניע תהליכי מחלה כאשר הם מוגזמים או משובשים. אסטמה, יתר לחץ דם, לידה מוקדמת, הצטלקות פיברוטית ושלפוחית השתן הלא פעילה הם כולם דוגמאות לתהליכי מחלה מונעים מכנית שניתן להקל עליהם עם שליטה נכונה בכוח ההתכווצות התאי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף לשימוש בטכנולוגיית בדיקת התכווצות מבוססת מיקרו-לוחית חדשנית הידועה בשם משטחים אלסטומריים אלסטומריים בעלי תווית פלואורסצנטית (FLECS), המספקת ניתוח פשוט ואינטואיטיבי של התכווצות של תא יחיד באופן בקנה מידה מאסיבי. להלן, אנו מספקים פרוטוקול צעד חכם לקבלת שתי עקומות תגובה במינון שש נקודות המתארות את ההשפעות של שני מעכבי התכווצות על התכווצות של תאי שריר חלקים שלפוחית השתן האנושית העיקרית בהליך פשוט תוך שימוש במיקרו-לוחית אחת בלבד של בדיקת FLECS, כדי להדגים טכניקה נכונה למשתמשים בשיטה. באמצעות טכנולוגיית FLECS, כל החוקרים עם מעבדות ביולוגיות בסיסיות ומערכות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מקבלים גישה לחקר פנוטיפ תאים פונקציונלי בסיסי אך קשה לכימות זה, ובכך למעשה מורידים את מחסום הכניסה לתחום הביולוגיה של הכוח וההקרנה הפנוטיפית של כוח התא המתכווץ.

אזורים בתמונות שנרכשו מבארות שטופלו ב-DMSO בלבד ואלה שטופלו ב-40 מיקרומטר בלביסטאין מוצגים זה לצד זה באיור 3. ניתן לראות בבירור כי תאים שטופלו ב- DMSO בלבד מציגים רמה משמעותית של התכווצות בהתבסס על העיוותים הבולטים מאוד של המיקרו-פאטרנים שנדבקו על ידי תאי שריר חלקים בשלפוחית השתן (BSMCs) באותה באר. לעומת זאת, בתמונה של מטופל היטב עם 40 μM blebbistatin, הרפיה משמעותית התא הוא ציין7 כמו micropatterns דבק על ידי BSMCs הם כמעט לא מובחנים בגודל מן micropatterns שאינם דבקים על ידי תאים, המציין התכווצות מינימלית. תמונות אלה ממחישות את הייצוג החזותי האינטואיטיבי והברור של התכווצות התא הבודד המוצעת על ידי שיטת המיקרו-פאטרינג הפלואורסצנטית. שלא כמו שיטות מבוססות TFM, שבהן התנועה הכל-כיוונית של חלקיקים פלואורסצנטיים רבים המופצים באופן אקראי מתחת למונולייר תאים צפופים נועדה להעביר כוח התכווצות יחסי, כאן, הגיאומטריות המכווצות האחידות והמסומנות של המיקרו-פאטרנים מספקות מידע איכותי מיידי וקל לפרשנות על התכווצות תאים בודדים. ניתן לכמת אותם ישירות על-ידי החלת פעולות אובייקט בינאריות סטנדרטיות על התמונות.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig03.jpg"> איור 3: השוואות זה לצד זה של תמונות שצולמו של בארות המכילות רק 1% טיפול DMSO (משמאל) או המכילות 40 מיקרומטר של ביביסטין (מימין). ניתן לראות בבירור כי טיפול עם blebbistatin מפחית באופן משמעותי את התכווצות של תאים בודדים כפי שצוין על ידי micropatterns גדול יותר, ללא מכווץ. גרעינים כחולים מציינים אילו מיקרו-פאטרנים קשורים לתאים. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig03large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
