Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub و NIH 1U01NS103516.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li><li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain.">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li><li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li><li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+Ca2++imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy.">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li><li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy.">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177 (2019).</li><li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain.">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li><li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser.">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science &amp; Applications. 7, 12 (2018).</li><li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain.">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots.">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull.">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li><li>Xu, C., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+of+molecular+fluorophores+and+nonlinear+laser+microscopy.">Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy.</a> Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , 471-540 (2002).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).</li><li>&#321;ukasiewicz, K., Robacha, M., Bo&#380;ycki, &. #. 3. 2. 1. ;., Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex.">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).</li><li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity.">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).</li><li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms.">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging.">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li><li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1,700+nm.">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain.">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205 (2020).</li><li>Cheng, L. -. C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -. J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy.">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li><li>Huang, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish.">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche.">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li><li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain.">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li><li>Vogel, A., Noack, J., H&#252;ttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues.">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li><li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy.">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li><li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).</li><li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy.">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

يشرح هذا البروتوكول الإجراءات خطوة بخطوة لإعداد التصوير 3P باستخدام المجهر التجاري ومصدر الليزر. بالمقارنة مع 2PM ، تتمتع 3PM بميزة في التطبيقات التي تتطلب الوصول البصري في المناطق العميقة مثل الحصين في دماغ الماوس. على الرغم من أن 3PM يستخدم في الغالب في علم الأعصاب ، إلا أنه يمكن تطبيق 3PM في أنسجة أخرى مثل الغدد الليمفاوية والعظام والأورام لمراقبة الأنسجة العميقة.
من المهم التحقق من أن نظام التصوير يعمل بالقرب من حد ضوضاء اللقطة ، مما يضمن أن إلكترونيات الكشف والحصول على البيانات تساهم بضوضاء ضئيلة في الصورة بعد PMTs. إن عدم اليقين في عدد الفوتونات المكتشفة محدود بشكل أساسي بسبب ضوضاء الفوتون الملتقطة. يمكن تحقيق أداء محدود لضوضاء اللقطة في مجهر نموذجي متعدد الفوتونات باستخدام كاشف ضوئي عالي الكسب (على سبيل المثال ، PMT). تتبع ضوضاء لقطة الفوتون توزيعا إحصائيا لبواسون ، حيث يكون الانحراف المعياري للتوزيع مساويا للجذر التربيعي لمتوسط التوزيع. للتحقق من الأداء المحدود لضوضاء اللقطة، اتبع الخطوة 1.14 في قسم البروتوكول.
لتجنب توهين الضوء بواسطة H 2 O ،يعد استخدام D2O للغمر مفيدا ، خاصة بالنسبة للإثارة ~ 1,700 نانومتر. عند استخدام D 2 O ، من الضروري تحديث D 2 O كل 10 دقائق تقريبا أو استخدام حجم كبير من D 2 O لتجنب تبادل D 2 O / H2Oأثناء التصوير. يمكن للمرء أيضا إغلاق D2O من بيئة الغرفة3. إذا تم استخدام عدسة موضوعية لمسافة العمل الطويلة (WD) (على سبيل المثال، WD عند 4 مم أو أكثر) للتصوير، فقد يتجاوز سمك سائل الغمر 2-3 مم. زيادة سمك يجعل امتصاص H2O لا يستهان به حتى عند ~ 1300 نانومتر21. لذلك ، قد يكون D2O ضروريا حتى بالنسبة ل 1300 نانومتر 3 مساء عند استخدام عدسة WD موضوعية طويلة.
نظرا لأن شدة التألق 3P تعتمد على مكعب طاقة نبض الإثارة عند التركيز (Eq. (1)) ، فإن ضبط طاقة الليزر المناسبة مهم بشكل خاص للحصول على إشارات فلورية 3P كافية مع تجنب التلف الحراري وغير الخطي في الأنسجة الحية. يجب أن يبقى متوسط طاقة الليزر أقل من عتبة الضرر الحراري. في دماغ الفأر ، على سبيل المثال ، لتجنب تلف الأنسجة الحرارية ، يجب الاحتفاظ بمتوسط الطاقة على سطح دماغ الفأر عند أو أقل من ~ 100 mW لإثارة ~ 1,300 nm على عمق 1 mm ومع مجال رؤية (FOV) من 230 ميكرومتر × 230 ميكرومتر21. وبالمثل ، يجب الاحتفاظ بمتوسط الطاقة عند ~ 1700 نانومتر عند أو أقل من ~ 50 ميجاوات على عمق ~ 1 مم و FOV ~ 230 ميكرومتر × 230 ميكرومتر (بيانات غير منشورة). علاوة على ذلك ، لتجنب تشبع الإثارة والضرر غير الخطي المحتمل ، يجب الاحتفاظ بطاقة نبض الإثارة عند <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2 نانوجول و 3 نانوجول ل ~ 1300 نانومتر و ~ 1700 نانومتر <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">إثارة ، على التوالي30.
بسبب امتصاص الضوء والتشتت في الأنسجة ، يتم تخفيف طاقة النبض في التركيز إلى 1 / e (~ 37 ٪) بعد اختراق الأنسجة بواسطة 1 EAL. يختلف EAL في الأنسجة المختلفة ومع الأطوال الموجية للإثارة ، على سبيل المثال ، في القشرة المخية الجديدة لدماغ الفأر ، يكون EAL ~ 300 ميكرومتر و ~ 400 ميكرومتر عند ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر ، على التوالي 3,29 (الشكل 5). لذلك ، للحفاظ على نفس طاقة النبض في التركيز (على سبيل المثال ، 1 nJ / pulse) على عمق n EALs ، يجب ضرب طاقة النبض السطحي في 1 nJ × en. للتصوير السريع للديناميكيات الهيكلية والوظيفية ، من المستحسن استخدام ليزر الإثارة بمعدل تكرار مرتفع (عند 1 ميجاهرتز أو أعلى) لتحقيق معدل إطارات مرتفع5،6،7،10. ومع ذلك ، فإن متطلبات طاقة النبض ومتوسط حد طاقة الليزر يقيدان معدل التكرار المعمول به.
