Name: simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers
Uploaded: 2022-04-08T13:00:00
Duration: 14 min 33 s
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実験室での研究は、Forcyteが研究活動を後援しているUCLA Molecular Shared Screening Resource(MSSR)と、Forcyte Biotechnologies, Inc.が常駐企業であるCalifornia NanoSystems Institute(CNSI)のMagnify Incubatorの支援を受けて実施されました。著者らは、要求に応じて、すべての学術研究者に Biodock.ai のFLECS分析モジュールへのアクセスを許可します。L.H.とI.P.はこの仕事に等しく貢献しました。

1. 1日目:24ウェルプレートの作製
<ol><li>50 mL の円錐形チューブに 20 mL の細胞培養培地を加えることから手順を開始します。この実験では、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したF12ハムベースの培地が使用される。</li>
	<li>細胞収縮性をアッセイするように設計された24ウェルプレートを得る。ピペットを500 μLに設定し、細胞継代用の細胞ストレーナーを得た。 注:プレートは、要求に応じて著者から入手可能です。</li>
	<li>プレートを片手で持ち上げて持ち、プラスチックフィルムをプレートの上部から静かに剥がします。その後、プレートを慎重に下ろします。</li>
	<li>真空アスピレーターの電源を入れ、こぼれを防ぐためにウェルからリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の最上層を吸引します。PBS を一度に 1 行ずつ削除します。ウェルが完全にいっぱいでなくなったら、片手でプレートを持ち、残りのPBSをウェルから慎重に取り除きます。500 μLの細胞培養培地を素早く充填する。アスピレーターと井戸の底との接触を避けるように注意してください。</li>
	<li>プレートを優しく振って側面をタップすると、ウェルの底全体が溶液で覆われていることを確認します。すべてのウェルが培地で満たされたら、プレートを側面にセットします。</li>
</ol>2. 1日目:細胞播種
<ol><li>継代7以下の初代ヒト膀胱平滑筋(BSM)細胞を37°Cのインキュベーターから培養フラスコに取り出す。顕微鏡下で、細胞の形態をチェックし、細胞が少なくとも90%のコンフルエント度まで成長し、100%未満のコンフルエント度に成長していることを確認します。</li>
	<li>細胞解離プロトコルを実施する。滅菌バイオセーフティキャビネット内で、細胞が剥離するまで2.5分間細胞をトリプシン処理してから、血清添加培地(10% FBS)で細胞をクエンチします。</li>
	<li>細胞が解離したら、血球計数器を使用して細胞を計数し、血清添加培地で細胞懸濁液を約50,000細胞/ mLに希釈する。重要なことに、細胞はマイクロパターンに付着するために少なくとも2%の血清を必要とする。</li>
	<li>播種前に、40 μm または 100 μm の細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を血清学的ピペット付きの 50 mL 円錐形チューブに急速にこじ開け、細胞の凝集塊を単一細胞に分解します。</li>
	<li>P1000ピペットを使用してプレート上の24ウェルのそれぞれに500 μLの500 μLの細胞懸濁液を慎重に加え、ウェル内の異なる位置に溶液を滴下します。</li>
	<li>細胞播種後、プレートを室温で1時間放置して、蒸発によって発生するマイクロ電流の影響を受けずに細胞がマイクロパターンに直接沈降するようにします。1時間後、プレートを37°Cのインキュベーターに一晩入れる。細胞は、この間に自己集合して接着マイクロパターン上に広がり、基礎収縮レベルを発揮し始める。</li>
</ol>3. 2日目:被験薬の添加
注:接着細胞を含むウェル中のジメチルスルホキシド(DMSO)の最終濃度は1%を超えてはならず、薬物/ DMSOを細胞に直接添加することはできませんが、最初に希釈して細胞培地の中間溶液に混合する必要があります。
<ol><li>30 μL のストック薬物を連続する 210 μL 容量の DMSO に移し、各移送ステップ間で十分に混合することにより、6 段階、8 倍の薬物希釈シリーズを作成します。この作業では、ブレビスタチンの6段階、8倍希釈シリーズを、DMSO中で40μM〜1nMの範囲の用量で調製する。</li>
	<li>各ストック薬物溶液(ステップ3.1から)について、30μLの薬物を470μLの細胞培養培地に混合する。中間溶液は、DMSOの16.7倍希釈をもたらす。</li>
	<li>各中間溶液200 μLを24ウェルプレート上の適切なウェルに移す(各ウェルにはすでに100 μLの培地が含まれている)。これにより、DMSOのさらなる6倍希釈が得られる。</li>
