Name: simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers
Uploaded: 2022-04-08T13:00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers at JoVE.com

Laboratuvar çalışmaları, Forcyte'ın araştırma faaliyetlerine sponsor olduğu UCLA Moleküler Paylaşımlı Tarama Kaynağı (MSSR) ve Forcyte Biotechnologies, Inc.'in yerleşik bir şirket olduğu California NanoSystems Enstitüsü'ndeki (CNSI) Magnify Incubator'ın desteğiyle gerçekleştirildi. Yazarlar, talep üzerine tüm akademik araştırmacılara Biodock.ai FLECS analiz modülüne erişim izni verecektir. L.H. ve I.P. bu çalışmaya eşit derecede katkıda bulundu.

1. Gün 1: 24 kuyu plakasının hazırlanması
<ol><li>50 mL'lik bir konik tüpe 20 mL hücre kültürü ortamı ekleyerek prosedüre başlayın. Bu deneyde,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş F12 Ham bazlı ortam kullanılmıştır.</li>
	<li>Hücre kontraktilitesini test etmek için tasarlanmış 24 kuyucuklu bir plaka elde edin. Pipetleri 500 μL'ye ayarlayın ve hücre geçişi için bir hücre süzgeci elde edin. NOT: Plaka talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.</li>
	<li>Plakayı bir elinizle kaldırın ve tutun ve plastik filmi plakanın üstünden yavaşça soymaya devam edin. Ardından plakayı dikkatlice geri yerleştirin.</li>
	<li>Bir vakum aspiratörü açın ve dökülmeyi önlemek için fosfat tamponlu salinin (PBS) üst tabakasını kuyucuklardan aspire edin. PBS'yi her seferinde bir satır kaldırın. Kuyular artık tamamen dolu olmadığında, plakayı bir elinizde tutun ve PBS'nin geri kalanını kuyulardan dikkatlice çıkarın. Hızlı bir şekilde 500 μL hücre kültürü ortamı ile doldurun. Aspiratör ile kuyunun dibi arasında temastan kaçınmaya özen gösterin.</li>
	<li>Plakayı hafifçe sallayın ve kuyucuğun tüm tabanının çözelti ile kaplandığından emin olmak için yana dokunun. Tüm kuyucuklar ortamla doldurulduktan sonra, plakayı yana doğru ayarlayın.</li>
</ol>2. Gün 1: Hücre tohumlama
<ol><li>Kültür şişesini 37 °C inkübatörden pasaj 7 veya daha düşük birincil insan mesane düz kas (BSM) hücreleri ile alın. Mikroskop altında, hücre morfolojisini kontrol edin ve hücrelerin en az% 90 akıcılığa ulaştığını, ancak% 100'den az akıcılığa ulaştığından emin olun.</li>
	<li>Hücre ayrışma protokolünü uygulayın. Steril bir biyogüvenlik kabini içinde, serum takviyeli ortam (% 10 FBS) ile söndürülmeden önce hücreler ayrılana kadar hücreleri 2,5 dakika boyunca tripsinize edin.</li>
	<li>Hücreler ayrıştıktan sonra, hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve hücre süspansiyonunu serum takviyeli ortamda yaklaşık 50.000 hücre / mL'ye seyreltin. Önemli olarak, hücreler mikro desenlere bağlanmak için en az% 2 serum gerektirir.</li>
	<li>Tohumlamadan önce, hücre kümelerini tek hücrelere ayırmak için hücre süspansiyonunu 40 veya 100 μm'lik bir hücre süzgecinden serolojik pipetle 50 mL'lik bir konik tüpe hızla süzün.</li>
	<li>50.000 hücre/mL hücre süspansiyonunun 500 μL'sini, çözeltiyi kuyucuklardaki farklı konumlara damla damla dağıtarak bir P1000 pipet kullanarak plakadaki 24 kuyucuğun her birine dikkatlice ekleyin.</li>
	<li>Hücre tohumlamasından sonra, hücrelerin buharlaşma ile üretilen mikro akımlardan etkilenmeden doğrudan mikro kalıplara yerleşmesine izin vermek için plakayı 1 saat oda sıcaklığında bekletin. 1 saat sonra, plakayı gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Hücreler bu süre zarfında yapışkan mikro desenlerin üzerine kendiliğinden toplanacak ve yayılacak ve bazal kasılma seviyelerini uygulamaya başlayacaktır.</li>
</ol>3. Gün 2: Test ilacının eklenmesi
NOT: Yapıştırılmış hücreleri içeren kuyucuklardaki dimetil sülfoksitin (DMSO) nihai konsantrasyonu% 1'i geçemez ve ilaç / DMSO doğrudan hücrelere eklenemez, ancak önce seyreltilmeli ve hücre ortamının bir ara çözeltisine karıştırılmalıdır.
