Name: simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers
Uploaded: 2022-04-08T13:00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers at JoVE.com

Il lavoro di laboratorio è stato condotto con il supporto dell'UCLA Molecular Shared Screening Resource (MSSR) dove Forcyte sponsorizza attività di ricerca, e del Magnify Incubator presso il California NanoSystems Institute (CNSI), dove Forcyte Biotechnologies, Inc. è una società residente. Gli autori concederanno l'accesso al modulo di analisi flecs Biodock.ai a tutti i ricercatori accademici su richiesta. L.H. e I.P. hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.

1. Giorno 1: Preparazione del piatto da 24 pozzetti
<ol><li>Iniziare la procedura aggiungendo 20 mL del terreno di coltura cellulare in un tubo conico da 50 mL. In questo esperimento, viene utilizzato il mezzo a base di prosciutto F12 integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS).</li>
	<li>Ottenere una piastra a 24 pozzetti progettata per analizzare la contrattilità cellulare. Impostare la pipetta a 500 μL e ottenere un filtro cellulare per il passaggio cellulare. NOTA: La targa è disponibile presso gli autori su richiesta.</li>
	<li>Sollevare e tenere la piastra in una mano e procedere a sbucciare delicatamente il film plastico dalla parte superiore della piastra. Quindi riposizionare con cura il piatto.</li>
	<li>Accendere un aspiratore sottovuoto e aspirare lo strato superiore di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) dai pozzetti per evitare fuoriuscite. Rimuovere il PBS una riga alla volta. Una volta che i pozzetti non sono più completamente pieni, tenere la piastra in una mano e rimuovere con cura il resto del PBS dai pozzetti. Riempire rapidamente con 500 μL di terreno di coltura cellulare. Fare attenzione ad evitare il contatto tra l'aspiratore e il fondo del pozzo.</li>
	<li>Agitare delicatamente la piastra e toccare il lato per assicurarsi che l'intero fondo del pozzo sia coperto di soluzione. Una volta che tutti i pozzetti sono pieni di mezzo, impostare il piatto di lato.</li>
</ol>2. Giorno 1: Semina cellulare
<ol><li>Recuperare il pallone di coltura con passaggio 7 o più cellule primarie della muscolatura liscia della vescica umana (BSM) dall'incubatore a 37 °C. Al microscopio, controllare la morfologia cellulare e assicurarsi che le cellule siano cresciute ad almeno il 90% di confluenza ma meno del 100% di confluenza.</li>
	<li>Condurre il protocollo di dissociazione cellulare. All'interno di un armadio sterile di biosicurezza, tripsinare le cellule per 2,5 minuti fino a quando le cellule non si staccano prima di spegnerle con un mezzo integrato con siero (10% FBS).</li>
	<li>Una volta che le cellule sono dissociate, utilizzare un emocitometro per contare le cellule e diluire la sospensione cellulare a circa 50.000 cellule / mL in mezzo integrato con siero. È importante sottolineare che le cellule richiedono almeno il 2% di siero da attaccare ai micropattern.</li>
	<li>Prima della semina, filtrare rapidamente la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 o 100 μm in un tubo conico da 50 ml con una pipetta sierologica per rompere ciuffi di cellule in singole cellule.</li>
	<li>Aggiungere con attenzione 500 μL delle 50.000 celle/mL di sospensione cellulare in ciascuno dei 24 pozzetti sulla piastra utilizzando una pipetta P1000 erogando la soluzione a goccia in diverse posizioni nei pozzetti.</li>
	<li>Dopo la semina cellulare, lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora per lasciare che le cellule si depositino direttamente sui micropattern senza essere influenzate dalle microcorrenti generate dall'evaporazione. Dopo 1 ora, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C durante la notte. Le cellule si auto-assemblano e si diffondono sui micropattern adesivi durante questo periodo e iniziano a esercitare livelli di contrazione basale.</li>
</ol>3. Giorno 2: Aggiunta di farmaco di prova
NOTA: La concentrazione finale di dimetilsolfossido (DMSO) nei pozzetti contenenti cellule aderenti non può superare l'1% e il farmaco/DMSO non può essere aggiunto direttamente alle cellule, ma deve prima essere diluito e miscelato in una soluzione intermedia di mezzo cellulare.