	<li>ステップ3.2および3.3は、ウェル中に1%の最終濃度のDMSOをまとめて得る。</li>
	<li>処理したプレートを37°Cのインキュベーターに適切な期間置く。この実験のために、30分間のインキュベーションが使用される。</li>
	<li>イメージングの直前に、ヘキスト33342生きた核染色溶液を各ウェルに添加する(1:10,000最終希釈)。細胞核を標識するためにさらに15分間インキュベートする。</li>
</ol>4. 2日目:ウェルプレートのイメージング
<ol><li>細胞核(DAPI)とマイクロパターン(TRITC)の両方のチャンネルを画像化する機能を備えた顕微鏡にアクセスします。</li>
	<li>まず、DMSOのみで細胞を画像化します。</li>
	<li>次に、マイクロパターンと標識細胞核の両方に焦点を合わせて画像化して、単一細胞を識別し、両方のチャネルが完全に整列し、自動画像解析を可能にします。</li>
	<li>プレート上の24ウェルのそれぞれで複数の位置で繰り返します。画像は、4倍の対物レンズで撮影することができます(または、画像化を迅速化し、画像ごとに最大のデータポイントを取得するために、オプションで高くすることができます)。</li>
	<li>画像をTIFファイルとしてエクスポートし、ImageJでWeb接続されたコンピュータで開いてデータを分析します。</li>
</ol>5. 実験後:画像解析
メモ: 画像解析は、ポータルおよびイメージングソフトウェア Biodock.ai 使用して実行しました。
<ol><li>取得した画像をコンピュータにアップロードします。<ol>
<li>対応するマイクロパターン画像と核画像のペアに適切な名前が付けられていることを確認します。</li>
		<li>マイクロパターン イメージ名がすべて "sharedCoreName_pt.tif" の形式であることを確認します。</li>
		<li>中核イメージ名がすべて "sharedCoreName_dapi.tif" の形式であることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ImageJを使用して画像をTIFからPNGに変換します。<ol>
<li>ImageJ を開いたら、一度に 1 つのチャンネルにロードします。この実験では、まずマイクロパターン画像をスタックとして ImageJ に読み込みます。</li>
		<li>「画像>>明るさ/コントラストの調整」を使用して、画像の明るさを調整してマイクロパターンを強調し、背景を黒に縮小します。これに加えて、画像を滑らかにします。</li>
		<li>[イメージ>タイプ] > 8 ビットを使用して、イメージを 8 ビットに変換します。</li>
		<li>次に、画像をPNGタイプにエクスポートし、ファイル名としてスライスレベルチェックボックスをオンにします。次に、新しいフォルダPNGを作成し、そこにPNGファイルを同じ名前で保存します。</li>
		<li>核画像に対してこのプロセスを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PNG画像ペアを解析用の画像処理ソフトウェアにアップロードします。<ol>
<li>アカウントを作成して検証します。著者らは、アカデミックユーザーへのオープンアクセスを可能にするアカウントを持っています。</li>
		<li>著者に連絡してアカウントを検証します。</li>
		<li>ソフトウェアにログインします。</li>
		<li>左側の [ データ ] タブで、[ バッチのアップロード] をクリックします。</li>
		<li>画像ペアをポップアップウィンドウにドラッグアンドドロップして画像をインポートし、バッチに名前を付けます。「 OK」をクリックします。</li>
		<li>バッチ名の横にあるチェックボックスをオンにして、「 分析」をクリックします。</li>
		<li>次の画面で、下にスクロールして [ 収縮性分析] の横にあるチェックボックスをオンにし、[ 選択] をクリックします。ページの下方で、ドロップダウンメニューからイメージングに使用した倍率として 10x を選択します。<ol>
<li>「送信」をクリックします。データ分析で [完了] と読み取られたら、バッチ名をクリックします。次の画面で、ページの右側にある [データのダウンロード] をクリックします。 注:ダウンロードされたファイルには、分析された画像、各画像の平均収縮を報告する要約結果、および任意の画像で検出されたすべてのマイクロパターンの詳細な分析が含まれ、サイズ、位置、接着細胞数、および収縮を報告します。</li>