על-ידי החלת מודול הניתוח מבוסס הדפדפן כדי לנתח את זוגות התמונות שנרכשו של מיקרו-פאטרנים וגרעיני תאים, מתקבלות התפלגות התכווצות של תאים חד-תאיים עבור כל אוכלוסייה כפי שמוצג באיור 4. מתואר בפירוט בדו"ח קודם על מתודולוגיית FLECS15, הניתוח עובד על ידי איתור המיקום והכיוונים של כל micropattern בצורת "X", לספור את מספר הגרעינים דבוקים ישירות מעל מרכז כל micropattern, חישוב האורך הממוצע של כל micropattern, וחישוב מרחק הפיקסלים של התכווצות של כל micropattern ביחס לאורך הממוצע של micropatterns ריק (אפס התייחסות התכווצות). לכן, micropatterns ריק לשמש מטרה חשובה לנרמול נתוני התכווצות. חשוב לציין, תאים שאינם נקשרים למיקרו-פטרנים יצטברו בגבולות הבאר בשל מיקרו-זרמים שבהם הם לא ישפיעו על ניתוח התמונה. כפי שניתן לראות בחלקות אלה, ההתכווצות הבלתי מוגבלת של אוכלוסיית התאים המטופלת רק באמצעות פקדי DMSO משתרעת על פני טווח גדול של עד 20 פיקסלים, כאשר מרכז נמצא בסביבות 10 פיקסלים. בינתיים, תאים שטופלו בבלביסטן מתכווצים באופן משמעותי פחות וההפצה שלהם נדחפת למרכז של קצת יותר מ-6 פיקסלים. חשוב לציין, כל מיקרו-פאטרן שנמצא בתמונה שנקשרת בדיוק בתא מיוצג בהפצות אלה. זה מדגים את היכולת של השיטה להעביר תגובות תאיות דיפרנציאליות לטיפולים תרופתיים.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig04.jpg"> איור 4: היסטוגרמה המתארת נתוני התכווצות של תאים חד-תאיים המתקבלים מניתוח תמונות שצולמו של בארות המכילות 1% DMSO בלבד (כחול) או 40μM blebbistatin. ההתפלגות של תאים שטופלו ב- DMSO היא רחבה ומרוכזת בערך התכווצות גדול בהרבה (~ 10 פיקסלים) מאשר ההתפלגות המטופלת בבלביסטן, המדגימה את ההשפעות הכמותיות של טיפול בתאים עם blebbistatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
על ידי ניצול כל הבארות על צלחת אחת 24-well והדמיה לפחות 3 אתרים לבאר, עקומות מינון תגובה שש נקודות נוצרים בו זמנית עבור שתי תרכובות סמים. איור 5 מציג את נתוני תגובת הריכוז עבור BSMCs שטופלו באותו טווח של מינונים של blebbistatin או ציטוצ'אלסין D (שניהם מעכבי התכווצות ידועים). כפי שניתן לראות מפרופילי תגובת הריכוז, ציטוכלסין D הוא המעכב החזק יותר של התכווצות טוניק בתאים אלה. על ידי התאמת עקומה סיגמואידית לנקודות הנתונים, ניתן לחשב ערכי IC50 עבור כל תרופה. הניסויים שלנו מראים כי IC50 הם 7.9 מיקרומטר ו 100 ננומטר עבור blebbistatin ו cytochalasin D, בהתאמה, לאחר ~ 30 דקות של חשיפה לתרופות. חשוב לציין, בסך הכל, ערכים אלה עולים בקנה אחד עם דוחות קודמים, אימות הדיוק הכמותי של השיטה כדי לקבוע את העוצמה של מעכבי התכווצות7,21.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig05.jpg"> איור 5: עקומות תגובת ריכוז המתארות את ההשפעות של blebbistatin ו- cytochalasin D על התכווצות התאים בתאים בודדים. כל נקודת נתונים כוללת שלוש תמונות עבור מצב זה. עקומה סיגמואידלית התאימה לכל קבוצת נתונים. התוצאות מצביעות על כך כי ציטוכלסין D הוא חזק יותר, בעל ערך IC50 נמוך יותר. נתונים אלה ניתנים לאיסוף מלוחית FLECS אחת של 24 בארות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers at JoVE.com

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

עבודה זו מציגה פרוטוקול גמיש לשימוש בטכנולוגיית משטחים אלסטומריים (FLECS) בעלי תווית פלואורסצנטית בפורמט מיקרווול לכימות פשוט יותר של כוחות התכווצות של תאים חד-תאיים המבוססים על תזוזות חזותיות של מיקרופטרנים של חלבון פלואורסצנטי.