<ol><li>Creare una serie di diluizione del farmaco in sei fasi, otto volte, trasferendo 30 μL del farmaco di riserva in volumi consecutivi di DMSO da 210 μL e mescolando accuratamente tra ogni fase di trasferimento. In questo lavoro, una serie di diluizione in sei fasi, otto volte volte, di blebbistatina viene preparata in dosi che vanno da 40 μM a 1 nM, in DMSO.</li>
	<li>Per ogni soluzione farmacologica madre (dalla fase 3.1), mescolare 30 μL di farmaco in 470 μL di terreno di coltura cellulare. La soluzione intermedia produce una diluizione di DMSO di 16,7 volte.</li>
	<li>Trasferire 200 μL di ciascuna soluzione intermedia al pozzo appropriato sulla piastra a 24 pozzetti (che contiene già 100 μL di mezzo in ciascun pozzetto). Ciò produce un'ulteriore diluizione di sei volte del DMSO.</li>
	<li>I passaggi 3.2 e 3.3 producono collettivamente una concentrazione finale dell'1% di DMSO nei pozzi.</li>
	<li>Posizionare la piastra trattata in un incubatore a 37 °C per la durata appropriata. Per questo esperimento, viene utilizzata un'incubazione di 30 minuti.</li>
	<li>Immediatamente prima dell'imaging, aggiungere la soluzione di colorazione nucleare viva Hoechst 33342 a ciascun pozzetto (diluizione finale 1:10.000). Lasciarlo incubare per altri 15 minuti per etichettare i nuclei cellulari.</li>
</ol>4. Giorno 2: Imaging della piastra del pozzo
<ol><li>Accedi a un microscopio equipaggiato per visualizzare i canali sia per i nuclei cellulari (DAPI) che per le micropattern (TRITC).</li>
	<li>Per prima cosa immagina le celle solo con DMSO.</li>
	<li>Quindi concentrarsi e visualizzare sia i micropattern che i nuclei cellulari etichettati al fine di identificare le singole cellule e garantire che entrambi i canali siano perfettamente allineati per consentire l'analisi automatica delle immagini.</li>
	<li>Ripeti in più posizioni in ciascuno dei 24 pozzetti sul piatto. Le immagini possono essere scattate con obiettivo 4x (o facoltativamente superiore per accelerare l'imaging e acquisire punti dati massimi per immagine).</li>
	<li>Esporta le immagini come file TIF e aprile su un computer connesso al Web con ImageJ per analizzare i dati.</li>
</ol>5. Post-esperimento: analisi delle immagini
NOTA: l'analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando Biodock.ai portale e il software di imaging.
<ol><li>Caricare le immagini acquisite su un computer.<ol>
<li>Assicurarsi che le corrispondenti coppie di immagini micropattern e nucleari siano denominate correttamente.</li>
		<li>Assicurarsi che i nomi delle immagini micropattern assumano tutti il formato "sharedCoreName_pt.tif".</li>
		<li>Assicurarsi che i nomi delle immagini dei nuclei assumano tutti il formato "sharedCoreName_dapi.tif".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Converti immagini da TIF a PNG usando ImageJ.<ol>
<li>Una volta aperto ImageJ, caricarlo in un canale alla volta. Per questo esperimento, caricare prima le immagini di micropattern come stack in ImageJ.</li>
		<li>Utilizzando Image > Regola > luminosità/contrasto, regola la luminosità dell'immagine per enfatizzare i micropattern e ridurre lo sfondo al nero. Oltre a questo, appiana le immagini.</li>
		<li>Utilizzando Image > Type > 8-bit, convertire le immagini in 8-bit.</li>
		<li>Quindi esportare l'immagine in tipo PNG e selezionare la casella livello di sezione come nome file. Ora crea una nuova cartella PNG e salva i file PNG lì con lo stesso nome.</li>
		<li>Ripetere questo processo per le immagini dei nuclei.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carica coppie di immagini PNG nel software di elaborazione delle immagini per l'analisi.<ol>
<li>Creare e convalidare l'account. Gli autori hanno un account per consentire l'accesso aperto agli utenti accademici.</li>
		<li>Convalida l'account contattando gli autori.</li>
		<li>Accedere al software.</li>
		<li>Nella scheda Dati a sinistra, fai clic su Carica batch.</li>
		<li>Importa le immagini trascinando e rilasciando le coppie di immagini nella finestra che si apre e assegna un nome al batch. Fare clic su OK.</li>
		<li>Selezionare la casella accanto al nome del batch e fare clic su Analizza.</li>
		<li>Nella schermata successiva, scorrere verso il basso e selezionare la casella accanto a Analisi di contrattilità e fare clic su Seleziona. Più in basso nella pagina, seleziona 10x come ingrandimento utilizzato per l'imaging da un menu a discesa.<ol>
<li>Fai clic su Invia. Una volta che l'analisi dei dati legge Completato, fare clic sul nome del batch. Nella schermata successiva, fai clic su Scarica dati sul lato destro della pagina. NOTA: i file scaricati conterranno immagini che sono state analizzate, risultati di riepilogo che riportano la contrazione media in ogni immagine e un'analisi dettagliata di ogni micropattern rilevato in qualsiasi immagine, riportando le loro dimensioni, posizioni, numero di celle aderenti e contrazione.</li>
			<li>Tracciare i valori di contrazione rispetto alle concentrazioni di farmaco per generare una curva concentrazione-risposta e determinare le potenze relative dei diversi trattamenti.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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I.P. è un inventore di una famiglia di brevetti rilasciati che protegge i metodi e i sistemi della tecnologia FLECS. I.P., Y.W., J.Z., E.C. e R.H. sono tutti dipendenti di Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. è professore presso UCLA e cofondatore di Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z. e R.D. detengono interessi finanziari in Forcyte Biotechnologies, Inc., che è il licenziatario esclusivo dei brevetti di cui sopra e sta commercializzando FLECS Technology.

Questo metodo semplificato per misurare quantitativamente la contrazione in centinaia di migliaia di cellule alla volta in diverse condizioni di trattamento e utilizzando solo strumenti di microscopia standard fornisce un'alternativa accessibile al TFM tradizionale per i ricercatori per studiare la biologia della forza cellulare. Poiché la tecnologia presentata fornisce una visualizzazione visiva della contrazione cellulare analizzando i cambiamenti nei micropattern fluorescenti di forma regolare, l'entità della contrazione prodotta da una data cellula è intuitivamente compresa: più piccolo è il micropattern, maggiore è la forza contrattile esercitata dalla cellula.