			<li>薬物濃度に対して収縮値をプロットして濃度応答曲線を生成し、異なる治療の相対的効力を決定する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+abnormal+intestinal+motility+in+inflammatory+bowel+disease:+How+smooth+muscle+contraction+is+reduced.">Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).</li><li>Peyronnet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+review+of+overactive+bladder+pathophysiology:+On+the+way+to+tailored+treatment.">A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment.</a> European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).</li><li>Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. 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I.P.は、FLECS技術の方法とシステムを保護する発行済みパテントファミリーの発明者です。I.P.、Y.W.、J.Z.、E..C Z.、およびR.H.はすべてForcyte Biotechnologies, Inc.の従業員であり、R.D.はUCLAの教授であり、Forcyte Biotechnologies, Inc.の共同設立者であり、I.P.、Y.W.、J.Z.、およびR.D.は、上記の特許の独占的ライセンシーであり、FLECSテクノロジーを商業化しているForcyte Biotechnologies, Inc.に金銭的利益を保有しています。

標準的な顕微鏡検査機器のみを使用して、異なる処理条件下で一度に数十万個の細胞の収縮を定量的に測定するこの簡素化された方法は、研究者が細胞力生物学を研究するための従来のTFMのアクセス可能な代替手段を提供します。提示された技術は、規則的な形状の蛍光マイクロパターンの変化を分析することによって細胞収縮の視覚的表示を提供するので、任意の細胞によって生成される収縮の大きさは直感的に理解される - マイクロパターンが小さいほど、細胞によって加えられる収縮力は大きくなる。
特に、マイクロパターン(細胞収縮性を調節することが知られているすべての因子22,23,24)を含む形状、拡散領域、接着分子などの因子を制御することにより、提示された技術は、細胞収縮研究の解釈を混乱させる可能性のある追加の変数を体系的に排除する。
本実験では、ゲルに10kPaの剛性を用い、IV型コラーゲンからなる70μm(対角線長)のマイクロパターンを用いた。これらのパラメータに加えて、接着分子は、様々なコラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、および他の細胞外マトリックス(ECM)で置き換えることができる。ゲルの剛性は、0.1kPaまで、そしてMPa範囲まで調整することができます。マイクロパターン形状は、約5μmの最小特徴サイズを有する任意の形状になるようにde novoを設計することができる。これらのパラメータは分離されており、特定の生物学的文脈に対して独立して最適化することができる。
この技術は、様々な平滑筋細胞型(初代ヒト膀胱、腸管、気管、気管支、子宮、大動脈、動脈)、間葉系幹細胞およびその分化子孫、種々の線維芽細胞(肺、真皮、および心臓)、筋線維芽細胞、および内皮細胞を含む間葉表現型の高接着性および収縮性細胞型と適合性があることが広く検証されている。さらに、単球由来マクロファージは、特にマイクロパターンが既知のオプソニンからなる場合、マイクロパターン上に大きな測定可能な貪食力も生じるであろう。種々の癌株もまた、この方法を用いてアッセイすることができる。
この方法は、T細胞や好中球などの比較的小さい細胞、または主に上皮表現型を有する細胞型での使用にいくつかの課題を提起する可能性がある。この主な理由は、測定可能な収縮シグナルを生成するために、この方法がマイクロパターン上の強い接着および細胞の完全な広がりに依存しているからである。弱く結合する、互いに結合する、または完全に広がらない細胞は、測定可能な収縮シグナルを産生しない。これらの挙動は比較的まれですが、マイクロパターンのサイズを小さく調整するか、マイクロパターン内で接着と拡散をよりよく促進する代替接着分子を使用することによって軽減できます。
この技術のユーザーは、異なる成分、成長因子、血清レベル、およびpH感受性が異なる細胞において変動する挙動を駆動する可能性があるため、関心のある特定の細胞タイプに対して異なる可能な細胞培養培地製剤を慎重に評価しなければならない。プロトコルの最適化は、実験ワークフローのスケーリングに先立って行うべきであり、メディアコンポーネントは常に新鮮で無菌で、以前のバッチと一貫していなければならない。
最終的に、シングルセル分解能がユーザーの目標に必要でない場合、またはターゲットセルタイプが最小の拡散容量を有する場合、従来のTFMはそのような実験に同等またはより適している可能性がある。著者らの目的と希望は、このツールが、特に自動化されたハイスループット表現型薬物スクリーニングの文脈において、細胞生物学者が細胞収縮を研究するためのさらなる道を提供することである。
