Name: simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers
Uploaded: 2022-04-08T13:00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers at JoVE.com

Laboratoriearbetet utfördes med stöd av UCLA Molecular Shared Screening Resource (MSSR) där Forcyte sponsrar forskningsverksamhet, och Magnify Incubator vid California NanoSystems Institute (CNSI), där Forcyte Biotechnologies, Inc. är ett bosatt företag. Författarna kommer att ge tillgång till Biodock.ai FLECS-analysmodulen till alla akademiska forskare på begäran. L.H. och I.P. bidrog lika mycket till detta arbete.

1. Dag 1: Förberedelse av 24 brunnsplattan
<ol><li>Börja proceduren genom att lägga till 20 ml av cellodlingsmediet i ett koniskt rör på 50 ml. I detta experiment används F12 Hams baserade medium kompletterat med 10% fetalt bovinserum (FBS).</li>
	<li>Skaffa en 24 välplatta utformad för att analysera cellkontraktilitet. Ställ pipetten på 500 μL och skaffa en cellsil för cellpassning. OBS: Plattan är tillgänglig från författarna på begäran.</li>
	<li>Lyft och håll plattan i ena handen och fortsätt att försiktigt skala plastfilmen från toppen av plattan. Ställ sedan försiktigt ner plattan igen.</li>
	<li>Slå på en vakuumaspirator och aspirera det övre lagret av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) från brunnarna för att förhindra spill. Ta bort PBS en rad i taget. När brunnarna inte längre är helt fulla, håll plattan i ena handen och ta försiktigt bort resten av PBS från brunnarna. Fyll snabbt med 500 μL cellodlingsmedium. Var noga med att undvika kontakt mellan aspiratorn och botten av brunnen.</li>
	<li>Skaka plattan försiktigt och knacka på sidan för att säkerställa att hela botten av brunnen är täckt med lösning. När alla brunnar är fyllda med medium, ställ plattan åt sidan.</li>
</ol>2. Dag 1: Cellsådd
<ol><li>Hämta odlingskolven med passage 7 eller lägre primära mänskliga urinblåsan glatt muskel (BSM) celler från 37 °C inkubatorn. Under ett mikroskop, kontrollera cellmorfologi och se till att cellerna har vuxit till minst 90% sammanflöde men mindre än 100% sammanflöde.</li>
	<li>Utför protokollet för cell dissociation. I ett sterilt biosäkerhetsskåp, trypsinize cellerna i 2,5 min tills cellerna är fristående innan de släcks med serum-kompletterat medium (10% FBS).</li>
	<li>När cellerna har dissocierats, använd en hemocytometer för att räkna cellerna och späda cellupphängningen till cirka 50 000 celler/ml i serumtillskott. Viktigt är att cellerna kräver minst 2% serum för att fästa vid mikromönster.</li>
	<li>Före sådd, sila snabbt cellupphängningen genom en 40 eller 100 μm cellsil i ett koniskt rör på 50 ml med en serologisk pipett för att bryta upp klumpar av celler i enstaka celler.</li>
	<li>Tillsätt försiktigt 500 μL av de 50 000 cellerna/ml-cellupphängningen i var och en av de 24 brunnarna på plattan med hjälp av en P1000-pipett genom att dispensera lösningen droppvis över olika positioner i brunnarna.</li>
	<li>Efter cellsådd, låt plattan sitta i rumstemperatur i 1 h för att låta cellerna sätta sig direkt på mikromönster utan att påverkas av mikroströmmar som genereras av avdunstning. Efter 1 h, placera plattan i en 37 °C inkubator över natten. Cellerna kommer att självmontera och spridas över de självhäftande mikropatternerna under denna tid och börja utöva basala sammandragningsnivåer.</li>
</ol>3. Dag 2: Tillsats av testläkemedel
OBS: Den slutliga koncentrationen av dimetylsulfoxid (DMSO) i brunnarna som innehåller vidhäftade celler får inte överstiga 1% och läkemedlet/DMSO kan inte tillsättas direkt till cellerna utan bör först spädas ut och blandas till en mellanliggande lösning av cellmediet.
<ol><li>Skapa en sexstegs, åttafaldig läkemedelsutspädningsserie genom att överföra 30 μL av stamläkemedlet till på varandra följande 210 μL-volymer DMSO och blanda noggrant mellan varje överföringssteg. I detta arbete bereds en sexstegs, åttafaldig utspädningsserie av blebbistatin i doser från 40 μM till 1 nM, i DMSO.</li>
	<li>För varje stamläkemedelslösning (från steg 3.1), blanda 30 μL läkemedel i 470 μL cellodlingsmedium. Mellanlösningen ger en 16,7-faldig utspädning av DMSO.</li>
	<li>Överför 200 μL av varje mellanliggande lösning till lämplig brunn på 24-brunnsplattan (som redan innehåller 100 μL medium i varje brunn). Detta ger ytterligare en sexfaldig utspädning av DMSO.</li>
	<li>Steg 3.2 och 3.3 ger tillsammans en 1% slutlig koncentration av DMSO i brunnarna.</li>
	<li>Placera den behandlade plattan i en inkubator på 37 °C under lämplig tid. För detta experiment används en inkubation på 30 minuter.</li>
	<li>Omedelbart före avbildningen tillsätt Hoechst 33342 levande kärnfläcklösning till varje brunn (1:10 000 slutlig utspädning). Låt den inkubera i ytterligare 15 minuter för att märka cellkärnorna.</li>
</ol>4. Dag 2: Avbilda brunnsplattan
<ol><li>Få tillgång till ett mikroskop som är utrustat för att avbilda kanalerna för både cellkärnorna (DAPI) och mikromönster (TRITC).</li>
	<li>Avbilda först endast cellerna med DMSO.</li>
	<li>Fokusera sedan på och avbilda både mikromönster och de märkta cellkärnorna för att identifiera enstaka celler och se till att båda kanalerna är perfekt justerade för att möjliggöra automatiserad bildanalys.</li>
	<li>Upprepa på flera positioner i var och en av de 24 brunnarna på plattan. Bilder kan tas med 4x-objektiv (eller valfritt högre för att påskynda avbildning och få maximala datapunkter per bild).</li>
	<li>Exportera bilderna som TIF-filer och öppna dem på en webbansluten dator med ImageJ för att analysera data.</li>
</ol>5. Efterexperiment: Bildanalys
OBS: Bildanalys utfördes med hjälp av Biodock.ai portal- och bildbehandlingsprogram.
<ol><li>Ladda upp de förvärvade bilderna till en dator.<ol>
<li>Se till att motsvarande par mikromönster- och kärnbilder namnges korrekt.</li>
		<li>Se till att mikromönsterbildnamn alla har formen "sharedCoreName_pt.tif".</li>
		<li>Se till att nuclei-bildnamn alla har formen "sharedCoreName_dapi.tif".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konvertera bilder från TIF till PNG med ImageJ.<ol>
<li>När ImageJ har öppnats läses in i en kanal i taget. För det här experimentet läser du först in mikropattern-avbildningar som en stack i ImageJ.</li>