ניתוח פשוט בעל תפוקה גבוהה של התכווצות של תאים חד-תאיים באמצעות אלסטומרים מיקרו-מרופדים

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

תאים שנוצרו כוחות מכניים חיוניים לתפקוד תקין באיברים שונים בכל הגוף. בנוסף לשלפוחית השתן של המעיים, ללב ולאחרים. איברים אלה חייבים ליצור דפוסים יציבים של התכווצות תאים והרפיה, כדי לשמור על המצב המוסטטי הפנימי.התכווצות לא תקינה של תאי שריר חלקה עלולה להוביל להתפרצות של הפרעות שונות, כולל דיסמוטיות מעיים המאפיינות דפוסים חריגים של מעיים עם התכווצות שרירים, כמו גם תנאים כמו שלפוחית השתן הפרוע או הלא פעילה. ובערכי הנשימה, כמה תאי שריר כי לכווץ כל דפוסים לא סדירים יכול לעורר תגובת יתר אסתמטית. ברור, מנגנוני התכווצות בתוך תאים ורקמות יכול להוביל למחלות הדורשות אפשרויות טיפול.וכמו אלה יכולים תנאים נובעים ישירות התנהגויות התכווצות תפקודיות של תאים, זה הופך להיות הגיוני והכרחי כדי למדוד את תפקוד התכווצות התא עצמו, בעת סינון מועמדים פוטנציאליים לתרופה. בעקבות ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית מיקרו פיתחנו בדיקת מיקרו-לוחית ידידותית למשתמש המאפשרת מדידות כמותיות של התכווצות תא בודד. במאות אלפי תאים הנקראים flex, הידועים גם בשם משטחים אלסטומריים בעלי תווית פלואורסצנטית.בגישה זו, אנו מטמיעים דפוסי מיקרו חלבון פלואורסצנטיים, וסרטים רכים כל כך, אשר מעוותים ומתכווצים כאשר תאים מפעילים עליהם כוחות גרירה. חשוב לציין, דפוסי מיקרו החלבון מגבילים את מיקום התא, הצורה ואזור ההתפשטות. תנאי הבדיקה האחידים מאפשרים מדידות פשוטות המבוססות רק על השינויים הממדיים שלהם.בסך הכל, הפלטפורמה, הכוללת מודול ניתוח תמונה מבוסס דפדפן, מאפשרת ניתוח פשוט של כוח תא לצריף ללא צורך בהליכי טיפול עדינים או ברישום סמני נאמנות ויכולה להיות מופעלת על ידי כל חוקר עם תרביות תאים בסיסיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי פשוט עם הגדלה נמוכה. טכנולוגיה זו תוכננה תוך התחשבות במשתמש הקצה, ומטרתה להפחית את מחסום הכניסה לכל מדען מעבדה לחקור ביולוגיה של כוח תאי בגין על ידי הוספת 20 מיליליטר של מדיה לצינור כרוני, להשיג צלחת של 24 בארות שנועדה לבדוק התכווצות תאים. הגדר את הפיפטה שלך ל-500 מיקרוליטר וקבל מסננת תאים לפתוגן התא.הסר את המכסה על צלחת 24-well, להחזיק את הצלחת כמו כך, ולאחר מכן להמשיך בעדינות להסיר את שכבת הפלסטיק על גבי הצלחת. בזהירות להגדיר את הצלחת בחזרה למטה. שאפו רק PBS בשכבה העליונה מכל באר כדי למנוע דליפה.עכשיו, שורה אחת בכל פעם, להסיר את PBS הנותרים מהבאר ולמלא במהירות עם 500 מיקרוליטרים של מדיה סלולרית. נענעו את הצלחת בעדינות והקשו על צידה כדי להבטיח שכל תחתית הבאר מכוסה בתמיסה. ברגע שכל הוולס היו מלאים במדיה, הגדר את הצלחת בצד.