薬物スクリーニングにおける将来の使用に特有の、384ウェルFLECSプレートなどのより高いスループットプレートが使用されてもよい。このようなプレートでは、多くの顕微鏡の4倍の対物レンズが視野内の単一のウェル全体をキャプチャし、すべての細胞収縮応答を確実にキャプチャできます。ハイスループットイメージングシステムを使用することで、384ウェルプレート全体を約5分でイメージングできるため、他のオプションよりも劇的に高速であるため、ハイスループット表現型創薬に適しています。実際、著者らは、自動化を使用して、約50の384ウェルプレート(合計19,000ウェル以上)で毎週薬物スクリーニングを定期的に実行しています。

細胞が生成する機械的な力は、腸、膀胱、心臓など、全身のさまざまな臓器で適切に機能するために不可欠です。これらの器官は、内部恒常性状態を維持するために、細胞収縮および弛緩の安定したパターンを生成しなければならない。異常な平滑筋細胞(SMC)の収縮は、例えば、腸平滑筋収縮の異常なパターンを特徴とする腸運動障害1、ならびに過活動2 または低活動膀胱3の泌尿器科的状態を含む様々な障害の発症をもたらし得る。気道内では、不規則な収縮パターンを示すSMCが喘息過敏症4を引き起こし、気道を締め付け、肺への酸素の気流を減少させる可能性があります。もう一つの広範な身体状態である高血圧症は、血管内の平滑筋収縮の変動によって引き起こされます5。明らかに、細胞および組織内の収縮メカニズムは、治療の選択肢を必要とする疾患につながる可能性がある。これらの状態は間違いなく細胞の機能不全の収縮挙動に由来するため、潜在的な薬物候補をスクリーニングする際には、細胞の収縮機能自体を測定することが論理的かつ必要になります。
細胞収縮力を研究するためのツールの必要性を認識し、牽引力顕微鏡(TFM)6、マイクロパターンTFM7、フローティングゲルアッセイ8、エラストマーマイクロポストアッセイ9を含むいくつかの定量的収縮アッセイ法が学術研究者によって開発されています。これらの技術は、多くの研究でシングルディッシュ形式およびマルチウェルプレート形式で利用されており、3次元力測定にも提案されています10,11,12,13,14。これらの技術は、細胞力生物学の広大な分野で先駆的な研究を可能にしましたが、それらはすべて、TFM基質を製造する能力、TFM変位マップを解決するために複雑で直感的でないアルゴリズムを適切に適用する能力、およびステージからのサンプル除去の前後に撮影された画像を登録できる比較的正確な顕微鏡システム(細胞解離用)など、特定の能力とリソースを持つラボに大きく制限されていました。したがって、訓練を受けていない研究者にとって、これらの技術を適用するための広範な要件を考えると、これらの方法を使用するための参入障壁は非常に高くなる可能性があります。さらに、多くの既存技術(40倍以上の目標)に必要なイメージング分解能は実験スループットを大幅に制限する可能性があり、バルク測定技術は外れ値細胞からの寄与を隠し、より穏やかな収縮差の発見を妨げる可能性があります。注目すべきは、著者らが認識している限り、低スループットで半定量的なフローティングゲルアッセイアプローチのみが十分に成熟し、研究者が利用できるようになったことです(図1参照)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig01.jpg"> 図1:FLECS技術法の全体的な概略図。(A)細胞は、ガラスで支持された薄いエラストマー層に共有結合で埋め込まれた接着タンパク質マイクロパターンに接着される。(B)様々な可能なマイクロパターン形状の上面図と、「X」字型のマイクロパターンを収縮させるセルの爆破。(c)収縮細胞の蛍光マイクロパターンと位相差画像のオーバーレイ。(D)単一の収縮細胞の経時変化画像。スケールバー = 25 μm。この図はプシュカルスキーらの許可を得て翻案された15。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
マイクロテクノロジーの最近の進歩に続いて、著者らは、FLECS(蛍光標識されたエラストマー収縮性表面)と呼ばれる数十万の細胞における単一細胞収縮の定量的測定を可能にするマイクロプレートベースの技術を開発しました15,16,17,18,19,20。、TFM の代替として。このアプローチでは、蛍光タンパク質のマイクロパターンが柔らかいフィルムに埋め込まれ、細胞が牽引力を加えると変形および収縮します。重要なことに、タンパク質マイクロパターンは細胞の位置、形状、および広がり領域を制約し、均一な試験条件をもたらす。これらは、4倍の倍率画像でも空間的に高度に分解される寸法変化のみに基づいて簡単な測定を可能にします。この方法は、ブラウザベースの画像解析モジュールを含み、繊細な取り扱い手順や受託者マーカーの登録を必要とせずに、収縮性細胞力の簡単な解析を可能にし、基本的な細胞培養施設と低倍率の単純な蛍光顕微鏡を備えた研究者であれば誰でも操作できるはずです(図2).この技術は、すぐに入手でき、市販されており、エンドユーザーを念頭に置いて設計されており、実験室の科学者が細胞力生物学を研究するための参入障壁を減らすことを目的としています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig02.jpg"> 図2:単一細胞収縮性アッセイ用の24ウェルプレートフォーマットの概略図。 この形式は、ここに記載されている実験で使用され、記事のビデオ部分に描かれています。スケール バー = 25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