<ol><li>Stok ilacın 30 μL'sini ardışık 210 μL hacimli DMSO'ya aktararak ve her transfer adımı arasında iyice karıştırarak altı adımlı, sekiz katlı bir ilaç seyreltme serisi oluşturun. Bu çalışmada, DMSO'da 40 μM ila 1 nm arasında değişen dozlarda altı adımlı, sekiz katlı bir seyreltme serisi blebbistatin hazırlanmıştır.</li>
	<li>Her stok ilaç çözeltisi için (Adım 3.1'den itibaren), 30 μL ilacı 470 μL hücre kültürü ortamına karıştırın. Ara çözelti, DMSO'nun 16,7 kat seyreltilmesini sağlar.</li>
	<li>Her bir ara çözeltinin 200 μL'sini, 24 kuyucuk plakasındaki uygun kuyucuğa aktarın (her bir kuyucukta zaten 100 μL ortam içerir). Bu, DMSO'nun ek olarak altı kat seyreltilmesini sağlar.</li>
	<li>Adım 3.2 ve 3.3 topluca kuyularda %1'lik bir nihai DMSO konsantrasyonu verir.</li>
	<li>İşlem görmüş plakayı uygun süre boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Bu deney için 30 dakikalık bir inkübasyon kullanılır.</li>
	<li>Görüntülemeden hemen önce, her bir kuyucuğa Hoechst 33342 canlı nükleer leke çözeltisi ekleyin (1:10.000 son seyreltme). Hücre çekirdeklerini etiketlemek için 15 dakika daha kuluçkaya yatmasına izin verin.</li>
</ol>4. Gün 2: Kuyu plakasının görüntülenmesi
<ol><li>Hem hücre çekirdeği (DAPI) hem de mikrodesenler (TRITC) için kanalları görüntülemek üzere donatılmış bir mikroskopa erişin.</li>
	<li>İlk önce hücreleri yalnızca DMSO ile görüntüleyin.</li>
	<li>Ardından, tek hücreleri tanımlamak ve her iki kanalın da otomatik görüntü analizini etkinleştirmek için mükemmel bir şekilde hizalandığından emin olmak için hem mikro kalıplara hem de etiketli hücre çekirdeklerine odaklanın ve görüntüleyin.</li>
	<li>Plakadaki 24 kuyucuğun her birinde birden fazla pozisyonda tekrarlayın. Görüntüler 4x objektifle (veya görüntülemeyi hızlandırmak ve görüntü başına maksimum veri noktaları elde etmek için isteğe bağlı olarak daha yüksek) çekilebilir.</li>
	<li>Görüntüleri TIF dosyaları olarak dışa aktarın ve verileri analiz etmek için ImageJ ile web bağlantılı bir bilgisayarda açın.</li>
</ol>5. Deney sonrası: Görüntü analizi
NOT: Görüntü analizi Biodock.ai portal ve görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
<ol><li>Alınan görüntüleri bir bilgisayara yükleyin.<ol>
<li>İlgili mikrodesen ve nükleer görüntü çiftlerinin doğru adlandırıldığından emin olun.</li>
		<li>Mikro desen görüntü adlarının tümünün "sharedCoreName_pt.tif" biçiminde olduğundan emin olun.</li>
		<li>Çekirdek görüntü adlarının tümünün "sharedCoreName_dapi.tif" biçiminde olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ImageJ'yi kullanarak görüntüleri TIF'den PNG'ye dönüştürün.<ol>
<li>ImageJ açıldıktan sonra, her seferinde bir kanala yükleyin. Bu deney için, önce mikro desen görüntülerini yığın olarak ImageJ'ye yükleyin.</li>
		<li>Görüntü > Parlaklığı / Kontrastı > Ayarlayın, mikro desenleri vurgulamak ve arka planı siyaha düşürmek için görüntü parlaklığını ayarlayın. Buna ek olarak, görüntüleri düzeltin.</li>
		<li>Image > Type > 8 bit seçeneğini kullanarak görüntüleri 8 bit'e dönüştürün.</li>
		<li>Ardından görüntüyü PNG türüne dışa aktarın ve dosya adı olarak kutu dilim düzeyini işaretleyin. Şimdi yeni bir klasör PNG'leri oluşturun ve PNG dosyalarını aynı adla oraya kaydedin.</li>
		<li>Çekirdek görüntüleri için bu işlemi tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analiz için PNG görüntü çiftlerini görüntü işleme yazılımına yükleyin.<ol>
<li>Hesabı oluşturun ve doğrulayın. Yazarların akademik kullanıcılara açık erişim sağlamak için bir hesapları vardır.</li>
		<li>Yazarlarla iletişime geçerek hesabı doğrulayın.</li>
		<li>Yazılıma giriş yapın.</li>
		<li>Soldaki Veri sekmesinin altında, Toplu Uygulamayı Yükle'yi tıklayın.</li>
		<li>Görüntü çiftlerini açılan pencereye sürükleyip bırakarak görüntüleri içe aktarın ve toplu işi adlandırın. Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Toplu iş adının yanındaki kutuyu işaretleyin ve Çözümle'ye tıklayın.</li>
		<li>Bir sonraki ekranda, aşağı kaydırın ve Contractility Analysis'in yanındaki kutuyu işaretleyin ve Seç'i tıklayın. Sayfanın alt kısmında, açılır menüden görüntüleme için kullanılan büyütme olarak 10x'i seçin.<ol>
<li>Submit'i (Gönder) tıklayın. Veri analizi Tamamlandı ifadesini okuduktan sonra parti adına tıklayın. Bir sonraki ekranda, sayfanın sağ tarafındaki Verileri İndir'i tıklatın. NOT: İndirilen dosyalar, analiz edilen görüntüleri, her görüntüde ortalama daralmayı bildiren özet sonuçları ve herhangi bir görüntüde tespit edilen her mikro modelin ayrıntılı bir analizini, boyutlarını, konumlarını, yapışan hücre sayısını ve büzülmeyi bildiren özet sonuçları içerecektir.</li>
			<li>Bir konsantrasyon-yanıt eğrisi oluşturmak ve farklı tedavilerin nispi potansiyellerini belirlemek için kontraksiyon değerlerini ilaç konsantrasyonlarına göre çizin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+abnormal+intestinal+motility+in+inflammatory+bowel+disease:+How+smooth+muscle+contraction+is+reduced.">Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).</li><li>Peyronnet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+review+of+overactive+bladder+pathophysiology:+On+the+way+to+tailored+treatment.">A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment.</a> European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).</li><li>Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underactive+bladder:+Pathophysiology+and+clinical+significance.">Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance.</a> Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).</li><li>Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+airway+smooth+muscle+cell+contractility+by+Ca2++signaling+and+sensitivity.">Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).</li><li>Brozovich, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+vascular+smooth+muscle+contraction+and+the+basis+for+pharmacologic+treatment+of+smooth+muscle+disorders.">Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders.</a> Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+an+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Rokhzan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+measurements+of+cell+contraction+and+endothelial+barrier+function.">high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function.</a> Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).</li><li>Park, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+modulators+of+cellular+contractile+force.">High-throughput screening for modulators of cellular contractile force.</a> Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).</li><li>Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell+microarray+platform+for+correlative+analysis+of+cell+differentiation+and+traction+forces.">A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55362 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+with+optimized+regularization+and+automated+Bayesian+parameter+selection+for+comparing+cells.">Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells.</a> Scientific Reports. 9, 539 (2019).</li><li>Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+traction+force+microscopy:+A+new+tool+for+quantifying+cell-matrix+interactions.">Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions.</a> PLOS ONE. 6, 17833 (2011).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Pushkarsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLECS+technology+for+high-throughput+single-cell+force+biology+and+screening.">FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).</li><li>Koziol-White, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PI3K+promotes+dilation+of+human+small+airways+in+a+rho+kinase-dependent+manner.">Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).</li><li>Orfanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+airway+smooth+muscle+responses+to+contractile+agonists.">Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).</li><li>Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallization+and+biopatterning+on+ultra-flexible+substrates+via+dextran+sacrificial+layers.">Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers.</a> PLOS ONE. 9, 106091 (2014).</li><li>Yoo, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#945;12+facilitates+shortening+in+human+airway+smooth+muscle+by+modulating+phosphoinositide+3-kinase-mediated+activation+in+a+RhoA-dependent+manner.">G&#945;12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).</li><li>MacGlashan, D., Vilari&#241;o, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerization+of+actin+does+not+regulate+desensitization+in+human+basophils.">Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils.</a> Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).</li><li>Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+integrin-mediated+cell+contractility+by+fibronectin+polymerization.">Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).</li><li>Toli&#263;-N&#248;rrelykke, I. M., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+in+smooth+muscle+cells+varies+with+cell+spreading.">Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading.</a> Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).</li><li>Ye, G. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contractile+strength+of+vascular+smooth+muscle+myocytes+is+shape+dependent.">The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent.</a> Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).</li></ol>

I.P., FLECS teknolojisinin yöntemlerini ve sistemlerini koruyan yayınlanmış bir patent ailesinin mucididir. I.P., Y.W., J.Z., E.C. ve R.H., Forcyte Biotechnologies, Inc.'in tüm çalışanlarıdır.