In particolare, offrendo il controllo su fattori come la forma, l'area di diffusione e la molecola di adesione che comprende i micropattern (tutti fattori noti per regolare la contrattilità cellulare22,23,24), la tecnologia presentata elimina sistematicamente variabili aggiuntive che possono confondere le interpretazioni degli studi di contrazione cellulare.
In questo esperimento, è stata utilizzata una rigidità di 10 kPa nel gel e un micropattern di 70 μm (lunghezza diagonale) composto da collagene di tipo IV. Oltre a questi parametri, la molecola adesiva può essere sostituita con vari collageni, fibronectina, gelatina e altre matrici extracellulari (ECM). La rigidità del gel può essere regolata fino a 0,1 kPa e fino alla gamma MPa. La geometria del micropattern può essere progettata de novo per essere qualsiasi forma con una dimensione minima delle caratteristiche di ~ 5 μm. Questi parametri sono disaccoppiati e possono essere ottimizzati in modo indipendente per un particolare contesto biologico.
Questa tecnologia è stata ampiamente convalidata per essere compatibile con tipi di cellule altamente adesive e contrattili di un fenotipo mesenchimale tra cui vari tipi di cellule muscolari lisce (vescica umana primaria, intestinale, tracheale, bronchiale, uterina, aortica e arteriosa), cellule staminali mesenchimali e la loro progenie differenziata, vari fibroblasti (polmonari, dermici e cardiaci), miofibroblasti e cellule endoteliali. Inoltre, i macrofagi derivati dai monociti produrranno anche una grande forza fagocitica misurabile sui micropattern, in particolare se il micropattern è costituito da un'opsonina nota. Varie linee di cancro possono anche essere analizzate utilizzando il metodo.
Il metodo può porre alcune sfide per l'uso con cellule che sono relativamente piccole come le cellule T e i neutrofili, o tipi di cellule con un fenotipo prevalentemente epiteliale. La ragione principale di ciò è che il metodo si basa su una forte adesione e sulla completa diffusione delle cellule sul micropattern al fine di generare il segnale contrattile misurabile. Le cellule che si legano debolmente, si legano l'una all'altra o non si diffondono completamente non produrranno segnali contrattili misurabili. Questi comportamenti, che sono relativamente rari, possono essere mitigati regolando la dimensione del micropattern in modo che sia più piccola o utilizzando molecole adesive alternative all'interno dei micropattern che promuoveranno meglio l'adesione e la diffusione in quelle cellule.
Gli utenti della tecnologia devono valutare attentamente diverse possibili formulazioni di terreni di coltura cellulare per il loro particolare tipo di interesse cellulare, poiché diversi componenti, fattori di crescita, livelli sierici e sensibilità al pH possono guidare comportamenti variabili in cellule diverse. L'ottimizzazione del protocollo dovrebbe precedere il ridimensionamento di qualsiasi flusso di lavoro sperimentale e i componenti multimediali dovrebbero essere sempre freschi, sterili e coerenti con i lotti precedenti.
In definitiva, se la risoluzione a cella singola non è necessaria per gli obiettivi di un utente, o se il tipo di cella target ha una capacità di diffusione minima, allora il TFM tradizionale può essere ugualmente o più adatto per tali esperimenti. L'obiettivo e la speranza degli autori è che questo strumento fornisca un'ulteriore strada per i biologi cellulari per studiare la contrazione cellulare, in particolare nel contesto di screening fenotipici automatizzati ad alto rendimento.
Specifiche per usi futuri negli schermi di farmaci, possono essere utilizzate piastre a più alta produttività come una piastra FLECS a 384 pozzetti. In tali piastre, obiettivi 4x su molti microscopi possono catturare un intero singolo pozzo nel loro campo visivo, assicurando che tutte le risposte contrattili cellulari vengano catturate. Utilizzando un sistema di imaging ad alta produttività, un'intera piastra a 384 pozzetti può essere ripresa in circa 5 minuti, rendendo questo sistema notevolmente più veloce di altre opzioni e, quindi, adatto per la scoperta di farmaci fenotipici ad alto rendimento. In effetti, gli autori eseguono regolarmente screening settimanali di farmaci su ~ 50 384-wellplates (per un totale di oltre 19.000 pozzi) utilizzando l'automazione.

Le forze meccaniche generate dalle cellule sono essenziali per il corretto funzionamento in vari organi del corpo come l'intestino, la vescica, il cuore e altri. Questi organi devono generare modelli stabili di contrazione e rilassamento cellulare per mantenere lo stato omeostatico interno. La contrazione anormale delle cellule muscolari lisce (SMC) può portare all'insorgenza di vari disturbi, tra cui, ad esempio, la dismotilità intestinale, caratterizzata da modelli anormali di contrazione della muscolatura liscia intestinale1, nonché le condizioni urologiche della vescica iperattiva2 o iperattiva3. All'interno delle vie aeree, le SMC che presentano modelli di contrazione irregolari possono innescare iperreattività asmatica4, potenzialmente stringendo le vie aeree e diminuendo il flusso d'aria di ossigeno nei polmoni. Un'altra condizione fisica diffusa, l'ipertensione, è causata da fluttuazioni nella contrazione della muscolatura liscia all'interno dei vasi sanguigni5. Chiaramente, i meccanismi contrattili all'interno di cellule e tessuti possono portare a malattie che richiedono opzioni di trattamento. Poiché queste condizioni derivano inequivocabilmente dai comportamenti contrattili disfunzionali delle cellule, diventa logico e necessario misurare la funzione contrattile cellulare stessa, durante lo screening di potenziali candidati farmaci.