この研究では、FLECSテクノロジープラットフォームの24ウェルプレート形式を適用して、原発性膀胱平滑筋細胞の細胞収縮性に対する力調節薬の効果を定量化するためのプロトコルを提示する。この汎用プロトコルは、関心のある他のさまざまなタイムスケール、細胞型、および治療条件を説明するために必要に応じて適応および変更することができ、力生物学における他の質問に答えるためにスケーリングすることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bladder smooth muscle cell culture</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td>Ham&#39;s F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7201432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FB012941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>ImageXpress Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcyte-manufactured 24-well plate</td>
			<td>Forcyte Biotechnologies</td>
			<td>24-HC4R-X1-QB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 3342 Live Nuclear Stain</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers

細胞収縮力生成は、事実上すべての細胞に共通する基本的な形質である。これらの収縮力は、適切な発達に不可欠であり、細胞レベルと組織レベルの両方で機能し、体内の機械的システムを調節する。多数の生物学的プロセスは、運動性、接着、および単一細胞の分裂、ならびに心臓、膀胱、肺、腸、および子宮などの器官の収縮および弛緩を含む、力に依存する。適切な生理学的機能を維持する上での重要性を考えると、細胞収縮性はまた、誇張または破壊されたときに疾患プロセスを促進する可能性がある。喘息、高血圧、早産、線維性瘢痕化、および不活動膀胱はすべて、細胞収縮力の適切な制御によって潜在的に緩和され得る機械的に駆動される疾患プロセスの例である。ここでは、蛍光標識エラストマー収縮性表面(FLECS)として知られる新しいマイクロプレートベースの収縮性アッセイ技術を利用するための包括的なプロトコルを提示し、単一細胞収縮性の簡便で直感的な分析を大規模に行うことができます。本明細書では、我々は、原発性ヒト膀胱平滑筋細胞の収縮に対する2つの収縮阻害剤の効果を記述する2つの6点用量反応曲線を得るための段階的なプロトコールを、単一のFLECSアッセイマイクロプレートを利用する簡単な手順で提供し、この方法の使用者に適切な技術を実証する。FLECS技術を使用すると、基本的な生物学研究所と蛍光顕微鏡システムを持つすべての研究者は、この基本的ではあるが定量化が困難な機能的な細胞表現型の研究にアクセスでき、力生物学の分野への参入障壁を効果的に低下させ、収縮性細胞力の表現型スクリーニング。

DMSOのみで処理したウェルと40μMのブレビスタチンで処理したウェルから取得した画像の領域を 図3に並べて示す。DMSOのみの処理された細胞は、その井戸内の膀胱平滑筋細胞(BSMC)によって接着されたマイクロパターンの非常に顕著な変形に基づいて有意なレベルの収縮を示すことが明確に観察され得る。逆に、40μMのブレビスタチンで処理したウェルの画像では、BSMCによって接着されたマイクロパターンが細胞によって接着されていないマイクロパターンとサイズがほとんど区別できないため、有意な細胞弛緩が観察され7 、最小限の収縮を示す。これらの画像は、蛍光マイクロパターニング法によって提供される単一細胞収縮性の直感的で明確な視覚的表現を示しています。高密度の細胞単層の下にランダムに分布する多数の蛍光粒子の全方向移動が相対的な収縮力を伝えることを意味するTFMベースの方法とは異なり、ここでは、マイクロパターンの均一でマークされた収縮形状は、個々の細胞の収縮に関する即時かつ容易に解釈可能な定性的情報を提供する。これらは、画像に標準のバイナリオブジェクト操作を適用することによって直接定量化できます。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig03.jpg"> 図3:1%DMSO処理のみを含むウェル(左)または40μMのブレビスタチンを含むウェル(右)で撮影した画像を並べて比較した。 ブレビスタチンによる治療は、より大きな非収縮マイクロパターンによって示されるように、単一細胞の収縮性を有意に低下させることが明確に観察され得る。青い核は、どのマイクロパターンが細胞によって結合しているかを示す。スケール バー = 25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ブラウザベースの解析モジュールを適用して、取得したマイクロパターンと細胞核の画像ペアを解析することにより、 図4に示すように、集団ごとに単一細胞収縮性分布が得られる。