		<li>Använd Bild > Justera > ljusstyrka/kontrast, justera bildens ljusstyrka för att framhäva mikromönster och minska bakgrunden till svart. Utöver detta jämnar du ut bilderna.</li>
		<li>Konvertera bilderna till 8-bitars med bild > typ > 8-bitars.</li>
		<li>Exportera sedan bilden till PNG-typ och markera rutans segmentnivå som filnamn. Skapa nu en ny mapp-PNGs och spara PNG-filerna där med samma namn.</li>
		<li>Upprepa den här processen för nukleibilder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ladda upp PNG-bildpar till bildbehandlingsprogramvaran för analysen.<ol>
<li>Skapa och validera kontot. Författarna har ett konto för att möjliggöra öppen åtkomst till akademiska användare.</li>
		<li>Validera kontot genom att kontakta författarna.</li>
		<li>Logga in på programvaran.</li>
		<li>Klicka på Ladda upp batch under fliken Data till vänster.</li>
		<li>Importera bilderna genom att dra och släppa bildpar i fönstret som dyker upp och namnge batchen. Klicka på OK.</li>
		<li>Markera rutan bredvid batchnamnet och klicka på Analysera.</li>
		<li>På nästa skärm bläddrar du nedåt och markerar rutan bredvid Kontraktilitetsanalys och klickar på Markera. Längre ner på sidan väljer du 10x som den förstoring som användes för avbildning från en rullgardinsmeny.<ol>
<li>Klicka på Skicka. När dataanalysen har läst Slutförd klickar du på batchnamnet. Klicka på Hämta data till höger på sidan på nästa skärm. OBS: De nedladdade filerna kommer att innehålla bilder som analyserades, sammanfattande resultat som rapporterar genomsnittlig sammandragning i varje bild och en detaljerad analys av varje mikromönster som upptäcktes i någon bild, rapporterar deras storlekar, positioner, antal celler som klibbats och sammandragning.</li>
			<li>Plotta sammandragningsvärden mot läkemedelskoncentrationer för att generera en koncentrations-responskurva och bestämma de relativa potenciesna för olika behandlingar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+abnormal+intestinal+motility+in+inflammatory+bowel+disease:+How+smooth+muscle+contraction+is+reduced.">Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).</li><li>Peyronnet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+review+of+overactive+bladder+pathophysiology:+On+the+way+to+tailored+treatment.">A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment.</a> European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).</li><li>Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underactive+bladder:+Pathophysiology+and+clinical+significance.">Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance.</a> Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).</li><li>Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+cell+contractility+by+Ca2++signaling+and+sensitivity.">Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).</li><li>Brozovich, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+smooth+muscle+contraction+and+the+basis+for+pharmacologic+treatment+of+smooth+muscle+disorders.">Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders.</a> Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+an+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Rokhzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+measurements+of+cell+contraction+and+endothelial+barrier+function.">high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function.</a> Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).</li><li>Park, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell+microarray+platform+for+correlative+analysis+of+cell+differentiation+and+traction+forces.">A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55362 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+with+optimized+regularization+and+automated+Bayesian+parameter+selection+for+comparing+cells.">Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells.</a> Scientific Reports. 9, 539 (2019).</li><li>Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+traction+force+microscopy:+A+new+tool+for+quantifying+cell-matrix+interactions.">Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions.</a> PLOS ONE. 6, 17833 (2011).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Pushkarsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLECS+technology+for+high-throughput+single-cell+force+biology+and+screening.">FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).</li><li>Koziol-White, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PI3K+promotes+dilation+of+human+small+airways+in+a+rho+kinase-dependent+manner.">Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).</li><li>Orfanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+airway+smooth+muscle+responses+to+contractile+agonists.">Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).</li><li>Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallization+and+biopatterning+on+ultra-flexible+substrates+via+dextran+sacrificial+layers.">Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers.</a> PLOS ONE. 9, 106091 (2014).</li><li>Yoo, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;12+facilitates+shortening+in+human+airway+smooth+muscle+by+modulating+phosphoinositide+3-kinase-mediated+activation+in+a+RhoA-dependent+manner.">G&#945;12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).</li><li>MacGlashan, D., Vilari&#241;o, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerization+of+actin+does+not+regulate+desensitization+in+human+basophils.">Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).</li><li>Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+integrin-mediated+cell+contractility+by+fibronectin+polymerization.">Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).</li><li>Toli&#263;-N&#248;rrelykke, I. M., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+in+smooth+muscle+cells+varies+with+cell+spreading.">Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading.</a> Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).</li><li>Ye, G. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+strength+of+vascular+smooth+muscle+myocytes+is+shape+dependent.">The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent.</a> Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).</li></ol>