Farklı tedavi koşulları altında bir seferde yüz binlerce hücredeki kasılmayı nicel olarak ölçmek ve sadece standart mikroskopi araçlarını kullanmak için bu basitleştirilmiş yöntem, araştırmacıların hücresel kuvvet biyolojisini incelemeleri için geleneksel TFM'ye erişilebilir bir alternatif sunar. Sunulan teknoloji, düzenli olarak şekillendirilmiş floresan mikro desenlerdeki değişiklikleri analiz ederek hücre kasılmasının görsel bir görüntüsünü sağladığından, herhangi bir hücre tarafından üretilen kasılmanın büyüklüğü sezgisel olarak anlaşılır - mikro model ne kadar küçük olursa, hücre tarafından uygulanan kasılma kuvveti o kadar büyük olur.
Özellikle, mikrodesenleri oluşturan şekil, yayılma alanı ve adezyon molekülü (hücre kontraktilitesini düzenlediği bilinen tüm faktörler22,23,24) gibi faktörler üzerinde kontrol sağlayarak, sunulan teknoloji, hücre kasılma çalışmalarının yorumlarını karıştırabilecek ek değişkenleri sistematik olarak ortadan kaldırmaktadır.
Bu deneyde, jelde 10 kPa sertlik kullanılmış ve tip IV kollajenden oluşan 70 μm (diyagonal uzunlukta) mikrodesen kullanılmıştır. Bu parametrelerin yanı sıra, yapışkan molekül çeşitli kollajenler, fibronektin, jelatin ve diğer hücre dışı matriks (ECM) ile değiştirilebilir. Jelin sertliği 0,1 kPa'ya kadar ve MPa aralığına kadar ayarlanabilir. Mikrodesen geometrisi, ~ 5 μm'lik minimum özellik boyutuna sahip herhangi bir şekil olacak şekilde de novo olarak tasarlanabilir. Bu parametreler ayrıştırılır ve belirli bir biyolojik bağlam için bağımsız olarak optimize edilebilir.
Bu teknolojinin, çeşitli düz kas hücresi tipleri (birincil insan mesanesi, bağırsak, trakeal, bronşiyal, uterus, aort ve arteriyel), mezenkimal kök hücreler ve bunların farklılaşmış soyları, çeşitli fibroblastlar (pulmoner, dermal ve kardiyak), miyofibroblastlar ve endotel hücreleri dahil olmak üzere mezenkimal bir fenotipin yüksek yapışkan ve kontraktil hücre tipleriyle uyumlu olduğu kapsamlı bir şekilde doğrulanmıştır. Ek olarak, monosit türevi makrofajlar, özellikle mikromodel bilinen bir opsoninden oluşuyorsa, mikro desenler üzerinde ölçülebilir büyük fagositik kuvvet üretecektir. Yöntem kullanılarak çeşitli kanser çizgileri de test edilebilir.
Yöntem, T hücreleri ve nötrofiller gibi nispeten küçük hücrelerle veya ağırlıklı olarak epitel fenotipine sahip hücre tipleriyle kullanım için bazı zorluklar doğurabilir. Bunun ana nedeni, yöntemin ölçülebilir kontraktil sinyali üretmek için hücrelerin güçlü yapışmasına ve hücrelerin mikromodel üzerine tamamen yayılmasına dayanmasıdır. Zayıf bir şekilde bağlanan, birbirine bağlanan veya tamamen yayılmayan hücreler ölçülebilir kasılma sinyalleri üretmeyecektir. Nispeten nadir görülen bu davranışlar, mikro desen boyutunu daha küçük olacak şekilde ayarlayarak veya mikro desenler içinde bu hücrelerde yapışmayı ve yayılmayı daha iyi teşvik edecek alternatif yapışkan moleküller kullanılarak hafifletilebilir.
Teknolojinin kullanıcıları, farklı bileşenler, büyüme faktörleri, serum seviyeleri ve pH duyarlılıkları farklı hücrelerde değişken davranışlara neden olabileceğinden, ilgilendikleri hücre tipi için farklı olası hücre kültürü ortam formülasyonlarını dikkatlice değerlendirmelidir. Protokolün optimizasyonu, deneysel iş akışlarının ölçeklendirilmesinden önce gelmeli ve medya bileşenleri her zaman taze, steril ve önceki toplu işlerle tutarlı olmalıdır.
Nihayetinde, bir kullanıcının hedefleri için tek hücreli çözünürlük gerekli değilse veya hedef hücre tipi minimum yayılma kapasitesine sahipse, geleneksel TFM bu tür deneyler için eşit veya daha uygun olabilir. Yazarların amacı ve umudu, bu aracın, hücre biyologlarının, özellikle otomatik yüksek verimli fenotipik ilaç ekranları bağlamında, hücresel kasılmayı incelemeleri için ek bir yol sağlamasıdır.
İlaç ekranlarında gelecekteki kullanımlara özgü olarak, 384 kuyucuklu FLECS plakası gibi daha yüksek verimli plakalar kullanılabilir. Bu tür plakalarda, birçok mikroskoptaki 4x hedefleri, görüş alanlarındaki tek bir kuyunun tamamını yakalayabilir ve tüm hücresel kasılma tepkilerinin yakalanmasını sağlar. Yüksek verimli bir görüntüleme sistemi kullanılarak, 384 kuyucuklu bir plakanın tamamı yaklaşık 5 dakika içinde görüntülenebilir, bu da bu sistemi diğer seçeneklerden önemli ölçüde daha hızlı hale getirir ve bu nedenle yüksek verimli fenotipik ilaç keşfi için uygundur. Gerçekten de, yazarlar rutin olarak haftalık ilaç taramalarını otomasyon kullanarak ~ 50 384 kuyu plakasında (toplam 19.000'den fazla kuyu) çalıştırmaktadır.