FLECS方法論に関する以前の報告書15で詳細に説明されているように、この分析は、各「X」字型マイクロパターンの位置と向きを特定し、各マイクロパターンの中心に直接付着した核の数を数え、各マイクロパターンの平均長さを計算し、空のマイクロパターンの平均長さに対する各マイクロパターンの収縮のピクセル距離を計算することによって機能します(ゼロ収縮基準)。したがって、空のマイクロパターンは、収縮データを正規化する重要な目的を果たす。重要なことに、マイクロパターンに結合しない細胞は、微小電流のために井戸境界に蓄積し、画像解析には影響しません。これらのプロットに見られるように、DMSOコントロールのみで処理された細胞集団の摂動のない収縮性は、20ピクセルという広い範囲にまたがり、中心は約10ピクセルに見られます。一方、ブレビスタチンで処理された細胞は収縮が著しく少なく、その分布は6ピクセル強の中心に押し下げられます。重要なことに、細胞上で正確に結合する画像に見られるすべてのマイクロパターンは、これらの分布で表されます。これは、薬物治療に異なる細胞応答を伝える方法の能力を実証する。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig04.jpg"> 図4:1%DMSOのみ(青色)または40μMブレビスタチンを含むウェルについて撮影した画像の分析から得られた単一細胞収縮性データを示すヒストグラム。 DMSO処理細胞の分布は、ブレビスタチン処理分布よりもはるかに大きな収縮値(〜10ピクセル)で広く中心にあり、細胞をブレビスタチンで処理することの定量的効果を実証する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
単一の24ウェルプレート上のすべてのウェルを利用し、ウェルあたり少なくとも3つの部位をイメージングすることにより、2つの薬物化合物について6点の用量反応曲線が同時に生成される。 図5 は、同じ用量のブレブビスタチンまたはサイトカラシンD(いずれも既知の収縮性阻害剤)で処置したBSMCについての濃度応答データを示す。濃度応答プロファイルから明らかなように、サイトカラシンDは、これらの細胞における強壮収縮のより強力な阻害剤である。シグモイド曲線をデータポイントに当てはめることにより、各薬剤のIC50 値を計算できます。我々の実験は、IC50 がブレビスタチンおよびサイトカラシンDについてそれぞれ7.9μMおよび100nMであり、薬物への〜30分間の曝露後であることを示している。重要なことに、全体として、これらの値は、収縮阻害剤の効力を決定するための方法の定量的精度を検証し、 以前の報告と一致している7、21。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig05.jpg"> 図5:単一細胞における細胞収縮性に対するブレブビスタチンおよびサイトカラシンDの効果を示す濃度応答曲線。 各データ ポイントは、その条件の 3 つの画像で構成されます。シグモイド曲線を各データセットに適合させた。結果は、サイトカラシンDがより強力であり、より低いIC50 値を有することを示している。このデータは、単一の24ウェルFLECSプレートから収集可能です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

この研究は、蛍光タンパク質マイクロパターンの可視化された変位に基づいて単一細胞収縮力の単純化されたハンズオフ定量化のために、マイクロウェルフォーマットで蛍光標識エラストマー収縮性表面(FLECS)技術を利用するための柔軟なプロトコルを提示する。

マイクロパターンエラストマーを使用したシングルセル収縮性の簡素化されたハイスループット分析

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

細胞が生成する機械的な力は、体全体のさまざまな臓器で適切に機能するために不可欠です。さらに、腸の膀胱、心臓など。これらの器官は、細胞収縮および弛緩の安定したパターンを生成しなければならず、内部止血状態を維持する。異常な平滑筋細胞収縮は、筋肉収縮を伴う腸の異常なパターンを特徴付ける腸運動障害、ならびに過活動または低活動膀胱のような状態を含む様々な障害の発症をもたらし得る。そして気道では、不規則なパターンを収縮させるいくつかの筋肉細胞は、喘息の過敏症を引き起こす可能性があります。明らかに、細胞および組織内の収縮メカニズムは、治療の選択肢を必要とする疾患につながる可能性がある。そして、これらの状態は細胞の機能不全の収縮挙動から直接生じる可能性があるため、潜在的な薬物候補をスクリーニングする際には、細胞の収縮機能自体を測定することが論理的かつ必要になります。マイクロ技術の最近の進歩に続いて、単一細胞収縮の定量的測定を可能にするユーザーフレンドリーなマイクロプレートベースのアッセイを開発しました。フレックスと呼ばれる数十万の細胞において、蛍光標識エラストマー収縮可能な表面としても知られている。このアプローチでは、蛍光タンパク質のマイクロパターンを埋め込むため、細胞が牽引力を加えると変形して収縮する柔らかい膜が埋め込まれます。