I.P. är en uppfinnare på en utfärdad patentfamilj som skyddar metoderna och systemen för FLECS-teknik. R..C D. är alla anställda vid Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. är professor vid UCLA och medgrundare av Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z., och R.D. har ekonomiska intressen i Forcyte Biotechnologies, Inc., som är exklusiv licenstagare av ovanstående patent.

Denna förenklade metod för att kvantitativt mäta sammandragning i hundratusentals celler åt gången under olika behandlingsförhållanden och endast använda vanliga mikroskopiinstrument ger ett tillgängligt alternativ till traditionell TFM för forskare att studera cellulär kraftbiologi. Eftersom den presenterade tekniken ger en visuell visning av cellkontraktion genom att analysera förändringar i regelbundet formade fluorescerande mikromönster, är omfattningen av sammandragningen som produceras av en viss cell intuitivt förstådd - ju mindre mikromönster, desto större är den kontraktila kraften som utövas av cellen.
Genom att erbjuda kontroll över faktorer som form, spridningsområde och vidhäftningsmolekyl som består av mikromönster (alla faktorer som är kända för att reglera cellkontraktilitet22,23,24), eliminerar den presenterade tekniken systematiskt ytterligare variabler som kan förvirra tolkningar av cellkontraktionsstudier.
I detta experiment användes 10 kPa styvhet i gelén och en 70 μm (diagonal längd) micropattern användes bestående av typ IV kollagen. Förutom dessa parametrar kan limmolekylen ersättas med olika kollagener, fibronectin, gelatin och annan extracellulär matris (ECM). Gelens styvhet kan justeras ner till 0,1 kPa och upp i MPa-intervallet. Mikropatterngeometrin kan utformas de novo för att vara vilken form som helst med minimal funktionsstorlek på ~ 5 μm. Dessa parametrar är frikopplade och kan oberoende optimeras för ett visst biologiskt sammanhang.
Denna teknik har i stor utsträckning validerats för att vara kompatibel med mycket självhäftande och kontraktila celltyper av en mesenkymal fenotyp inklusive olika släta muskelcelltyper (primära mänskliga urinblåsan, intestinala, luftstrupe, bronkal, livmoder, aorta och arteriell), mesenkymala stamceller och deras differentierade avkomma, olika fibroblaster (lung-, dermal- och hjärt), myofibroblaster och endotelila celler. Dessutom kommer monocyt-härledda makrofager också att producera stora mätbara fagocytiska kraft på mikromönster, särskilt om mikropattern består av en känd opsonin. Olika cancerlinjer kan också analyseras med metoden.
Metoden kan innebära vissa utmaningar för användningen med celler som antingen är relativt små såsom T-celler och neutrofiler, eller celltyper med en övervägande epitelial fenotyp. Det främsta skälet till detta är att metoden bygger på stark vidhäftning och fullständig spridning av celler över mikromönster för att generera den mätbara kontraktilsignalen. Celler som binder svagt, binder till varandra eller inte sprids helt kommer inte att producera mätbara kontraktila signaler. Dessa beteenden, som är relativt sällsynta, kan mildras genom att justera mikromönsterstorleken för att vara mindre, eller genom att använda alternativa självhäftande molekyler inom mikromönster som bättre främjar vidhäftning och spridning i dessa celler.
Användare av tekniken måste noggrant utvärdera olika möjliga cellodling medium formuleringar för sin specifika cell typ av intresse, eftersom olika komponenter, tillväxtfaktorer, serumnivåer, och pH känsligheter kan driva varierande beteenden i olika celler. Optimering av protokollet bör föregå skalning av alla experimentella arbetsflöden, och mediekomponenter ska alltid vara färska, sterila och överensstämma med tidigare batchar.
I slutändan, om encellsupplösning inte är nödvändig för en användares mål, eller om målcelltypen har minimal spridningskapacitet, kan traditionell TFM vara lika eller mer lämplig för sådana experiment. Författarnas syfte och förhoppning är att detta verktyg ger en ytterligare väg för cellbiologer att studera cellulär sammandragning, särskilt i samband med automatiserade fenotypiska läkemedelsskärmar med hög genomströmning.
Mer specifik för framtida användningsområden i läkemedelsskärmar, högre genomströmningsplattor som en 384-brunn FLECS-platta kan användas. I sådana plattor kan 4x-mål på många mikroskop fånga en hel enda brunn i sitt synfält, vilket säkerställer att alla cellulära kontraktila svar fångas. Genom att använda ett bildsystem med hög genomströmning kan en hel 384-brunnsplatta avbildas på cirka 5 minuter, vilket gör detta system dramatiskt snabbare än andra alternativ, och därför lämpligt för fenotypisk läkemedelsupptäckt med hög genomströmning. Faktum är att författarna rutinmässigt kör veckovisa drogskärmar på ~ 50 384-wellplates (totalt mer än 19 000 brunnar) med hjälp av automatisering.