Hücre tarafından üretilen mekanik kuvvetler, bağırsaklar, mesane, kalp ve diğerleri gibi vücuttaki çeşitli organlarda düzgün çalışması için gereklidir. Bu organlar, iç homeostatik durumu korumak için kararlı hücre kasılma ve gevşeme kalıpları üretmelidir. Anormal düz kas hücresi (SMC) kasılması, örneğin bağırsak düz kas kasılmasının anormal paternleri1 ile karakterize bağırsak dismotilitesi ve aşırı aktif2 veya az aktif mesanenin3 ürolojik koşulları dahil olmak üzere çeşitli bozuklukların başlamasına neden olabilir. Hava yollarında, düzensiz kasılma paternleri sergileyen SMC'ler astımlı aşırı duyarlılığı tetikleyebilir4, potansiyel olarak hava yollarını sıkılaştırabilir ve akciğerlere oksijen hava akışını azaltabilir. Bir diğer yaygın fiziksel durum olan hipertansiyon, kan damarlarındaki düz kas kasılmasındaki dalgalanmalardan kaynaklanır5. Açıkçası, hücreler ve dokular içindeki kasılma mekanizmaları, tedavi seçenekleri gerektiren hastalıklara yol açabilir. Bu koşullar açıkça hücrelerin işlevsiz kontraktil davranışlarından kaynaklandığından, potansiyel ilaç adaylarını tararken hücre kontraktil fonksiyonunun kendisini ölçmek mantıklı ve gerekli hale gelir.
Hücresel kontraktil kuvveti incelemek için araçlara duyulan ihtiyacı kabul ederek, akademik araştırmacılar tarafından traksiyon kuvveti mikroskobu (TFM)6, mikrodesenli TFM7, yüzer jel testleri8 ve elastomerik mikropost tahlilleri9 dahil olmak üzere çeşitli kantitatif kasılma testi yöntemleri geliştirilmiştir. Bu teknolojiler çok sayıda çalışmada tek çanaklı formatta ve çok kuyulu plaka formatında kullanılmış ve hatta üç boyutlu kuvvet ölçümleri için önerilmiştir10,11,12,13,14. Bu teknolojiler, hücre kuvveti biyolojisinin geniş alanında öncü araştırmalara olanak sağlamış olsa da, hepsi büyük ölçüde belirli yeteneklere ve kaynaklara sahip laboratuvarlarla sınırlı kalmıştır, özellikle: TFM substratlarını üretme yeteneği, TFM yer değiştirme haritalarını çözmek için karmaşık ve sezgisel olmayan algoritmaları düzgün bir şekilde uygulama yeteneği ve numunenin sahneden çıkarılmasından önce ve sonra çekilen görüntüleri kaydedebilen nispeten hassas mikroskopi sistemleri (hücre ayrışması için). Bu nedenle, eğitimsiz bir araştırmacı için, bu yöntemleri kullanmak için giriş engeli, bu teknolojileri uygulamak için kapsamlı gereksinimler kümesi göz önüne alındığında oldukça yüksek olabilir. Ek olarak, mevcut birçok teknoloji (40x veya daha büyük) için gereken görüntüleme çözünürlüğü deneysel verimi önemli ölçüde sınırlayabilirken, toplu ölçüm teknolojileri aykırı değerlerden gelen katkıları maskeleyebilir ve daha hafif kontraktil farklılıkların keşfedilmesini önleyebilir. Yazarların bildiği kadarıyla, sadece düşük verimli ve yarı kantitatif yüzer jel testi yaklaşımı araştırmacılara sunulacak kadar olgunlaşmıştır (bkz. Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig01.jpg"> Şekil 1: FLECS Teknolojisi yönteminin genel şeması . (A) Hücreler, cam tarafından desteklenen ince bir elastomerik tabakaya kovalent olarak gömülmüş yapışkan protein mikrodesenlerine yapıştırılır. (B) Çeşitli olası mikro desen şekillerinin üstten görünümü ve 'X' şeklinde bir mikro desen büzülen bir hücrenin patlaması. (C) Floresan mikrodesenlerin ve büzülen bir hücrenin faz kontrast görüntülerinin üst üste binmesi. (D) Tek bir büzülen hücrenin zaman rotası görüntüleri. Ölçek çubukları = 25 μm. Bu rakam Pushkarsky et al15'in izniyle uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Mikroteknolojideki son gelişmeleri takiben, yazarlar FLECS (floresan olarak etiketlenmiş elastomerik kontrakte edilebilir yüzeyler) adı verilen yüz binlerce hücrede tek hücreli kasılmanın nicel ölçümlerini sağlayan mikroplaka tabanlı bir teknoloji geliştirdiler15,16,17,18,19,20 , TFM'ye alternatif olarak. Bu yaklaşımda, floresan protein mikrodesenleri, hücreler sezgisel ve ölçülebilir bir şekilde kendilerine çekiş kuvvetleri uyguladığında deforme olan ve küçülen yumuşak filmlere gömülür. Önemli olarak, protein mikro desenleri hücre pozisyonunu, şeklini ve yayılma alanını kısıtlar ve tek tip test koşullarına yol açar. Bunlar, yalnızca 4x büyütme görüntülerinde bile uzamsal olarak yüksek oranda çözülen boyutsal değişikliklerine dayanan basit ölçümlere izin verir. Yöntem, tarayıcı tabanlı bir görüntü analizi modülü içerir ve hassas taşıma prosedürleri veya güvenilir belirteçlerin tescili gerektirmeden kontraktil hücre kuvvetinin basit analizini sağlar, böylece temel bir hücre kültürü tesisi ve düşük büyütmeli basit floresan mikroskobu ile herhangi bir araştırmacı tarafından çalıştırılabilir olmalıdır (Şekil 2 ). Rafa hazır ve ticari olarak temin edilebilen bu teknoloji, son kullanıcı göz önünde bulundurularak tasarlanmıştır ve herhangi bir laboratuvar bilimcisinin hücresel kuvvet biyolojisini incelemesi için giriş engelini azaltmayı amaçlamaktadır.