Riconoscendo la necessità di strumenti per studiare la forza contrattile cellulare, diversi metodi di analisi quantitativa della contrazione sono stati sviluppati da ricercatori accademici tra cui microscopia a forza di trazione (TFM)6, TFM7 micropatterato, saggi di gel galleggiante8 e test di micropost elastomerici9. Queste tecnologie sono state utilizzate in formato monopiatto e multiplo in numerosi studi e sono state persino proposte per misure di forza tridimensionale10,11,12,13,14. Mentre queste tecnologie hanno permesso una ricerca pionieristica nel vasto campo della biologia della forza cellulare, sono state tutte in gran parte limitate a laboratori in possesso di capacità e risorse specifiche, in particolare: capacità di fabbricare substrati TFM, capacità di applicare correttamente algoritmi complessi e non intuitivi per risolvere mappe di spostamento TFM e sistemi di microscopia relativamente precisi in grado di registrare immagini scattate prima e dopo la rimozione del campione dallo stadio (per la dissociazione cellulare). Pertanto, per un ricercatore non addestrato, la barriera all'ingresso per utilizzare questi metodi può essere piuttosto elevata data l'ampia serie di requisiti per applicare queste tecnologie. Inoltre, la risoluzione di imaging richiesta per molte tecnologie esistenti (obiettivi 40x o superiori) può limitare significativamente la produttività sperimentale, mentre le tecnologie di misurazione di massa potrebbero mascherare i contributi delle cellule anomale e impedire la scoperta di differenze contrattili più lievi. Da notare, per quanto ne sanno gli autori, solo l'approccio del saggio del gel galleggiante a bassa produttività e semi-quantitativo è maturato sufficientemente da diventare disponibile per i ricercatori (vedi Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig01.jpg"> Figura 1: Schema generale del metodo flecs Technology. (A) Le cellule sono aderenti a micropattern proteici adesivi che sono incorporati covalentemente in un sottile strato elastomerico supportato da vetro. (B) Vista dall'alto di varie possibili forme di micropattern e un'esplosione di una cella che contrae una micropattern a forma di "X". (C) Sovrapposizione di micropattern fluorescenti e immagini a contrasto di fase di una cella contraente. (D) Immagini del corso temporale di una singola cella contraente. Barre di scala = 25 μm. Questa figura è stata adattata con il permesso di Pushkarsky et al15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
A seguito dei recenti progressi nella microtecnologia, gli autori hanno sviluppato una tecnologia basata su micropiastre che consente misurazioni quantitative della contrazione monocellulare in centinaia di migliaia di cellule chiamate FLECS (superfici contrattibili elastomeriche marcate fluorescentemente)15,16,17,18,19,20 , in alternativa a TFM. In questo approccio, i micropattern proteici fluorescenti sono incorporati in film morbidi che si deformano e si restringono quando le cellule applicano forze di trazione a loro, in modo intuitivo e misurabile. È importante sottolineare che i micropattern proteici vincolano la posizione, la forma e l'area di diffusione delle cellule, portando a condizioni di test uniformi. Questi consentono misurazioni semplici basate solo sui loro cambiamenti dimensionali, che sono altamente risolti spazialmente anche in immagini con ingrandimento 4x. Il metodo include un modulo di analisi delle immagini basato su browser e consente un'analisi diretta della forza delle cellule contrattili senza richiedere delicate procedure di manipolazione o registrazione di marcatori fiduciari, in modo tale che dovrebbe essere azionabile da qualsiasi ricercatore con una struttura di coltura cellulare di base e un semplice microscopio fluorescente a basso ingrandimento (Figura 2 ). Questa tecnologia, che è pronta per lo scaffale e disponibile in commercio, è stata progettata pensando all'utente finale e mira a ridurre la barriera all'ingresso per qualsiasi scienziato di laboratorio per studiare la biologia della forza cellulare.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig02.jpg"> Figura 2: Schema del formato della piastra a 24 pozzetti per il saggio di contrattilità a cella singola. Questo formato è stato utilizzato negli esperimenti descritti nel presente documento e raffigurati nella parte video dell'articolo. Barre della scala = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In questo lavoro, presentiamo un protocollo per l'applicazione del formato a 24 piastre di pozzo della piattaforma flecs Technology per quantificare gli effetti dei farmaci modulanti la forza sulla contrattilità cellulare nelle cellule muscolari lisce della vescica primaria. Questo protocollo generico può essere adattato e modificato secondo necessità per tenere conto di varie altre scale temporali, tipi di cellule e condizioni di trattamento di interesse e ridimensionato per rispondere ad altre domande nella biologia della forza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bladder smooth muscle cell culture</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td>Ham&#39;s F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7201432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FB012941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>ImageXpress Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcyte-manufactured 24-well plate</td>
			<td>Forcyte Biotechnologies</td>
			<td>24-HC4R-X1-QB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 3342 Live Nuclear Stain</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers

La generazione della forza contrattile cellulare è un tratto fondamentale condiviso praticamente da tutte le cellule. Queste forze contrattili sono cruciali per il corretto sviluppo, funzionano sia a livello cellulare che tissutale e regolano i sistemi meccanici nel corpo. Numerosi processi biologici sono dipendenti dalla forza, tra cui motilità, adesione e divisione delle singole cellule, nonché contrazione e rilassamento di organi come cuore, vescica, polmoni, intestino e utero. Data la sua importanza nel mantenere una corretta funzione fisiologica, la contrattilità cellulare può anche guidare i processi patologici quando esagerata o interrotta. Asma, ipertensione, parto pretermine, cicatrici fibrotiche e vescica iperattiva sono tutti esempi di processi patologici guidati meccanicamente che potrebbero potenzialmente essere alleviati con un adeguato controllo della forza contrattile cellulare. Qui, presentiamo un protocollo completo per l'utilizzo di una nuova tecnologia di analisi della contrattilità basata su micropiastre nota come superfici elastomeriche contraibili marcate fluorescenti (FLECS), che fornisce un'analisi semplificata e intuitiva della contrattilità a singola cellula in modo massiccio. Qui, forniamo un protocollo graduale per ottenere due curve dose-risposta a sei punti che descrivono gli effetti di due inibitori contrattili sulla contrazione delle cellule muscolari lisce della vescica umana primaria in una procedura semplice che utilizza solo una singola micropiastra flecs, per dimostrare la tecnica corretta agli utenti del metodo. Utilizzando la tecnologia FLECS, tutti i ricercatori con laboratori biologici di base e sistemi di microscopia fluorescente hanno accesso allo studio di questo fenotipo cellulare funzionale fondamentale ma difficile da quantificare, abbassando efficacemente la barriera di ingresso nel campo della biologia della forza e dello screening fenotipico della forza delle cellule contrattili.

Le regioni delle immagini acquisite dai pozzi che sono stati trattati solo con DMSO e quelle che sono state trattate con blebbistatina da 40 μM sono mostrate fianco a fianco nella Figura 3. Si può chiaramente osservare che le cellule trattate solo con DMSO mostrano un livello significativo di contrazione basato sulle deformazioni molto prominenti dei micropattern a cui aderiscono le cellule muscolari lisce della vescica (BSMC) in quel pozzo. Al contrario, nell'immagine del pozzo trattato con blebbistatina da 40 μM, si osserva un significativo rilassamento cellulare7 poiché i micropattern a cui aderiscono i BSMC sono di dimensioni quasi indistinguibili dai micropattern a cui non aderiscono le cellule, indicando una contrazione minima. Queste immagini dimostrano la rappresentazione visiva intuitiva e chiara della contrattilità a singola cellula offerta dal metodo di micropatterning fluorescente. A differenza dei metodi basati su TFM, in cui il movimento omnidirezionale di numerose particelle fluorescenti distribuite casualmente sotto un monostrato cellulare denso ha lo scopo di trasmettere la forza contrattile relativa, qui, le geometrie contratte uniformi e marcate dei micropattern forniscono informazioni qualitative immediate e facilmente interpretabili sulla contrazione delle singole cellule. Questi possono essere quantificati direttamente applicando operazioni di oggetti binari standard sulle immagini.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig03.jpg"> Figura 3: Confronti affiancati di immagini scattate di pozzi contenenti solo l'1% di trattamento DMSO (a sinistra) o contenenti 40 μM di blebbistatina (a destra). Si può chiaramente osservare che il trattamento con blebbistatina riduce significativamente la contrattilità delle singole cellule come indicato dai micropattern più grandi e non contratti. I nuclei blu indicano quali micropattern sono legati dalle cellule. Barra della scala = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Applicando il modulo di analisi basato su browser per analizzare le coppie di immagini acquisite di micropattern e nuclei cellulari, si ottengono distribuzioni di contrattilità a singola cellula per ciascuna popolazione, come mostrato nella Figura 4. Descritta in dettaglio in un precedente rapporto sulla metodologia FLECS15, l'analisi funziona localizzando le posizioni e gli orientamenti di ogni micropattern a forma di "X", contando il numero di nuclei aderenti direttamente sul centro di ciascun micropattern, calcolando la lunghezza media di ciascun micropattern e calcolando la distanza in pixel della contrazione di ciascun micropattern rispetto alla lunghezza media dei micropattern vuoti (riferimento di contrazione zero). Pertanto, i micropattern vuoti hanno uno scopo importante per normalizzare i dati di contrazione. È importante sottolineare che le cellule che non si legano ai micropattern si accumuleranno sui bordi del pozzo a causa delle microcorrenti in cui non influenzeranno l'analisi delle immagini. Come si vede in questi grafici, la contrattilità imperturbabile della popolazione cellulare trattata solo con controlli DMSO si estende su un ampio intervallo fino a 20 pixel, con un centro trovato a circa 10 pixel. Nel frattempo, le cellule trattate con blebbistatina si contraggono significativamente meno e la loro distribuzione viene spinta verso il basso fino a un centro di poco più di 6 pixel. È importante sottolineare che ogni singolo micropattern trovato nell'immagine che si lega esattamente sulla cellula è rappresentato in queste distribuzioni. Ciò dimostra la capacità del metodo di trasmettere risposte cellulari differenziali ai trattamenti farmacologici.