Cellgenererade mekaniska krafter är viktiga för korrekt funktion i olika organ i hela kroppen såsom tarmarna, urinblåsan, hjärtat och andra. Dessa organ måste generera stabila mönster av cellkontraktion och avslappning för att upprätthålla det inre homeostatiska tillståndet. Onormal glatt muskelcell (SMC) sammandragning kan leda till uppkomsten av olika störningar, inklusive till exempel intestinal dysmotilitet, kännetecknad av onormala mönster av intestinala smidig muskelkontraktion1, liksom de urologiskt förhållandena för överaktiv2 eller underaktiv blåsa3. Inom luftvägarna kan små och medelstora företag som uppvisar oregelbundna sammandragningsmönster utlösa astmatisk hyperresponsivitet4, vilket potentiellt drar åt luftvägarna och minskar luftflödet av syre i lungorna. Ett annat utbrett fysiskt tillstånd, högt blodtryck, orsakas av fluktuationer i den glatta muskelkontraktionen inom blodkärlen5. Det är uppenbart att kontraktila mekanismer inom celler och vävnader kan leda till sjukdomar som kräver behandlingsalternativ. Eftersom dessa tillstånd otvetydigt härrör från cellernas dysfunktionella kontraktila beteenden blir det logiskt och nödvändigt att mäta själva cellkontraktilfunktionen när potentiella läkemedelskandidater kontrolleras.
Med tanke på behovet av verktyg för att studera cellulär kontraktil kraft har flera kvantitativa kontraktionsanalysmetoder utvecklats av akademiska forskare, inklusive dragkraftmikroskopi (TFM)6, mikropatternerad TFM7, flytande gelanalyser8 och elastomeriska mikropostanalyser9. Dessa tekniker har använts i enrättsformat samt multi-well-plate-format i många studier och har till och med föreslagits för tredimensionella kraftmätningar10,11,12,13,14. Medan dessa tekniker har möjliggjort banbrytande forskning inom det expansiva området cellkraftbiologi, har de alla till stor del begränsats till laboratorier med specifika förmågor och resurser, i synnerhet: förmåga att tillverka TFM-substrat, förmåga att korrekt tillämpa komplexa och icke-intuitiva algoritmer för att lösa TFM-förskjutningskartor och relativt exakta mikroskopisystem som kan registrera bilder tagna före och efter provborttagning från scenen (för cellavskiljning). För en otränad forskare kan således inträdesbarriären för att använda dessa metoder vara ganska hög med tanke på den omfattande uppsättningen krav för att tillämpa dessa tekniker. Dessutom kan den bildupplösning som krävs för många befintliga tekniker (40x mål eller högre) avsevärt begränsa experimentell genomströmning, medan bulkmätningsteknik kan maskera bidrag från avvikande celler och förhindra upptäckt av mildare kontraktilskillnader. Observera att så vitt författarna känner till har endast metoden med låg genomströmning och semi-kvantitativ flytande gelanalys mognat tillräckligt för att bli tillgänglig för forskare (se figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig01.jpg"> Figur 1: Flecs-teknikens övergripande schematiskhet.A) Celler fästs vid självhäftande proteinmikromönster som är kovalent inbäddade i ett tunt elastomeriskt skikt som stöds av glas. B) Top-view av olika möjliga mikromönsterformer och en sprängning av en cell som drar ihop en X-formad mikromönster. C) Överlägg av fluorescerande mikromönster och faskontrastbilder av en sammandragande cell. (D) Tidskursbilder av en enda fördragsslutande cell. Skalstänger = 25 μm. Denna siffra anpassades med tillstånd från Pushkarsky et al15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Efter de senaste framstegen inom mikroteknik utvecklade författarna en mikroplatebaserad teknik som möjliggör kvantitativa mätningar av encellskontraktion i hundratusentals celler som kallas FLECS (fluorescerande märkta elastomeriska kontrakterbara ytor)15,16,17,18,19,20 , som ett alternativ till TFM. I detta tillvägagångssätt är fluorescerande proteinmikromönster inbäddade i mjuka filmer som deformeras och krymper när celler applicerar dragkrafter på dem, på ett intuitivt och mätbart sätt. Viktigt är att proteinmikromönster begränsar cellpositionen, formen och spridningsområdet, vilket leder till enhetliga testförhållanden. Dessa tillåter enkla mätningar baserade endast på deras dimensionella förändringar, som är mycket lösta rumsligt även i 4x förstoringsbilder. Metoden omfattar en webbläsarbaserad bildanalysmodul och möjliggör enkel analys av kontraktil cellkraft utan att kräva känsliga hanteringsförfaranden eller registrering av förvaltningsmarkörer, så att den ska kunna användas av alla forskare med en grundläggande cellkulturanläggning och enkelt fluorescerande mikroskop med låg förstoring (figur 2 ). Denna teknik, som är hyllfärdig och kommersiellt tillgänglig, utformades med slutanvändaren i åtanke och syftar till att minska ingångsbarriären för alla laboratorieforskare att studera cellulär kraftbiologi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig02.jpg"> Bild 2: Schematisk av 24-brunnsplåtformatet för encellskontraktilitetsanalysen. Detta format användes i experimenten som beskrivs häri och avbildades i videodelen av artikeln. Skalningsstaplar = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
I detta arbete presenterar vi ett protokoll för tillämpning av 24 brunnsplåtformatet för FLECS-teknikplattformen för att kvantifiera effekterna av kraftmodulerande läkemedel på cellulär kontraktilitet i primära urinblåsan släta muskelceller. Detta allmänna protokoll kan anpassas och modifieras efter behov för att ta hänsyn till olika andra tidsramar, celltyper och behandlingsvillkor av intresse, och skalas för att svara på andra frågor i kraftbiologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bladder smooth muscle cell culture</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td>Ham&#39;s F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7201432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FB012941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>ImageXpress Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcyte-manufactured 24-well plate</td>
			<td>Forcyte Biotechnologies</td>
			<td>24-HC4R-X1-QB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 3342 Live Nuclear Stain</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers

Cellulär kontraktil kraftgenerering är ett grundläggande drag som delas av praktiskt taget alla celler. Dessa kontraktila krafter är avgörande för korrekt utveckling, funktion på både cellulära och vävnadsnivåer, och reglerar de mekaniska systemen i kroppen. Många biologiska processer är kraftberoende, inklusive motilitet, vidhäftning och delning av encelliga celler, liksom sammandragning och avslappning av organ som hjärta, urinblåsa, lungor, tarmar och livmoder. Med tanke på dess betydelse för att upprätthålla korrekt fysiologisk funktion kan cellulär kontraktilitet också driva sjukdomsprocesser när de överdrivs eller störs. Astma, högt blodtryck, prematur arbetskraft, fibrotisk ärrbildning och underaktiv blåsa är alla exempel på mekaniskt drivna sjukdomsprocesser som potentiellt kan lindras med korrekt kontroll av cellulär kontraktil kraft. Här presenterar vi ett omfattande protokoll för att använda en ny mikroplate-baserad kontraktilitetsanalysteknik som kallas fluorescerande märkta elastomeriska kontrakterbara ytor (FLECS), som ger förenklad och intuitiv analys av encellskontraktilitet på ett massivt skalat sätt. Häri tillhandahåller vi ett stegvis protokoll för att erhålla två sexpunkts dos-respons kurvor som beskriver effekterna av två kontraktila hämmare på sammandragning av primära mänskliga urinblåsan smidiga muskelceller i ett enkelt förfarande med bara en enda FLECS analys mikroplatta, för att visa korrekt teknik för användare av metoden. Med hjälp av FLECS-tekniken får alla forskare med grundläggande biologiska laboratorier och fluorescerande mikroskopisystem tillgång till att studera denna grundläggande men svårkvantifiera funktionella cellfenotyp, vilket effektivt sänker inträdesbarriären inom kraftbiologi och fenotypisk screening av kontraktil cellkraft.

Regioner av de bilder som förvärvats från brunnar som endast behandlades med DMSO och de som behandlades med 40 μM blebbistatin visas sida vid sida i figur 3. Det kan tydligt observeras att DMSO-endast behandlade celler uppvisar en betydande nivå av sammandragning baserat på de mycket framträdande deformationer av mikromönster som klibbas med av urinblåsan släta muskelceller (BSMCs) i den brunnen. Omvänt, i bilden av väl behandlas med 40 μM blebbistatin, betydande cell avslappning observeras7 som micropatterns som följs av BSMCs är nästan oskiljbara i storlek från micropatterns som inte följs av celler, vilket indikerar minimal sammandragning. Dessa bilder visar den intuitiva och tydliga visuella representationen av encellskontraktilitet som erbjuds av den fluorescerande mikropatterningsmetoden. Till skillnad från TFM-baserade metoder, där den rundstrålande rörelsen av många fluorescerande partiklar slumpmässigt fördelade under en tät cellmonolayer är avsedd att förmedla relativ kontraktil kraft, ger mikromönsters enhetliga och markerade kontrakterade geometrier omedelbar och lätttolkbar kvalitativ information om sammandragning av enskilda celler. Dessa kan kvantifieras direkt genom att tillämpa standard binära objekt åtgärder på bilderna.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig03.jpg"> Figur 3: Jämförelser sida vid sida av bilder tagna av brunnar som antingen endast innehåller 1% DMSO-behandling (vänster) eller innehållande 40 μM blebbistatin (höger). Det kan tydligt observeras att behandling med blebbistatin avsevärt minskar kontraktiliteten hos de enskilda cellerna, vilket indikeras av de större, okontrakterade mikropatternerna. Blå kärnor anger vilka mikromönster som är bundna av celler. Skalstreck = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Genom att tillämpa den webbläsarbaserade analysmodulen för att analysera de förvärvade bildparen av mikromönster och cellkärnor erhålls encelliga kontraktilitetsfördelningar för varje population enligt figur 4. Analysen beskrivs i detalj i en tidigare rapport om Flecs metodik15 och fungerar genom att lokalisera positionerna och orienteringarna för varje "X"-formad mikromönster, räkna antalet kärnor som klibbas direkt över mitten av varje mikromönster, beräkna medellängden för varje mikromönster och beräkna pixelavståndet för sammandragningen av varje mikromönster med avseende på medellängden för tomma mikromönster (noll sammandragningsreferens). Därför tjänar de tomma mikropatternerna ett viktigt syfte för att normalisera kontraktionsdata. Viktigt är att celler som inte binder till mikromönster ackumuleras på brunnsgränserna på grund av mikroströmmar där de inte kommer att påverka bildanalysen. Som framgår av dessa diagram sträcker sig den ostörda kontraktiliteten hos den cellpopulation som endast behandlas med DMSO-kontroller över ett stort intervall så högt som 20 pixlar, med ett centrum som finns på cirka 10 pixlar. Samtidigt drar celler som behandlas med blebbistatin betydligt mindre och deras fördelning trycks ner till ett centrum av drygt 6 pixlar. Viktigt är att varje mikromönster som finns i bilden som binder exakt på cellen representeras i dessa fördelningar. Detta visar metodens förmåga att förmedla differentierade cellulära svar på läkemedelsbehandlingar.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig04.jpg"> Figur 4: Histogram som visar encelliga kontraktilitetsdata som erhållits från analys av bilder tagna av brunnar som endast innehåller 1% DMSO (blå) eller 40μM blebbistatin. Fördelningen av DMSO-behandlade celler är bred och centrerad vid ett mycket större sammandragningsvärde (~ 10 pixlar) än den blebbistatinbehandlade fördelningen, vilket visar de kvantitativa effekterna av behandling av celler med blebbistatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Genom att använda alla brunnar på en enda 24-brunnsplatta och imaging minst 3 platser per brunn, sex-punkts dos-respons kurvor genereras samtidigt för två läkemedelsföreningar. Figur 5 visar koncentrationssvarsdata för BSMCs som behandlats med samma doser av blebbistatin eller cytochalasin D (båda kända kontraktilitetshämmare). Som framgår av koncentrations-respons profilerna, cytochalasin D är den mer potenta hämmaren av tonisk sammandragning i dessa celler. Genom att anpassa en sigmoidal kurva till datapunkterna kan IC50-värden beräknas för varje läkemedel. Våra experiment visar att IC50 är 7,9 μM och 100 nM för blebbistatin respektive cytochalasin D, efter ~ 30 min exponering för drogerna. Det är viktigt att dessa värden totalt sett överensstämmer med tidigare rapporter, vilket validerar metodens kvantitativa noggrannhet för att bestämma styrkan hos kontraktionshämmare7,21.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig05.jpg"> Figur 5: Koncentrations-respons kurvor som visar effekterna av blebbistatin och cytochalasin D på cellulär kontraktilitet i encelliga celler. Varje datapunkt består av tre bilder för det villkoret. En sigmoidal kurva passade till varje uppsättning data. Resultaten indikerar att cytochalasin D är mer potent, med ett lägre IC50-värde . Dessa data kan samlas in från en enda 24-väl flecs-platta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers at JoVE.com