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig02.jpg"> Şekil 2: Tek hücreli kontraktilite testi için 24 delikli plaka formatının şeması. Bu biçim, burada açıklanan deneylerde kullanılmış ve makalenin video bölümünde gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu çalışmada, primer mesane düz kas hücrelerinde kuvvet modüle edici ilaçların hücresel kontraktilite üzerindeki etkilerini ölçmek için FLECS Teknoloji platformunun 24 kuyucuklu plaka formatını uygulamak için bir protokol sunuyoruz. Bu genel amaçlı protokol, diğer çeşitli zaman ölçeklerini, hücre tiplerini ve ilgilenilen tedavi koşullarını hesaba katmak için gerektiğinde uyarlanabilir ve değiştirilebilir ve kuvvet biyolojisindeki diğer soruları cevaplamak için ölçeklendirilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bladder smooth muscle cell culture</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#4310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture media</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td>Ham&#39;s F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7201432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;FB012941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D1284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>ImageXpress Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcyte-manufactured 24-well plate</td>
			<td>Forcyte Biotechnologies</td>
			<td>24-HC4R-X1-QB12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 3342 Live Nuclear Stain</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified, high-throughput analysis of single-cell contractility using micropatterned elastomers

Hücresel kontraktil kuvvet üretimi, hemen hemen tüm hücreler tarafından paylaşılan temel bir özelliktir. Bu kasılma kuvvetleri doğru gelişim için çok önemlidir, hem hücresel hem de doku seviyelerinde işlev görür ve vücuttaki mekanik sistemleri düzenler. Tek hücrelerin hareketliliği, yapışması ve bölünmesinin yanı sıra kalp, mesane, akciğerler, bağırsaklar ve uterus gibi organların kasılması ve gevşemesi de dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik süreç kuvvete bağımlıdır. Uygun fizyolojik fonksiyonun korunmasındaki önemi göz önüne alındığında, hücresel kontraktilite, abartıldığında veya bozulduğunda hastalık süreçlerini de tetikleyebilir. Astım, hipertansiyon, erken doğum, fibrotik skarlaşma ve az aktif mesane, hücresel kontraktil kuvvetin uygun kontrolü ile potansiyel olarak hafifletilebilecek mekanik olarak yönlendirilen hastalık süreçlerinin örnekleridir. Burada, floresan olarak etiketlenmiş elastomerik kontraktilible yüzeyler (FLECS) olarak bilinen ve tek hücreli kontraktilitenin basitleştirilmiş ve sezgisel analizini büyük ölçekli bir şekilde sağlayan yeni bir mikroplaka tabanlı kontraktilite testi teknolojisini kullanmak için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Burada, yöntemin kullanıcılarına uygun tekniği göstermek için, sadece tek bir FLECS testi mikroplakası kullanan basit bir prosedürde, iki kontraktil inhibitörün primer insan mesane düz kas hücrelerinin kasılması üzerindeki etkilerini açıklayan iki altı noktalı doz-yanıt eğrisi elde etmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. FLECS Teknolojisini kullanarak, temel biyolojik laboratuvarlara ve floresan mikroskopi sistemlerine sahip tüm araştırmacılar, bu temel fakat ölçülmesi zor fonksiyonel hücre fenotipini incelemeye erişebilir ve kuvvet biyolojisi alanına giriş bariyerini etkili bir şekilde azaltır ve kontraktil hücre kuvvetinin fenotipik taramasını yapar.

Sadece DMSO ile tedavi edilen kuyulardan elde edilen görüntülerin bölgeleri ve 40 μM blebbistatin ile tedavi edilenler Şekil 3'te yan yana gösterilmiştir. Sadece DMSO ile tedavi edilen hücrelerin, o kuyudaki mesane düz kas hücreleri (BSMC'ler) tarafından yapıştırılan mikrodesenlerin çok belirgin deformasyonlarına dayanarak önemli bir kasılma seviyesi sergilediği açıkça gözlemlenebilir. Tersine, 40 μM blebbistatin ile iyi muamele edilmiş olanın görüntüsünde, BSMC'ler tarafından yapıştırılan mikro desenler, hücreler tarafından yapışmayan mikro desenlerden boyut olarak neredeyse ayırt edilemediğinden, minimum kasılmayı gösteren önemli hücre gevşemesi gözlenir7 . Bu görüntüler, floresan mikrodesenleme yönteminin sunduğu tek hücreli kontraktilitenin sezgisel ve net görsel temsilini göstermektedir. Yoğun bir hücre tek katmanının altına rastgele dağılmış çok sayıda floresan parçacığın çok yönlü hareketinin göreceli kasılma kuvveti iletmek için tasarlandığı TFM tabanlı yöntemlerden farklı olarak, burada, mikro kalıpların tekdüze ve işaretli büzülmüş geometrileri, bireysel hücrelerin büzülmesi hakkında anında ve kolayca yorumlanabilir niteliksel bilgi sağlar. Bunlar, görüntülere standart ikili nesne işlemleri uygulanarak doğrudan ölçülebilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig03.jpg"> Şekil 3: Sadece %1 DMSO tedavisi (solda) veya 40 μM blebbistatin (sağda) içeren kuyulardan alınan görüntülerin yan yana karşılaştırılması. Blebbistatin ile tedavinin, daha büyük, büzülmemiş mikro desenler tarafından belirtildiği gibi tek hücrelerin kontraktilitesini önemli ölçüde azalttığı açıkça gözlemlenebilir. Mavi çekirdekler, hangi mikrodesenlerin hücreler tarafından bağlandığını gösterir. Ölçek çubuğu = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Mikrodesenlerin ve hücre çekirdeklerinin elde edilen görüntü çiftlerini analiz etmek için tarayıcı tabanlı analiz modülü uygulanarak, Şekil 4'te gösterildiği gibi her popülasyon için tek hücreli kontraktilite dağılımları elde edilir. FLECS metodolojisi15 hakkındaki önceki bir raporda ayrıntılı olarak açıklanan analiz, her bir "X" şeklindeki mikro modelin konumlarını ve yönelimlerini bularak, her bir mikro modelin merkezine