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig04.jpg"> Figura 4: Istogrammi raffiguranti dati di contrattilità monocellulare ottenuti dall'analisi di immagini scattate di pozzi contenenti solo 1% dmSO (blu) o blebbistatina da 40μM. La distribuzione delle cellule trattate con DMSO è ampia e centrata su un valore di contrazione molto più grande (~ 10 pixel) rispetto alla distribuzione trattata con blebbistatina, dimostrando gli effetti quantitativi del trattamento delle cellule con blebbistatina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Utilizzando tutti i pozzetti su una singola piastra a 24 pozzetti e visualizzando almeno 3 siti per pozzetto, vengono generate simultaneamente curve dose-risposta a sei punti per due composti farmacologici. La Figura 5 mostra i dati concentrazione-risposta per le BSMC trattate con lo stesso intervallo di dosi di blebbistatina o citocalasina D (entrambi noti inibitori della contrattilità). Come evidente dai profili concentrazione-risposta, la citocalasina D è il più potente inibitore della contrazione tonica in queste cellule. Adattando una curva sigmoidale ai punti dati, è possibile calcolare i valori IC50 per ciascun farmaco. I nostri esperimenti indicano che l'IC50 è di 7,9 μM e 100 nM per blebbistatina e citocalasina D, rispettivamente, dopo circa 30 minuti di esposizione ai farmaci. È importante sottolineare che, nel complesso, questi valori sono coerenti con i rapporti precedenti, convalidando l'accuratezza quantitativa del metodo per determinare la potenza degli inibitori della contrazione7,21.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig05.jpg"> Figura 5: Curve concentrazione-risposta che descrivono gli effetti di blebbistatina e citocalasina D sulla contrattilità cellulare in singole cellule. Ogni punto dati comprende tre immagini per quella condizione. Una curva sigmoidale era adatta a ciascun set di dati. I risultati indicano che la citocalasina D è più potente, con un valore IC50 inferiore. Questi dati sono raccolti da una singola piastra FLECS a 24 pozzetti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Questo lavoro presenta un protocollo flessibile per l'utilizzo della tecnologia FLECS (fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces) in formato microwell per una quantificazione semplificata e hands-off delle forze contrattili a singola cellula basata sugli spostamenti visualizzati di micropattern proteici fluorescenti.

Analisi semplificata e ad alta produttività della contrattilità a cella singola utilizzando elastomeri micropatterati

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Le forze meccaniche generate dalle cellule sono essenziali per il corretto funzionamento in vari organi in tutto il corpo. Più la vescica intestinale, il cuore e altri. Questi organi devono generare modelli stabili di contrazione e rilassamento cellulare, per mantenere lo stato emostatico interno.La contrazione anormale delle cellule muscolari lisce può portare all'insorgenza di vari disturbi, tra cui la dismotilità intestinale caratterizzare modelli anormali di intestinale con contrazione muscolare, nonché condizioni come la vescica iperattiva o ipoattiva. E nelle vie aeree, alcune cellule muscolari che contraggono modelli irregolari possono innescare l'iper-reattività asmatica. Chiaramente, i meccanismi contrattili all'interno di cellule e tessuti possono portare a malattie che richiedono opzioni di trattamento.E poiché queste condizioni possono derivare direttamente da comportamenti contrattili disfunzionali delle cellule, diventa sia logico che necessario misurare la funzione contrattile cellulare stessa, quando si esaminano potenziali candidati farmaci. A seguito dei recenti progressi nella micro tecnologia, abbiamo sviluppato un test basato su micropiastre di facile utilizzo che consente misurazioni quantitative della contrazione di singole cellule. In centinaia di migliaia di celle chiamate flex, note anche come superfici elastomeriche contrattabili marcate fluorescentemente.In questo approccio, incorporiamo micro modelli proteici fluorescenti e quindi film morbidi, che si deformano e si restringono quando le cellule applicano loro forze di trazione. È importante sottolineare che i micro modelli proteici limitano la posizione, la forma e l'area di diffusione delle cellule. Le condizioni di prova uniformi e consentono misurazioni semplici basate solo sulle loro variazioni dimensionali.Nel complesso, la piattaforma, che include un modulo di analisi delle immagini basato su browser, consente un'analisi diretta della forza cellulare contraibile senza richiedere delicate procedure di manipolazione o registrazione di marcatori fiduciari e può essere gestita da qualsiasi ricercatore con le colture cellulari di base e un semplice microscopio fluorescente a basso ingrandimento. Questa tecnologia deve essere progettata pensando all'utente finale e mira a ridurre la barriera all'ingresso per qualsiasi scienziato di laboratorio per studiare la biologia della forza cellulare Inizia aggiungendo 20 millilitri di media in un tubo cronico, ottieni una piastra a 24 pozzetti progettata per testare la contrattilità cellulare. Imposta la tua pipetta su 500 microlitri e ottieni un colino cellulare per l'agente patogeno cellulare.Rimuovere il coperchio sulla piastra a 24 pozzetti, tenere la piastra in questo modo, quindi procedere a togliere delicatamente lo strato di plastica sulla parte superiore della piastra. Impostare con attenzione il piatto verso il basso. Aspirare solo PBS di strato superiore da