重要なことに、タンパク質のマイクロパターンは、細胞の位置、形状および広がり領域を制約する。均一な試験条件により、それらの寸法変化のみに基づいて簡単な測定が可能になる。全体として、ブラウザベースの画像解析モジュールを含むこのプラットフォームは、繊細な取り扱い手順や受託者マーカーの登録を必要とせずに、契約可能な細胞力の簡単な分析を可能にし、基本的な細胞培養と低倍率の簡単な蛍光顕微鏡で任意の研究者が操作できます。この技術は、エンドユーザーを念頭に置いて設計されており、細胞力生物学を研究するための実験室の科学者の参入障壁を減らすことを目指しています まず、20ミリリットルの培地を慢性チューブに追加し、細胞収縮性をアッセイするように設計された24ウェルプレートを取得します。ピペットを500マイクロリットルに設定し、細胞病原体用のセルストレーナーを入手してください。24ウェルプレートの蓋を外し、プレートをそのように保持してから、プレートの上にあるプラスチックの層を静かに取り除きます。プレートを慎重に下ろします。こぼれを防ぐために、各井戸から最上層PBSだけを吸引します。次に、一度に1列ずつ、残りのPBSをウェルから取り出し、500マイクロリットルの細胞培地で迅速に充填する。プレートを優しく振って、その側面をタップして、ウェルの底全体が溶液で覆われていることを確認します。すべてのウェルがメディアで満たされたら、プレートを横に置きます。この時点で、インキュベーターから細胞培養物を取得します。我々は、強固なアソシエーションプロトコルを実施します。このプロトコルの目的は、1ミリリットルあたり50,000個の細胞の懸濁液を作成することである。細胞を播種する前に、細胞の塊を単一の細胞に分解するために、ストレーナーを通して一度細胞にこすりを加えるようにしてください、慎重に500マイクロリットルの細胞溶液を各ウェルに入れてください。細胞播種後、細胞がパターンに直接定着できるように、プレートを1時間放置することが重要です。1時間が経過した後、プレートを一晩インキュベーターに入れます。実験の第2の部分は、24ウェルプレートに薬物を添加し、プレートの蛍光イメージングからなる。プロトコルのこの部分には、堅牢な細胞生存率と応答を保証するための2つの重要な要件があります。1つ目は、細胞を含むウェル内のDMSOの最終濃度が1%以下であることを意味し、薬物ストックから100個の完全希釈を行う必要があります。2つ目は、DMSOを井戸に直接加えることができないのは、DMSOがその混合の底に衝突し、高濃度で細胞に害を及ぼすからです。代わりに、DMS0薬物と培地の中間溶液を作成し、細胞への高い局所DSSO曝露を避けるために徹底的に混合する必要があります。このプロトコールでは、40マイクロモルから1ナノモルまでの範囲をカバーする6段階8倍希釈を行います 30マイクロリットルの原薬液を連続した210マイクロリットル容量のDMSOに移し、各転写工程間で徹底的に混合することにより、6段階8倍希釈シリーズを作成します実験では、 ブレビスタチンの効果を評価します。筋肉細胞を通るヒトの膀胱上。両方の要件を満たすために、まず中間薬DMSOと培地溶液を作成します。これにより、DMSOの16.7倍希釈が得られる。次に、この中間薬液を細胞に追加し、さらに6倍の希釈をもたらす割合を使用して、合計100個の完全希釈および1%DMSOの最終濃度をもたらすこれを達成するために、各ストック薬物溶液について、30マイクロリットルの薬物を470マイクロリットルの細胞培養培地に混合し、次いで、この中間溶液の200マイクロリットルを24ウェルプレート上の適切なウェルに移す。 各ウェルに1000マイクロリットルが含まれています。これは、集合的に、適切な量の時間にわたって1%終濃度のDMSOインキュベートを生じる。私たちの実験では、30分間インキュベートし、画像化する準備ができたら、ウェルズ全体に生きた核染色剤を加え、ストックから1〜10,000希釈を加えます。さらに15分間インキュベートさせます。イメージングの準備ができたら、標識された細胞核と蛍光色素の両方の蛍光チャネルをイメージングするための蛍光顕微鏡が必要になります。マイクロパターンにはラベルが付けられており、この例ではtri Cチャネルです。さて、単一細胞を同定するためにブレビスタチン核を蛍光イメージングし、分析中に整列できるようにマイクロパターンを見るのとまったく同じ位置に染色細胞核を画像化してください。取得した画像をコンピュータにアップロードし、パターンチャンネルがアンダースコアPTで終わるように、画像に適切なラベルが付けられていることを確認します。そして、核チャンネルの画像は、ダピを強調することで終わります。次に、画像Jを使用して、tif画像をPNG画像に変換します画像Jが開いたら、一度に1つのチャンネルにロードします。最初にパターンチャンネルをロードし、コントラストを調整して、信号を最大化し、背景を最小限に抑えます。さらに、画像を平滑化します。画像が好みに合わせて変更されたら、画像タイプを8ビットに変更します。次に、画像をPNGタイプとしてエクスポートします。次に、チェックボックスをオンにして、スライスラベルをファイル名として使用します。PNG という名前の新しいフォルダーを作成します。次に、そこにPNGファイルを保存し、画像を分析するには、BiodockドットAIに移動し、アカウントを作成し、分析モジュールへの無料アクセスを得るために著者に連絡します。