doğrudan yapıştırılan çekirdek sayısını sayarak, her bir mikro modelin ortalama uzunluğunu hesaplayarak ve boş mikro desenlerin ortalama uzunluğuna göre her bir mikro modelin büzülmesinin piksel mesafesini hesaplayarak çalışır (sıfır büzülme referansı). Bu nedenle, boş mikro desenler daralma verilerini normalleştirmek için önemli bir amaca hizmet eder. Önemli olarak, mikro desenlere bağlanmayan hücreler, görüntü analizini etkilemeyecekleri mikro akımlar nedeniyle kuyu sınırlarında birikecektir. Bu grafiklerde görüldüğü gibi, sadece DMSO kontrolleri ile tedavi edilen hücre popülasyonunun bozulmamış kontraktilitesi, yaklaşık 10 pikselde bulunan bir merkez ile 20 piksel kadar geniş bir aralığı kapsar. Bu arada, blebbistatin ile tedavi edilen hücreler önemli ölçüde daha az büzülür ve dağılımları 6 pikselin biraz üzerinde bir merkeze itilir. Daha da önemlisi, görüntüde bulunan ve hücreye tam olarak bağlanan her bir mikro model bu dağılımlarda temsil edilir. Bu, yöntemin ilaç tedavilerine diferansiyel hücresel yanıtları iletme yeteneğini göstermektedir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig04.jpg"> Şekil 4: Sadece %1 DMSO (mavi) veya 40μM blebbistatin içeren kuyulardan alınan görüntülerin analizinden elde edilen tek hücreli kontraktilite verilerini gösteren histogramlar. DMSO ile tedavi edilen hücrelerin dağılımı geniştir ve blebbistatin ile tedavi edilen dağılımdan çok daha büyük bir kasılma değerinde (~ 10 piksel) merkezlenmiştir, bu da blebbistatin ile hücrelerin tedavisinin nicel etkilerini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tüm kuyucukları tek bir 24 kuyucuklu plaka üzerinde kullanarak ve kuyu başına en az 3 bölgeyi görüntüleyerek, iki ilaç bileşiği için aynı anda altı noktalı doz-yanıt eğrileri üretilir. Şekil 5, aynı dozda blebbistatin veya sitokalasin D (her ikisi de bilinen kontraktilite inhibitörleri) ile tedavi edilen BSMC'ler için konsantrasyon-yanıt verilerini göstermektedir. Konsantrasyon-yanıt profillerinden de anlaşılacağı gibi, sitokalasin D, bu hücrelerde tonik kasılmanın daha güçlü inhibitörüdür. Veri noktalarına bir sigmoidal eğri takılarak, her ilaç için IC50 değerleri hesaplanabilir. Deneylerimiz, IC50'nin, ilaçlara ~ 30 dakika maruz kaldıktan sonra, blebbistatin ve sitokalasin D için sırasıyla 7.9 μM ve 100 nM olduğunu göstermektedir. Önemli olarak, genel olarak, bu değerler önceki raporlarla tutarlıdır ve kasılma inhibitörlerinin gücünü belirlemek için yöntemin nicel doğruluğunu doğrulamaktadır7,21.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63211/63211fig05.jpg"> Şekil 5: Blebbistatin ve sitokalasin D'nin tek hücreli hücrelerde hücresel kontraktiliteye etkilerini gösteren konsantrasyon-yanıt eğrileri. Her veri noktası, bu koşul için üç görüntüden oluşur. Her veri kümesine bir sigmoidal eğri uygundu. Sonuçlar, sitokalasin D'nin daha güçlü olduğunu ve daha düşük bir IC50 değerine sahip olduğunu göstermektedir. Bu veriler tek bir 24 delikli FLECS plakasından toplanabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63211/63211fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers at JoVE.com

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Bu çalışma, floresan olarak etiketlenmiş elastomerik büzülebilir yüzeyler (FLECS) Teknolojisini, floresan protein mikrodesenlerinin görselleştirilmiş yer değiştirmelerine dayanan tek hücreli kontraktil kuvvetlerin basitleştirilmiş, eller kapalı nicelleştirilmesi için mikrowell formatında kullanmak için esnek bir protokol sunmaktadır.

Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Hücre tarafından üretilen mekanik kuvvetler, vücuttaki çeşitli organlarda düzgün çalışması için gereklidir. Ayrıca bağırsaklar mesane, kalp ve diğerleri. Bu organlar, iç hemostatik durumu korumak için stabil hücre kasılma ve gevşeme kalıpları üretmelidir.Anormal düz kas hücresi kasılması, bağırsak dismotilitesi de dahil olmak üzere çeşitli bozuklukların başlamasına yol açabilir, ayrıca kas kasılması ile anormal bağırsak paternlerini ve ayrıca aşırı aktif veya az aktif mesane gibi durumları karakterize eder. Ve hava yolunda, herhangi bir düzensiz paternle sözleşme yapan bazı kas hücreleri astımlı hiper duyarlılığı tetikleyebilir. Açıkçası, hücreler ve dokular içindeki kasılma mekanizmaları, tedavi seçenekleri gerektiren hastalıklara yol açabilir.Ve bu koşullar doğrudan hücrelerin işlevsiz kasılma davranışlarından kaynaklanabileceğinden, potansiyel ilaç adaylarını tararken hücre kontraktil fonksiyonunun kendisini ölçmek hem mantıklı hem de gerekli hale gelir. Mikro teknolojideki son gelişmeleri takiben, tek hücre kasılmasının kantitatif ölçümlerini sağlayan kullanıcı dostu bir mikro plaka tabanlı test geliştirdik. Floresan olarak etiketlenmiş elastomerik büzülebilir yüzeyler olarak da bilinen flex adı verilen yüz binlerce hücrede.Bu yaklaşımda, floresan protein mikro desenlerini ve böylece hücreler onlara çekiş kuvvetleri uyguladığında deforme olan ve küçülen yumuşak filmleri gömüyoruz. Önemli olarak, protein mikro desenleri hücre pozisyonunu, şeklini ve yayılma alanını kısıtlar. Tek tip test koşulları ve sadece boyutsal değişimlerine dayanan basit ölçümlere izin verir.Genel olarak, tarayıcı tabanlı bir görüntü analiz modülü içeren platform, hassas kullanım prosedürleri veya güvenilir belirteçlerin tescili