ciascun pozzetto per evitare qualsiasi fuoriuscita.Ora, una riga alla volta, rimuovere il PBS rimanente dal pozzo e riempire rapidamente con 500 microlitri di supporti cellulari. Agitare delicatamente la piastra e picchiettare su un lato per assicurarsi che l'intero fondo del pozzo sia coperto di soluzione. Una volta che tutti i pozzi sono stati riempiti con i supporti, metti la piastra di lato.A questo punto, recupera la tua coltura cellulare dall'incubatrice. Condurremo un solido protocollo di associazione. Lo scopo di questo protocollo è quello di creare una sospensione di 50.000 cellule per millilitro.Prima di seminare le cellule, assicurati di filtrare le cellule una volta attraverso il colino, al fine di rompere grumi di cellule in singole cellule, posiziona con cura 500 microlitri della tua soluzione cellulare in ciascun pozzetto. Dopo la semina cellulare, è importante lasciare riposare le piastre per un'ora in modo che le cellule possano depositarsi direttamente sui modelli. Dopo un'ora, posizionare il piatto in un'incubatrice durante la notte.La seconda parte dell'esperimento consiste nell'aggiunta dei farmaci alla piastra a 24 pozzetti e nell'imaging fluorescente della piastra. Per questa parte del protocollo abbiamo due requisiti importanti per garantire una robusta vitalità e risposta cellulare. Il primo è che la concentrazione finale di DMSO nei pozzetti con cellula non è superiore all'1%, il che significa che dobbiamo fare una diluizione completa di 100 dalle nostre scorte di farmaci.Il secondo è che non possiamo aggiungere DMSO così direttamente ai pozzetti perché si schianterà sul fondo di quella miscelazione e quindi danneggerà le cellule con una concentrazione di alto livello. Invece, dobbiamo creare una soluzione intermedia di farmaco e media DMS0, che possiamo mescolare accuratamente insieme per evitare un'elevata esposizione DSSO locale alle cellule. In questo protocollo, faremo una diluizione di sei fasi otto volte che copre un intervallo da 40 micromolari fino a un nano molare Creare la serie di diluizione di sei fasi otto volte trasferendo 30 microlitri di soluzione di farmaco madre in volumi consecutivi di 210 microlitri di DMSO e mescolando accuratamente tra ogni fase di trasferimento Nel nostro esperimento, valuteremo l'effetto della blebbistatina.sulle vesciche umane attraverso le cellule muscolari. Al fine di soddisfare entrambi i requisiti, creeremo prima un farmaco intermedio DMSO e una soluzione multimediale. Ciò produce una diluizione di 16,7 volte del DMSO.Quindi aggiungeremo questa soluzione di farmaco intermedio alle nostre cellule, utilizzando proporzioni che producono un'ulteriore diluizione di sei volte, con conseguente diluizione totale di 100 diluizione completa e la concentrazione finale dell'1% DMSO Per raggiungere questo obiettivo, per ogni soluzione di farmaco madre, mescolare 30 microlitri di farmaco in 470 microlitri di terreno di coltura cellulare, quindi trasferire 200 microlitri di questa soluzione intermedia al pozzo appropriato sulla piastra a 24 pozzetti, che contiene 1000 microlitri in ogni pozzetto. Questo produce collettivamente una concentrazione finale dell'1% di DMSO Incubate per il periodo di tempo appropriato. Nel nostro esperimento, incubare per 30 minuti, quando sei pronto per l'immagine aggiungi una macchia nucleare viva su tutti i tuoi pozzi aggiungi una diluizione da uno a 10.000 dal magazzino.Lasciare incubare per altri 15 minuti. Quando sei pronto per l'immagine, avrai bisogno di un microscopio fluorescente equipaggiato per visualizzare i canali fluorescenti sia per i nuclei cellulari etichettati che per il colorante fluorescente. I micro pattern sono etichettati con cui nel nostro esempio è il canale tri C.Ora, saremo fluorescenti imaging blebbistatin nuclei al fine di identificare singole cellule, essere sicuri di visualizzare i nuclei di cellule macchia nella stessa esatta posizione in cui si visualizza il micro modello in modo che possano essere allineati durante l'analisi. Carica le immagini acquisite sul tuo computer per assicurarti che le immagini siano etichettate correttamente, in modo tale che i canali del pattern finiscano con il punto di sottolineatura PT. E le immagini nel canale nucleare terminano con underscore dapi. Ora, convertiremo le immagini tif in immagini PNG, usando l'immagine J Una volta che l'immagine J è aperta, carica in un canale alla volta.Per prima cosa caricheremo il canale del pattern e regoleremo il contrasto, al fine di massimizzare il segnale e ridurre al minimo lo sfondo. Inoltre, smusseremo l'immagine. Una volta che l'immagine è stata modificata a nostro piacimento, cambieremo il tipo di immagine a otto bit.Quindi esporta l'immagine come tipo PNG. Quindi selezionare la casella, utilizzare le etichette delle sezioni come nomi di file. Creare una nuova cartella denominata PNG.Quindi salvare i file PNG lì, Per analizzare le immagini, passare a Biodock dot AI, creare un account e contattare gli autori per ottenere l'accesso gratuito al modulo di analisi. Accedi una volta creato il tuo account. Qui potrai caricare nuove immagini.Chiameremo questo nuovo batch, dati di esperimenti web JoVE. Ora possiamo importare le immagini trascinandole e quindi rilasciandole, premere OK.At questo punto, selezionare i dati. Quindi fare clic su Analizza, scorrere verso il basso fino al modulo etichettato Analisi di contrattilità, quindi premere Seleziona.Imposta l'ingrandimento sullo stesso valore che hai usato per l'imaging Una volta completati i dati, fai clic su di esso, quindi possiamo selezionare i dati di download. Una