アカウントが作成されたらログインします。ここでは、新しい画像をアップロードすることができます。この新しいバッチを Web 実験データJoVEと呼びます。これで、画像をドラッグしてからドロップしてインポートし、こ OK.At ポイントを押してデータを選択します。次に、解析をクリックし、収縮性解析というラベルの付いたモジュールまでスクロールダウンし、selectを押します。イメージングに使用したのと同じ値に倍率を設定します データが完了したら、それをクリックしてから、データのダウンロードを選択できます。データがダウンロードされると、入力されたすべての画像のオーバーレイされた画像ペアを確認できます。また、各セルセットの平均収縮を示す要約統計量にもアクセスできます。収縮の測定単位はピクセル単位です。ここでデータを見ると、DMSOのみで処理したウェルでは、ブレビスタチンで処理した細胞と比較して細胞の収縮がはるかに高かったことがわかります。また、どの画像でも検出されたすべてのパターンのデータにもアクセスできます。これにより、画像の位置、画像の原点、位置タイプ、細胞数、ゼロ1つまたは1つ以上、マイクロパターンのサイズ、および計算された細胞の収縮に関する詳細情報が得られます。このレイは、マイクロプレート内の識別されたすべてのパターンで構成されています。このリストからの単一セルパターンを平均化し、他のファイル内のPNG画像に対する平均収縮を計算した。実験の必要に応じて、単一セル データを並べ替えて分析できます。ビデオのこの部分では、2つの異なる薬物で処理した膀胱平滑筋細胞からの応答データを示す24ウェルプレートから収集可能な代表的なデータを表示します。これらは、それぞれDMSOおよびブレビスタチンで処理したウェルの画像である。ここで、DMSOのみで処理した細胞は、多数の収縮マイクロパターンを表示するが、ブレビスタチンで処理した細胞は大きく、収縮が少ないことに注意する。このヒストグラムのデータは、細胞に対する異なる処理の結果としての細胞収縮性の変動を表示します。ブレビスタチンで処理した細胞の分布の中心は、DMSOで処理した細胞の分布の中心よりも低い。これは、前の画像に表示された情報と一致しています。ブレビスタチンで処理された細胞ははるかに小さい収縮を示したからである。これは、ブレビスタチンによる治療が細胞を有意に弛緩させることを意味する。これらのデータセットのそれぞれは、ビデオに示されているプロトコルに従って、単一の24ウェルプレートから収集可能な用量反応曲線上のポイントに寄与する。ここで、サイトカラシンDは、薬物の濃度が高いほど収縮の値が低いことからわかるように、ブレビスタンよりも強力であることがわかります。実験を大幅にスケーリングしたい場合は、384ウェルプレートバージョンが利用可能で、これを自動化とともに使用して実験を劇的にスケーリングすることができます。このデータは384ウェルプレートから収集可能であり、24ウェルプレート上の各薬物に対して6つの希釈ステップを有するのではなく、384ウェルプレートは複数の反復で各薬物に対して20の希釈ステップを実施することを可能にする。スノーフレーク技術はユニークです。これまで不可能であった顕微鏡による単一細胞収縮の可視化を可能にします。したがって、技術は、蛍光標識されたタンパク質でパターン化されたメトリックの形式に依存しています。系統的パターンは、細胞収縮のために形成され、任意の所与の薬物による表現型の収縮の調節の正確な測定を可能にする。もちろん、この技術は、喘息、心血管疾患、炎症免疫腫瘍学、そしてもちろん、異常な細胞収縮が疾患の進行に重要な役割を果たす疾患適応症など、多くの異なる疾患領域への応用および多くの異なる疾患領域のためにまだ積極的に開発されている。細胞の収縮性を測定するためのこのマイクロパターニングベースの技術は、従来の牽引力顕微鏡に代わるシンプルな代替手段を提供し、直感的な分析を提供し、パターンの縮小を監視し、大規模な細胞集団で単一細胞分解能を提供します。いくつかの考慮事項は、この方法は、T細胞および好中球などの小さすぎる細胞、または接着しない細胞型のいずれかの使用に課題を提起する可能性がある。さらに毎週結合する細胞は、主に互いに結合するか、または完全には広がらない細胞は、測定可能な収縮シグナルを産生しないであろう。この技術のユーザーは、特定の細胞タイプに対して異なる可能な細胞培養培地製剤を慎重に評価する必要があります。異なる成分として、成長因子、血清レベルおよびpH感受性は、可変的な行動を促進する可能性がある。プロトコルの最適化は、実験的なワークフローのスケーリングを進める必要があります。最終的に、単一細胞分解能が必要ない場合、または標的細胞型が最小の拡散能力を有する場合、そのような実験には従来の吸引力顕微鏡法を採用することができる。さもなければ、このツールが細胞生物学者が細胞収縮を研究し、彼らの研究を実行するための追加の道を提供することを願っています。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

成熟ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞単分子膜を用いたハイスループット心毒性スクリーニング

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...