gerektirmeden büzülebilir hücre kuvvetinin doğrudan analizini sağlar ve temel hücre kültürleri ve düşük büyütmeli basit floresan mikroskobu ile herhangi bir araştırmacı tarafından çalıştırılabilir. Bu teknoloji, son kullanıcı göz önünde bulundurularak tasarlanmıştır ve herhangi bir laboratuvar bilimcisinin hücresel kuvvet biyolojisini incelemesi için giriş engelini azaltmayı amaçlamaktadır Kronik bir tüpe 20 mililitre medya ekleyerek başlayın, hücre kontraktilitesini test etmek için tasarlanmış 24 kuyucuklu bir plaka elde edin. Pipetinizi 500 mikrolitreye ayarlayın ve hücre patojeni için bir hücre süzgeci elde edin.24 delikli plaka üzerindeki kapağı çıkarın, plakayı bu şekilde tutun, ardından plakanın üstündeki plastik tabakayı yavaşça çıkarmaya devam edin. Plakayı dikkatlice geri yerleştirin. Herhangi bir dökülmeyi önlemek için her bir kuyucuktan sadece üst tabaka PBS'yi aspire edin.Şimdi, her seferinde bir sıra, kalan PBS'yi kuyudan çıkarın ve 500 mikrolitre hücre ortamı ile hızla doldurun. Plakayı yavaşça sallayın ve kuyucuğun tüm tabanının çözelti ile kaplandığından emin olmak için yan tarafına dokunun. Tüm kuyular medyayla doldurulduktan sonra, plakayı yana doğru ayarlayın.Bu noktada, hücre kültürünüzü inkübatörden alın. Sağlam bir ortaklık protokolü yürüteceğiz. Bu protokolün amacı, mililitre başına 50.000 hücrelik bir süspansiyon oluşturmaktır.Hücreleri tohumlamadan önce, hücrelerinizi süzgeçten bir kez süzdüğünüzden emin olun, hücre kümelerini tek hücrelere ayırmak için, hücre çözeltinizin 500 mikrolitresini dikkatlice her bir kuyucuğa yerleştirin. Hücre tohumlamasından sonra, plakaların bir saat boyunca oturmasına izin vermek önemlidir, böylece hücreler doğrudan desenlere yerleşebilir. Bir saat geçtikten sonra, plakayı gece boyunca bir inkübatöre yerleştirin.Deneyin ikinci kısmı, ilaçların 24 delikli plakaya eklenmesi ve plakanın floresan görüntülenmesinden oluşmaktadır. Protokolün bu kısmı için, sağlam hücre canlılığı ve yanıtı sağlamak için iki önemli gereksinimimiz var. Birincisi, DMSO'nun hücreli kuyucuklardaki son konsantrasyonunun% 1'den fazla olmamasıdır, yani ilaç stoklarımızdan 100 tam seyreltme yapmamız gerekir.İkincisi, DMSO'yu doğrudan kuyucuklara ekleyemeyiz, çünkü bu karışımın dibine çarpacak ve daha sonra yüksek konsantrasyona sahip hücrelere zarar verecektir. Bunun yerine, hücrelere yüksek lokal DSSO maruziyetini önlemek için iyice karıştırabileceğimiz bir DMS0 ilaç ve ortam ara çözeltisi oluşturmalıyız. Bu protokolde, 40 mikromolardan bir nano molar arasında bir aralığı kapsayan altı adımlı sekiz katlı bir seyreltme yapacağız 30 mikrolitre stok ilaç çözeltisini ardışık 210 mikrolitre hacim DMSO'ya aktararak ve her transfer adımı arasında iyice karıştırarak altı adımlı sekiz aşamalı seyreltme serisini oluşturun Deneyimizde, blebbistatinin etkisini değerlendireceğiz.kas hücreleri yoluyla insan mesanelerinde. Her iki gereksinimi de karşılamak için öncelikle bir ara ilaç DMSO ve medya çözümü oluşturacağız. Bu, DMSO'nun 16.7 kat seyreltilmesini sağlar.Daha sonra bu ara ilaç çözeltisini hücrelerimize ekleyeceğiz, ilave altı kat seyreltme sağlayan oranlar kullanarak, toplam 100 tam seyreltme ve% 1'lik son konsantrasyonla sonuçlanırDMSO Bunu başarmak için, her stok ilaç çözeltisi için, 30 mikrolitre ilacı 470 mikrolitre hücre kültürü ortamına karıştırın, ardından bu ara çözeltinin 200 mikrolitresini 24 delikli plakadaki uygun kuyuya aktarın, her kuyuda 1000 mikrolitre içerir. Bu, toplu olarak, uygun süre boyunca% 1'lik bir DMSO İnkübat nihai konsantrasyonu verir. Deneyimizde, 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırıyoruz, görüntü almaya hazır olduğunuzda, kuyularınızın her yerine canlı bir nükleer leke ekleyin, stoktan bir ila 10.000 seyreltme ekleyin.15 dakika daha kuluçkaya yatmasına izin verin. Görüntülemeye hazır olduğunuzda, hem etiketli hücre çekirdeği hem de floresan boya için floresan kanallarını görüntülemek üzere donatılmış bir floresan mikroskobuna ihtiyacınız olacaktır. Mikro desenler, örneğimizde tri C kanalı olan etiketlenmiştir.Şimdi, tek hücreleri tanımlamak için floresan görüntüleme blebbistatin çekirdekleri olacağız, leke hücresi çekirdeklerini mikro deseni görüntülediğiniz gibi tam olarak aynı konumda görüntülediğinizden emin olun, böylece analiz sırasında hizalanabilirler. Alınan görüntüleri bilgisayarınıza yükleyin, desen kanallarının PT'nin alt çizgisiyle biteceği şekilde görüntülerin düzgün etiketlendiğinden emin olun. Ve nükleer kanaldaki görüntüler dapi'nin altını çiziyor. Şimdi, tif görüntülerini PNG görüntülerine dönüştüreceğiz, J resmini kullanarak J resmi açıldıktan sonra, bir seferde bir kanala yükleyin.Sinyali en üst düzeye çıkarmak ve arka planı en aza indirmek için önce desen kanalını yükleyeceğiz ve kontrastı ayarlayacağız. Ayrıca, görüntüyü düzgünleştireceğiz. Görüntü beğenimize göre değiştirildikten sonra, görüntü türünü sekiz bit olarak değiştireceğiz.Ardından görüntüyü PNG türü olarak dışa aktarın. Ardından kutuyu işaretleyin, dosya adları olarak dilim etiketleri kullanın. PNGs adlı yeni bir klasör oluşturun.Ardından PNG dosyalarını oraya kaydedin, Görüntüleri analiz etmek için Biodock nokta AI'ya gidin, bir hesap oluşturun ve analiz modülüne ücretsiz erişim sağlamak için yazarlarla iletişime geçin. Hesabınız oluşturulduktan