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Detta arbete presenterar ett flexibelt protokoll för att använda fluorescerande märkta elastomeriska kontrakterbara ytor (FLECS) Teknik i mikrobrunnformat för förenklad, hands-off kvantifiering av encelliga kontraktilkrafter baserade på visualiserade förskjutningar av fluorescerande proteinmikromönster.

Förenklad analys med hög genomströmning av encellskontraktilitet med hjälp av mikropatrerade elastomerer

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Cellgenererade mekaniska krafter är väsentliga för korrekt funktion i olika organ i hela kroppen. Plus tarmblåsan, hjärtat och andra. Dessa organ måste generera stabila mönster av cellkontraktion och avslappning, för att upprätthålla det inre hemostatiska tillståndet.Onormal smidig muskelcellskontraktion kan leda till uppkomsten av olika störningar, inklusive intestinal dysmotilitet känneteckna onormala mönster i tarmen med muskelkontraktion, liksom tillstånd som överaktiv eller underaktiv blåsa. Och i luftvägarna, vissa muskelceller som får några oregelbundna mönster kan utlösa astmatisk hyperresponsivitet. Det är uppenbart att kontraktila mekanismer inom celler och vävnader kan leda till sjukdomar som kräver behandlingsalternativ.Och eftersom dessa tillstånd kan härröra direkt från dysfunktionella kontraktila beteenden hos celler, blir det både logiskt och nödvändigt att mäta själva cellkontraktilfunktionen vid screening av potentiella läkemedelskandidater. Efter de senaste framstegen inom mikroteknik utvecklade vi en användarvänlig mikroplatta baserad analys som möjliggör kvantitativa mätningar av encellskontraktion. I hundratusentals celler som kallas flex, även känd som fluorescerande märkta elastomeriska kontrakterbara ytor.I detta tillvägagångssätt bäddar vi in fluorescerande proteinmikromönster, och så mjuka filmer, som deformerar och krymper när celler applicerar dragkraftkrafter på dem. Viktigt är att proteinmikromönstren begränsar cellpositionen, formen och spridningsområdet. De enhetliga testförhållandena och tillåter enkla mätningar baserade endast på deras dimensionella förändringar.Sammantaget möjliggör plattformen, som innehåller en webbläsarbaserad bildanalysmodul, enkel analys av kontrakterbar cellkraft utan att kräva känsliga hanteringsförfaranden eller registrering av förvaltningsmarkörer och kan drivas av alla forskare med grundläggande cellkulturer och enkelt fluorescerande mikroskop med låg förstoring. Denna teknik är utformad med slutanvändaren i åtanke, och syftar till att minska inträdesbarriären för alla laboratorieforskare att studera cellulär kraftbiologi Börja med att lägga till 20 milliliter media i ett kroniskt rör, få en 24-välplatta utformad för att analysera cellkontraktilitet. Ställ in pipetten på 500 mikroliter och skaffa en cellsil för cellpatogen.Ta bort locket på 24-brunnsplattan, håll upp plattan så, fortsätt sedan försiktigt att ta av plastskiktet ovanpå plattan. Ställ försiktigt ner plattan igen. Aspirera bara toppskikt PBS från varje brunn för att förhindra spill.Nu, en rad i taget, ta bort den återstående PBS från brunnen och fyll snabbt med 500 mikroliter cellmedia. Skaka plattan försiktigt och knacka på sidan för att säkerställa att hela botten av brunnen är täckt med lösning. När alla Brunnar har fyllts med media, ställ plattan åt sidan.Vid denna tidpunkt, hämta din cellkultur från inkubatorn. Vi kommer att föra ett gediget föreningsprotokoll. Syftet med detta protokoll är att skapa en suspension av 50 000 celler per milliliter.Innan du sår cellerna se till att spänna dina celler en gång genom silen, för att bryta upp klumpar av celler i enstaka celler, placera försiktigt 500 mikroliter av din celllösning i varje brunn. Efter cellsådd är det viktigt att låta plattorna sitta i en timme så att cellerna kan sätta sig direkt på mönstren. Efter en timme har gått, placera plattan i en inkubator över natten.Den andra delen av experimentet består av att lägga till drogerna till 24-brunnsplattan och fluorescerande avbildning av plattan. För denna del av protokollet har vi två viktiga krav för att säkerställa robust cell livskraft och respons. Den första är att den slutliga koncentrationen av DMSO i brunnarna med cell inte är mer än 1%, vilket innebär att vi måste göra en 100 full utspädning från våra läkemedelslager.Den andra är att vi inte kan lägga till DMSO så direkt till brunnarna eftersom det kommer att krascha till botten av den blandningen och sedan skada cellerna med en hög nivåkoncentration. I stället