בשלב זה, לאחזר את תרבית התא שלך מהחממה. אנחנו ננהל פרוטוקול אסוציאציה מוצק. מטרת הפרוטוקול הזה היא ליצור השעיה של 50,000 תאים למיליליטר.לפני זריעת התאים הקפד לסנן את התאים שלך פעם אחת דרך המסננת, על מנת לשבור גושי תאים לתאים בודדים, בזהירות למקם 500 מיקרוליטרים של פתרון התא שלך לתוך כל באר. לאחר זריעת התא, חשוב לתת ללוחות לשבת במשך שעה, כך שהתאים יכולים להתיישב ישירות על הדפוסים. לאחר שחלפה שעה, הניחו את הצלחת באינקובטור למשך הלילה.החלק השני של הניסוי מורכב מהוספת התרופות ללוחית 24 הבאר והדמיה פלואורסצנטית של הצלחת. עבור חלק זה של הפרוטוקול יש לנו שתי דרישות חשובות כדי להבטיח כדאיות תאים חזקים ותגובה. הראשון הוא כי הריכוז הסופי של DMSO בבארות עם תא הוא לא יותר מ 1% כלומר שאנחנו צריכים לעשות דילול מלא 100 ממניות התרופות שלנו.השני הוא שאנחנו לא יכולים להוסיף DMSO כל כך ישירות לבארות כי זה יתרסק לתחתית של ערבוב זה, ולאחר מכן לפגוע בתאים עם ריכוז ברמה גבוהה. במקום זאת, עלינו ליצור פתרון ביניים של תרופות ומדיה DMS0, שנוכל לערבב ביסודיות יחד כדי למנוע חשיפה מקומית גבוהה DSSO לתאים. בפרוטוקול זה, אנו נעשה דילול של שישה שלבים שמונה כפולים המכסה טווח מ-40 מיקרומולרים עד ל-Nano טוחנת אחת צור את סדרת הדילול של ששת השלבים הכפולים על ידי העברת 30 מיקרוליטרים של תמיסת תרופות מלאי לנפחי 210 מיקרוליטר רצופים של DMSO וערבוב יסודי בין כל שלב העברה בניסוי שלנו, אנחנו נעריך את ההשפעה של ביביסטין.על שלפוחיות אנושיות דרך תאי השריר. על מנת לעמוד בשתי הדרישות, ניצור תחילה תרופת ביניים DMSO ופתרון מדיה. זה מניב דילול של פי 16.7 של DMSO.לאחר מכן נוסיף פתרון תרופת ביניים זה לתאים שלנו, תוך שימוש בפרופורציות המניבות דילול נוסף של שישה פי שניים, וכתוצאה מכך סך של 100 דילול מלא והריכוז הסופי של 1%DMSO כדי להשיג זאת, עבור כל פתרון תרופה במלאי, לערבב 30 מיקרוליטרים של סמים לתוך 470 מיקרוליטרים של מדיום תרבית התאים, ולאחר מכן להעביר 200 מיקרוליטרים של פתרון ביניים זה לבאר המתאימה על צלחת 24-well, המכיל 1000 מיקרוליטרים בכל באר. זה באופן קולקטיבי מניב ריכוז סופי של 1% של דגירה DMSO עבור פרק הזמן המתאים. בניסוי שלנו, אנחנו מדגרים במשך 30 דקות, כאשר אתה מוכן לדמיין להוסיף כתם גרעיני חי בכל רחבי הבארות שלך להוסיף אחד ל 10, 000 דילול מהמלאי.אפשר לו לדגור במשך 15 דקות נוספות. כשתהיה מוכן לתמונה, תזדקק למיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד כדי לדמות את ערוצי הפלואורסצנט הן עבור גרעיני התא המסומנים והן עבור הצבע הפלואורסצנטי. דפוסי המיקרו מסומנים עם אשר בדוגמה שלנו הוא ערוץ tri C.