sonra giriş yapın. Burada yeni resimler yükleyebilirsiniz.Bu yeni toplu iş web deneyi verilerine JoVE adını vereceğiz. Şimdi, görüntüleri sürükleyip bırakarak içe aktarabiliriz, bu noktaya OK.At basın, verilerinizi seçin. Ardından analiz et'e tıklayın, kontraktilite analizi etiketli modüle ilerleyin ve ardından seç'e basın.Büyütmeyi görüntüleme için kullandığınız değere ayarlayın Veriler tamamlandıktan sonra, üzerine tıklayın ve ardından verileri indir'i seçebiliriz. Veriler indirildikten sonra, girilen her görüntü için bindirmeli görüntü çiftlerini görebiliriz. Ayrıca, her bir hücre kümesi için ortalama kasılmayı bize verecek özet bir istatistiğe de erişebiliyoruz.Kasılma için ölçü birimi piksel cinsindendir. Buradaki verilere baktığımızda, sadece DMSO ile tedavi edilen kuyularda, blebbistatin ile tedavi edilen hücrelere kıyasla çok daha yüksek bir hücre kasılması olduğunu görebiliriz. Ayrıca, görüntülerin herhangi birinde algılanan her bir desen için verilere erişimimiz vardır.Bu bize görüntünün konumu, görüntü kaynağı, konum türü, sıfır bir veya birden fazla hücre sayısı, mikro modelin boyutu ve hücrelerin hesaplanan daralması hakkında ayrıntılı bilgi verir. Bu döşeme, mikro plaka içindeki tanımlanmış her bir modelden oluşur. Bu listedeki tek hücre desenleri, diğer dosyadaki PNG görüntüsünün ortalama daralmasını hesaplamak için ortalamaydı.Tek hücreli verileri denemeniz için gerektiği şekilde sıralayabilir ve analiz edebilirsiniz. Videonun bu kısmı için, iki farklı ilaçla tedavi edilen mesane düz kas hücrelerinden alınan yanıt verilerini gösteren 24 kuyucuklu bir plakadan toplanabilen temsili verileri göstereceğiz. Bunlar sırasıyla DMSO ve blebbistatin ile tedavi edilen kuyuların görüntüleridir.Burada, sadece DMSO ile tedavi edilen hücrelerin çok sayıda sözleşme mikro modeli sergilediğini, ancak blebbistatin ile tedavi edilen hücrelerin daha büyük olduğunu ve daha az kasılma olduğunu fark etmeye açık olduğunu görebiliriz. Bu histogramdaki veriler, hücrelere yapılan farklı tedavilerin bir sonucu olarak varyasyon hücresi kontraktilitesini gösterir. Blebbistatin ile tedavi edilen hücreler için dağılım merkezi, DMSO ile tedavi edilen hücreler için dağılım merkezinden daha düşüktür.Bu, önceki görüntülerde görüntülenen bilgilerle tutarlıdır. Çünkü blebbistatin ile tedavi edilen hücreler çok daha küçük kasılma sergiledi. Bu, blebbistatin ile tedavinin hücreleri önemli ölçüde rahatlattığını gösterir.Bu veri kümelerinin her biri, videoda gösterilen protokolleri izleyerek, tek bir 24 delikli plakadan toplanabilen doz yanıt eğrisindeki bir noktaya katkıda bulunur. Burada, sitokalasin D'nin, daha yüksek ilaç konsantrasyonları göz önüne alındığında, daha düşük kasılma değerleriyle gösterildiği gibi blebbistan'dan daha güçlü olduğunu görebiliriz. Deneylerinizi önemli ölçüde ölçeklendirmek istiyorsanız, 384 kuyu plakası versiyonu mevcuttur ve bu, deneyleri önemli ölçüde ölçeklendirmek için otomasyonla birlikte kullanılabilir.Bu veriler, 24 kuyucuklu plakadaki her ilaç için altı seyreltme adımına sahip olmak yerine, 384 kuyu plakasından toplanabilir, 384 kuyu plakası, birden fazla kopyaya sahip her ilaç için 20 seyreltme adımı gerçekleştirmemize izin verir. Kar taneleri teknolojisi benzersizdir. Şimdiye kadar imkansız olan mikroskopi kullanılarak tek hücreli kasılmanın görselleştirilmesine izin verir.Bu nedenle, teknoloji, floresan olarak etiketlenmiş protein ile desenli metriklerin biçimine dayanır. Sistematik model, hücresel kasılma için oluşacak ve herhangi bir ilaç tarafından bir fenotip sözleşmesinin modülasyonunun hassas bir şekilde ölçülmesine izin verecektir. Tabii ki, bu teknoloji hala astım, kardiyovasküler hastalıklar, inflamasyon immün onkolojisi ve tabii ki anormal hücresel kasılmanın hastalığın ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı hastalık endikasyonlarımızdan herhangi biri gibi uygulamalar ve birçok farklı hastalık alanı için aktif olarak geliştirilmektedir.Hücre kontraktilitesini ölçmek için bu mikro modelleme tabanlı teknolojiyi gösterdiğimiz gibi, geleneksel çekiş kuvveti mikroskobuna basitleştirilmiş bir alternatif sunarak, sezgisel analiz sağlar, modelin küçülmesini izler ve büyük hücre popülasyonlarında tek hücre çözünürlüğü sağlar. Bazı hususlar, bu yöntem, T hücreleri ve nötrofiller gibi çok küçük hücrelerin veya yapışmayan hücre tiplerinin kullanımı için zorluklar doğurabilir. Ek olarak, haftalık olarak bağlanan, ağırlıklı olarak birbirine bağlanan veya tamamen yayılmayan hücreler, ölçülebilir kontraktil sinyaller üretmeyecektir.Teknolojinin kullanıcıları, kendi hücre tipleri için farklı olası hücre kültürü ortam formülasyonlarını dikkatlice değerlendirmelidir. farklı bileşenler olarak, büyüme faktörleri, serum seviyeleri ve pH duyarlılıkları değişken davranışları tetikleyebilir. Protokollerin optimizasyonu, deneysel iş akışlarının ölçeklendirilmesine devam etmelidir.Sonuç olarak, tek hücre çözünürlüğü gerekli değilse veya hedef hücre tipi minimum yayılma kapasitesine sahipse, bu tür deneyler için geleneksel çekim kuvveti mikroskopi yöntemleri kullanılabilir. Aksi takdirde, bu aracın hücre biyologlarının hücresel kasılmayı incelemeleri ve çalışmalarını gerçekleştirmeleri için ek bir yol sağladığını umuyoruz.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...