måste vi skapa en mellanliggande lösning av DMS0-läkemedel och media, som vi grundligt kan blanda ihop för att undvika hög lokal DSSO-exponering för cellerna. I detta protokoll kommer vi att göra en åttafaldig utspädning i sex steg som täcker ett intervall från 40 mikromolar ner till en Nano-molar Skapa den åttafaldiga utspädningsserien i sex steg genom att överföra 30 mikroliter stamläkemedelslösning till på varandra följande 210 mikrolitervolymer DMSO och noggrant blanda mellan varje överföringssteg i vårt experiment, Vi kommer att utvärdera effekten av blebbistatin.på mänskliga blåsor genom muskelcellerna. För att uppfylla båda kraven kommer vi först att skapa ett mellanliggande läkemedel DMSO och medielösning. Det ger en 16,7 gånger utspädning av DMSO.Sedan kommer vi att lägga till denna mellanliggande läkemedelslösning till våra celler, med hjälp av proportioner som ger ytterligare en sexfaldig utspädning, vilket resulterar i en total 100 full utspädning och den slutliga koncentrationen av 1% DMSO För att uppnå detta, för varje stamläkemedelslösning, blanda 30 mikroliter läkemedel i 470 mikroliter av cellodlingsmedium och överför sedan 200 mikroliter av denna mellanliggande lösning till lämplig brunn på 24-brunnsplattan, som innehåller 1000 mikroliter i varje brunn. Detta ger tillsammans en 1% slutlig koncentration av DMSO Incubate under lämplig tid. I vårt experiment inkuberar vi i 30 minuter, när du är redo att avbilda lägg till en levande kärnfläck över hela dina Wells lägga till en till 10,000 utspädning från beståndet.Låt det inkubera i ytterligare 15 minuter. När du är redo att avbilda behöver du ett fluorescerande mikroskop som är utrustat för att avbilda fluorescerande kanaler för både de märkta cellkärnorna och fluorescerande färgämnet. Mikromönstren är märkta med vilka i vårt exempel är tri C-kanalen.Nu kommer vi att vara fluorescerande bild blebbistatinkärnor för att identifiera enstaka celler, se till att avbilda fläckcellkärnorna i exakt samma position som du ser mikromönstret så att de kan justeras under analysen. Ladda upp de förvärvade bilderna till din dator och se till att bilderna är korrekt märkta, så att mönsterkanalerna slutar i understreck PT. Och bilder i kärnkraftskanalen slutar i understrykning dapi. Nu kommer vi att konvertera tif-bilderna till PNG-bilder, med bild J När bild J är öppen, ladda i en kanal i taget.Vi kommer först att ladda mönsterkanalen och justera kontrasten, för att maximera signalen och för att minimera bakgrunden. Dessutom kommer vi att jämna ut bilden. När bilden har ändrats till vår smak kommer vi sedan att ändra bildtypen till åtta bitar.Exportera sedan bilden som en PNG-typ. Markera sedan rutan och använd segmentetiketter som filnamn. Skapa en ny mapp som heter PNGs.Spara sedan PNG-filerna där, För att analysera bilderna, navigera till Biodock dot AI, skapa ett konto och kontakta författarna för att få fri tillgång till analysmodulen. Logga in när ditt konto har skapats. Här kan du ladda upp nya bilder.Vi kommer att kalla denna nya batch, webbexperimentdata JoVE. Nu kan vi importera bilderna genom att dra dem och sedan släppa dem, trycka på OK.At den här punkten, markera dina data. Klicka sedan på analysera, rulla nedåt till modulen märkt kontraktilitetsanalys och tryck sedan på select.Ställ in förstoringen till samma värde som du använde för avbildning När data är klara klickar du på den så kan vi välja nedladdningsdata. När data har laddats ner kan vi sedan se överläggda bildpar för varje inmatad bild. Vi har också tillgång till en sammanfattande statistik som ger oss den genomsnittliga sammandragningen för varje uppsättning celler.Måttenheten för sammandragning är i bildpunkter. När vi tittar på de data vi kan se här att i de brunnar som endast behandlades med DMSO fanns det en mycket högre sammandragning av celler jämfört med de celler som behandlades med blebbistatin. Vi har också tillgång till data för varje enskilt mönster, som upptäcktes i någon av bilderna.Detta ger oss detaljerad information om bildens placering, bildens ursprung, positiontypen, antalet celler, antingen noll ett eller mer än en, mikromönstrets storlek och den beräknade sammandragningen av cellerna. Denna lay består av varje identifierat mönster i mikroplattan. Encellsmönster från den här listan var genomsnittliga för att beräkna den genomsnittliga sammandragningen för PNG-bilden i den andra filen.Du kan sortera igenom och analysera de enskilda celldata efter behov för experimentet. För den här delen av videon kommer vi