עכשיו, אנחנו נהיה גרעינים blebbistatin הדמיה פלואורסצנטית על מנת לזהות תאים בודדים, הקפד לדמיין את גרעיני תאי הכתם בדיוק באותו מיקום כפי שאתה רואה את דפוס המיקרו כך שהם יכולים להיות מיושרים במהלך הניתוח. העלה את התמונות שנרכשו למחשב שלך ודא שהתמונות מסומנות כראוי, כך שערוצי התבנית מסתיימים במקף תחתון PT. ותמונות בערוץ הגרעיני מסתיימות במקף תחתון דאפי. עכשיו, אנחנו נמיר את תמונות tif לתמונות PNG, באמצעות תמונה J פעם תמונה J פתוחה, לטעון בערוץ אחד בכל פעם.תחילה נטען את ערוץ התבנית ולהתאים את הניגודיות, על מנת למקסם את האות ולמזער את הרקע. בנוסף, אנחנו נחליק את התמונה. לאחר שהתמונה שונתה לטעמנו, נשנה את סוג התמונה לשמונה סיביות.לאחר מכן יצא את התמונה כסוג PNG. לאחר מכן סמן את התיבה, השתמש בתוויות פרוסה כשמות קבצים. צור תיקיה חדשה בשם PNGs.לאחר מכן שמור את קבצי PNG שם, כדי לנתח את התמונות, לנווט אל Biodock נקודה AI, ליצור חשבון וליצור קשר עם המחברים כדי לקבל גישה חופשית למודול הניתוח. היכנס לאחר יצירת החשבון שלך. כאן תוכל להעלות תמונות חדשות.נקרא לקבוצה החדשה הזו, נתוני ניסויי אינטרנט JoVE. עכשיו, אנחנו יכולים לייבא את התמונות על ידי גרירתם ולאחר מכן שחרורם, הקש OK.At נקודה זו, בחר את הנתונים שלך. לאחר מכן לחץ על נתח, גלול מטה אל מודול שכותרתו ניתוח התכווצות ולאחר מכן לחץ על בחר.הגדר את ההגדלה לאותו ערך שבו השתמשת להדמיה לאחר השלמת הנתונים, לחץ עליו ואז נוכל לבחור נתוני הורדה. לאחר הורדת הנתונים, נוכל לראות זוגות תמונות בשכבת-על עבור כל תמונה שהוזנה. יש לנו גם גישה לסטטיסטיקה מסכמת שתעניק לנו את ההתכווצות הממוצעת עבור כל קבוצה של תאים.יחידת המידה להתכווצות היא בפיקסלים. בהסתכלות על הנתונים אנו יכולים לראות כאן כי בבארות שטופלו ב- DMSO בלבד, הייתה התכווצות גבוהה בהרבה של תאים בהשוואה לאותם תאים שטופלו בבלביסטטין. יש לנו גם גישה לנתונים עבור כל דפוס, שזוהה בכל אחת מהתמונות.זה נותן לנו מידע מפורט לגבי מיקום התמונה, מקור התמונה, סוג המיקום, מספר התאים, אפס אחד או יותר מאחד, גודל תבנית המיקרו והתכווצות המחושבת של התאים. שכבה זו מורכבת מכל דפוס מזוהה יחיד בתוך צלחת מיקרו. תבניות תא בודד מרשימה זו היו ממוצעות לחישוב ההתכווצות הממוצעת עבור תמונת PNG בקובץ האחר.באפשרותך למיין ולנתח את נתוני התא הבודד לפי הצורך לצורך הניסוי שלך. עבור חלק זה של הסרטון, אנו נציג נתונים הניתנים לאיסוף מצלחת של 24 בארות המציגות את נתוני התגובה מתאי שריר חלקים בשלפוחית השתן שטופלו בשתי תרופות שונות. אלה תמונות של בארות שטופלו עם DMSO ו blebbistatin בהתאמה.כאן, אנו יכולים לראות כי התאים שטופלו ב- DMSO בלבד, מציגים מספר רב של תבניות מיקרו חוזה אך תאים שטופלו בבלביסטן היו גדולים יותר ופתוחים לציין שיש פחות התכווצות. הנתונים בהיסטוגרמה זו מציגים את התכווצות תאי הווריאציה כתוצאה מהטיפולים השונים בתאים. מרכז ההפצה של תאים שטופלו בבלביסטין נמוך ממרכז ההפצה של תאים שטופלו ב- DMSO.