volta scaricati i dati, possiamo quindi vedere le coppie di immagini sovrapposte per ogni immagine immessa. Abbiamo anche accesso a una statistica riassuntiva che ci darà la contrazione media per ogni insieme di celle.L'unità di misura per la contrazione è in pixel. Guardando i dati possiamo vedere qui che nei pozzi trattati solo con DMSO, c'è stata una contrazione molto più alta delle cellule rispetto a quelle cellule che sono state trattate con blebbistatina. Abbiamo anche accesso ai dati per ogni singolo modello, che è stato rilevato in una qualsiasi delle immagini.Questo ci fornisce informazioni dettagliate sulla posizione dell'immagine, l'origine dell'immagine, il tipo di posizione, il numero di celle, zero una o più di una, la dimensione del micro modello e la contrazione calcolata delle celle. Questa posa è costituita da ogni singolo modello identificato all'interno della micro piastra. I modelli a cella singola di questo elenco erano nella media per calcolare la contrazione media per l'immagine PNG nell'altro file.È possibile ordinare e analizzare i dati a cella singola in base alle esigenze dell'esperimento. Per questa parte del video, mostreremo dati rappresentativi che sono raccoglibili da una piastra a 24 pozzetti che mostra i dati di risposta delle cellule muscolari lisce della vescica trattate con due diversi farmaci. Queste sono immagini di pozzi trattati rispettivamente con DMSO e blebbistatina.Qui, possiamo vedere che le cellule trattate solo con DMSO, mostrano un gran numero di micro modelli contrattuali, ma le cellule trattate con blebbistatin erano più grandi e aperte a notare che c'è meno contrazione. I dati in questo istogramma mostrano la variazione della contrattilità cellulare come risultato dei diversi trattamenti alle cellule. Il centro di distribuzione per le cellule trattate con blebbistatina è inferiore al centro di distribuzione per le cellule che sono state trattate con il DMSO.Ciò è coerente con le informazioni visualizzate nelle immagini precedenti. Perché le cellule che sono state trattate con blebbistatina hanno mostrato una contrazione molto più piccola. Ciò denota che il trattamento con blebbistatina rilassa significativamente le cellule.Ognuno di questi set di dati contribuisce a un punto sulla curva di risposta alla dose che è raccoglibile da una singola piastra a 24 pozzetti, seguendo i protocolli mostrati nel video. Qui, possiamo vedere che la citocalasina D è più potente del blebbistan come dimostrato dai valori più bassi di contrazione, date le più alte concentrazioni di farmaco. Se desideri ridimensionare in modo significativo i tuoi esperimenti, è disponibile una versione a piastra a 384 pozzetti e questa può essere utilizzata con l'automazione per ridimensionare drasticamente gli esperimenti.Questi dati sono raccolti da una piastra da 384 pozzetti, piuttosto che avere sei fasi di diluizione per ciascun farmaco sulla piastra a 24 pozzetti, la piastra a 384 pozzetti ci consente di condurre 20 fasi di diluizione per ciascun farmaco con più repliche. La tecnologia dei fiocchi di neve è unica. Consente la visualizzazione della contrazione a singola cellula utilizzando la microscopia, che finora è stata impossibile.Quindi, la tecnologia si basa sulla forma di metriche che è modellata con proteine marcate fluorescenti. Il modello sistematico deve formarsi per la contrazione cellulare e consente una misurazione precisa della modulazione di un contratto di fenotipo da parte di un dato farmaco. Naturalmente, questa tecnologia è ancora in fase di sviluppo attivo per applicazioni e molte diverse aree di malattia, come l'asma, le malattie cardiovascolari, l'infiammazione immune oncologica e, naturalmente, qualsiasi indicazione della nostra malattia in cui la contrazione cellulare anormale svolge un ruolo chiave nella progressione della malattia.Come dimostriamo, questa tecnologia basata su micro patterning per la misurazione della contrattilità cellulare offre un'alternativa semplificata alla microscopia tradizionale della forza di trazione, fornendo un'analisi intuitiva, osservando il pattern ridursi e fornendo una risoluzione a singola cellula in grandi popolazioni cellulari. Alcune considerazioni, questo metodo può porre sfide per l'uso di cellule che sono troppo piccole, come le cellule T e neutrofili, o tipi di cellule che non aderiscono. Inoltre le cellule che settimanalmente si legano, si legano tra loro prevalentemente o che non si diffondono completamente, non produrranno segnali contrattili misurabili.Gli utenti della tecnologia devono valutare attentamente diverse possibili formulazioni di terreni di coltura cellulare per il loro particolare tipo di cellula. poiché diversi componenti, fattori di crescita, livelli sierici e sensibilità al pH possono guidare comportamenti variabili. L'ottimizzazione dei protocolli dovrebbe procedere al ridimensionamento di eventuali flussi di lavoro sperimentali.In definitiva, se la risoluzione di una singola cellula non è necessaria, o se il tipo di cellula bersaglio ha una capacità di diffusione minima, allora i metodi tradizionali di microscopia a forza di attrazione possono essere impiegati per tali esperimenti. Altrimenti speriamo che questo strumento fornisca un'ulteriore strada per i biologi cellulari per studiare la contrazione cellulare ed eseguire i loro studi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Screening della cardiotossicità ad alto rendimento utilizzando monostrati di cardiomiociti pluripotenti indotti da cellule staminali umane mature

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...