att visa representativa data som samlas in från en 24-välplatta som visar dessa svarsdata från urinblåsan glatta muskelceller behandlade med två olika läkemedel. Dessa är bilder av brunnar behandlade med DMSO respektive blebbistatin.Här kan vi se att cellerna som endast behandlas med DMSO visar ett stort antal kontrakt mikromönster men celler som behandlats med blebbistatin var större och öppna för att notera att det finns mindre sammandragning. Data i detta histogram visar variation cellkontraktiliteten som ett resultat av de olika behandlingarna till cellerna. Distributionscentret för celler som behandlats med blebbistatin är lägre än distributionscentrumet för celler som behandlades med DMSO.Detta överensstämmer med informationen som visas i de tidigare bilderna. Eftersom cellerna som behandlades med blebbistatin uppvisade mycket mindre sammandragning. Detta betecknar att behandling med blebbistatin avsevärt slappnar av cellerna.Var och en av dessa datauppsättningar bidrar till en punkt på dosresponskurvan som kan samlas in från en enda 24-välplatta, enligt de protokoll som visas i videon. Här kan vi se att cytochalasin D är mer potent än blebbistan, vilket framgår av de lägre värdena för sammandragning, med tanke på de högre koncentrationerna av läkemedel. Om du vill skala dina experiment avsevärt finns en 384 brunnsplåtsversion tillgänglig, och detta kan användas med automatisering för att dramatiskt skala experimenten.Dessa data kan samlas in från en 384 brunnsplatta, snarare än att ha sex utspädningssteg för varje läkemedel på 24-brunnsplattan, gör 384 brunnsplattan att vi kan genomföra 20 utspädningssteg för varje läkemedel med flera replikat. Snowflakes teknik är unik. Det möjliggör visualisering av encellskontraktion med mikroskopi, vilket hittills har varit omöjligt.Så tekniken förlitar sig på formen av mätvärden som är mönstrade med fluorescerande märkt protein. Systematiskt mönster är att bildas för cellulär sammandragning och möjliggör exakt mätning av modulering av ett kontrakt av fenotyp av ett givet läkemedel. Naturligtvis utvecklas denna teknik fortfarande aktivt för applikationer och många olika sjukdomsområden, såsom astma, hjärt-kärlsjukdomar, inflammation immun onkologi, och naturligtvis någon av våra sjukdomsindikationer där onormal cellulär sammandragning spelar en nyckelroll i sjukdomsprogressionen.När vi demonstrerar denna mikromönsterbaserade teknik för att mäta cellkontraktilitet erbjuder ett förenklat alternativ till traditionell dragkraftmikroskopi, vilket ger intuitiv analys, tittar på mönstret krympa och ge encellsupplösning i stora cellpopulationer. Vissa överväganden, denna metod kan utgöra utmaningar för användning av celler som antingen är för små, såsom T-celler och neutrofiler, eller celltyper som inte klibbar. Dessutom kommer celler som varje vecka binder, binder till varandra övervägande eller som inte helt sprider sig, inte att producera mätbara kontraktila signaler.Användare av tekniken måste noggrant utvärdera olika möjliga cellodlingsmediumformuleringar för sin specifika celltyp. som olika komponenter kan tillväxtfaktorer, serumnivåer och pH-känsligheter driva variabla beteenden. Optimering av protokollen bör fortsätta skalning av alla experimentella arbetsflöden.I slutändan om encellsupplösning inte är nödvändig, eller om målcelltypen har minimal spridningskapacitet, kan traditionella attraktionskraftmikroskopimetoder användas för sådana experiment. Annars hoppas vi att detta verktyg ger en ytterligare väg för cellbiologer att studera cellulär sammandragning och utföra sina studier.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Förbättrad visualisering och kvantitativ analys av läkemedelseffekter Använda Micropatterned celler

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymer Microarrays för hög genomströmning Upptäckt av Biomaterial

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Använda Tomoauto: Ett protokoll för hög kapacitet Automatiserad Cryo-elektron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

En hög kapacitet Cell microarray plattform för Korrelat analys av celldifferentiering och dragkrafter

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering av dynamiska miljöförhållanden med hjälp av en mikrofluidisk enhet med hög genomströmning

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Kardiotoxicitetsscreening med hög kapacitet med mogna humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocytmonolager

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...