הדבר עולה בקנה אחד עם המידע המוצג בתמונות הקודמות. כי התאים שטופלו עם blebbistatin הפגינו התכווצות קטנה בהרבה. זה מציין כי טיפול עם blebbistatin מרגיע באופן משמעותי את התאים.כל אחת מקבוצות הנתונים הללו תורמת לנקודה בעקומת תגובת המינון הניתנת לאיסוף מלוחית אחת של 24 בארות, בהתאם לפרוטוקולים המוצגים בסרטון. כאן, אנו יכולים לראות כי ציטוכלסין D הוא חזק יותר מאשר blebbistan כפי שמוצג על ידי הערכים הנמוכים יותר של התכווצות, בהתחשב בריכוזים הגבוהים יותר של סמים. אם ברצונך לשנות את קנה המידה המשמעותי של הניסויים שלך, קיימת גרסת לוחית באר 384, וניתן להשתמש בה עם אוטומציה כדי לשנות את קנה המידה הדרמטי של הניסויים.נתונים אלה הוא אספנות מצלחת באר 384, במקום שיש שישה שלבי דילול עבור כל תרופה על צלחת 24-well, צלחת היטב 384 מאפשר לנו לנהל 20 שלבי דילול עבור כל תרופה עם שכפולים מרובים. טכנולוגיית פתיתי שלג היא ייחודית. זה מאפשר הדמיה של התכווצות תא יחיד באמצעות מיקרוסקופיה, אשר היה בלתי אפשרי עד כה.אז, הטכנולוגיה מסתמכת על הצורה של מדדים כי הוא מעוצב עם חלבון שכותרתו פלואורסצנטית. דפוס שיטתי הוא ליצור עבור התכווצות התא ומאפשר מדידה מדויקת של אפנון של חוזה פנוטיפ על ידי כל תרופה נתונה. כמובן, טכנולוגיה זו עדיין מפותחת באופן פעיל עבור יישומים ואזורי מחלות רבים ושונים, כגון אסטמה, מחלות לב וכלי דם, אונקולוגיה חיסונית דלקתית, וכמובן, כל אינדיקציה המחלה שלנו שבו התכווצות תאית חריגה ממלאת תפקיד מרכזי בהתקדמות המחלה.כפי שאנו מדגימים טכנולוגיה מבוססת דפוס מיקרו זו למדידת התכווצות תאים מציעה חלופה פשוטה למיקרוסקופיה של כוח המתיחה המסורתי, המספקת ניתוח אינטואיטיבי, צופה בדפוס מתכווץ ומספקת רזולוציית תא בודד באוכלוסיות תאים גדולות. שיקולים מסוימים, שיטה זו עשויה להציב אתגרים לשימוש בתאים קטנים מדי, כגון תאי T ונויטרופילים, או סוגי תאים שאינם דבקים. בנוסף תאים שנקשרים מדי שבוע, נקשרים זה לזה בעיקר או שאינם מתפשטים לחלוטין, לא ייצרו אותות התכווצות מדידים.משתמשים בטכנולוגיה חייבים להעריך בקפידה ניסוחים בינוניים שונים של תרבית תאים אפשרית עבור סוג התא המסוים שלהם. כמו רכיבים שונים, גורמי גדילה, רמות סרום ורגישויות pH עשויים להניע התנהגויות משתנות. מיטוב הפרוטוקולים צריך להמשיך לשנות את קנה המידה של כל זרימות העבודה הניסיוניות.בסופו של דבר, אם אין צורך ברזולוציית תא בודד, או אם לסוג תא היעד יש יכולת התפשטות מינימלית, ניתן להשתמש בשיטות מיקרוסקופיה מסורתיות של כוח משיכה לניסויים כאלה. אחרת אנו מקווים שכלי זה מספק דרך נוספת לביולוגים של תאים לחקור התכווצות תאית ולבצע את מחקריהם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

בדיקת קרדיוטוקסיות בתפוקה גבוהה באמצעות מונושכבות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בוגרים

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...