على سبيل المثال ، عندما نصور منطقة عميقة بشكل معتدل عند 4 EALs (أي ~ 1.2 مم في قشرة الماوس مع إثارة 1300 نانومتر) ، يلزم ~ 55 نانوجول / نبضة على السطح للحفاظ على 1 نانوجول / نبضة في التركيز. عندما يكون متوسط الحد من الطاقة 100 ميجاوات ، يمكننا تطبيق معدل تكرار ليزر ~ 2 ميجاهرتز. ومع ذلك ، للحصول على صورة أعمق على عمق 7 EALs ، يلزم وجود 1100 nJ / نبضة على السطح للحفاظ على 1 nJ / pulse عند التركيز. بافتراض أن الحد الأقصى لمتوسط الطاقة هو 100 ميجاوات لتجنب التلف الحراري ، يجب تقليل معدل تكرار الليزر إلى 0.1 ميجاهرتز لتحقيق نبضة 1,100 nJ / على السطح. يلخص الجدول 1 ظروف التصوير النموذجية في قشرة دماغ الفأر. لاحظ أن أعماق التصوير في الجدول 1 تفترض أن EAL موحد في قشرة الفأر بأكملها.
علاوة على ذلك ، بسبب الحد من طاقة الليزر في الأنسجة العميقة 3PM ، توجد مفاضلة بين معدل الإطارات وحجم بكسل الصورة ، وهو أمر مهم بشكل خاص للتصوير الوظيفي مثل تصوير الكالسيوم. يتم تحديد الحد الأقصى لمعدل تكرار الليزر المتاح في كل عمق بناء على طاقة النبض المطلوبة عند التركيز ومتوسط طاقة الليزر المعمول بها كما نوقش أعلاه ، على سبيل المثال ، 2 ميجاهرتز على عمق يعادل ~ 4 EALs مع إثارة 1300 نانومتر. بشكل عام ، يتطلب التصوير نبضة واحدة على الأقل لكل بكسل. وبناء على ذلك، يتم تحديد الحد الأدنى من وقت بقاء البكسل المتاح من خلال معدل تكرار الليزر، على سبيل المثال، 0.5 ميكروثانية/بكسل مع إثارة 2 ميغاهرتز.
للحفاظ على الدقة المكانية العالية (~ 1 ميكرومتر في الجانبية) في صور 3P ، من المثالي تعيين 1 بكسل على مساحة ~ 1 ميكرومتر 2 ، على سبيل المثال ، 256 × 256 بكسل ل FOV من 250 × 250 ميكرومتر2. وبالتالي ، لإجراء تصوير سريع باستخدام FOV كبير إلى حد كبير (على سبيل المثال ، 250 × 250 ميكرومتر 2 مع 256 × 256 بكسل) ، فإن معدلات تكرار النبض 0.5 ميجاهرتز و 1 ميجاهرتز و2 ميجاهرتز تعطي معدلات الإطارات القصوى النظرية ~ 7.6 و ~ 15 و ~ 30 إطارا / ثانية ، على التوالي. وبالمثل ، فإن تحسين معدل تكرار الليزر أمر ضروري ، اعتمادا على العمق المستهدف ، وسرعة المسح الضوئي ، و FOV ، لتطبيق طاقة نبض كافية تحت عتبة الضرر الحراري. لزيادة سرعة التصوير ، يمكن استخدام مصدر الإثارة التكيفي لتركيز جميع نبضات الإثارة على الخلايا العصبية (أي المناطق ذات الاهتمام) عن طريق توصيل نبضات الليزر عند الطلب إلى الخلايا العصبية31.
يعد 3PM مفيدا عند مقارنته ب 2PM في التصوير العميق داخل الأنسجة الحية ومن خلال وسائط مبعثرة للغاية مثل الجمجمة والعظام وطبقة المادة البيضاء (أي الكبسولة الخارجية) لدماغ الفأر. كلما طالت EAL والإثارة غير الخطية ذات الترتيب الأعلى ل 3PE تفيد تصوير الأنسجة العميقة. على سبيل المثال ، لتصوير GCaMP6 في قشرة الماوس ، تكون إشارة التألق 2P مع إثارة 920 نانومتر أعلى من إشارة التألق 3P مع إثارة 1300 نانومتر في المناطق الضحلة عند 690 ميكرومتر (أي ~ 2.3 EALs عند <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">1300 نانومتر)21. ومع ذلك ، نظرا لطول EAL عند 1300 نانومتر مقارنة ب 920 نانومتر ، فإن 3PE يعطي تألقا أقوى من إثارة 2P (2PE) على عمق ~ 690 ميكرومتر وأعمق21. يتم تعريف هذا العمق على أنه "عمق تقاطع الإشارة" ، حيث تكون قوة إشارة التألق 2PE و 3PE متطابقة مع نفس معدل التكرار ونفس الحد الأقصى المسموح به متوسط القوى21. يعتمد عمق تقاطع الإشارة على الأطوال الموجية للإثارة ل 2PE و 3PE والفلوروفور.
في الممارسة العملية ، تسمح الإثارة 920 نانومتر بمتوسط طاقة ليزر أعلى من إثارة 1300 نانومتر بسبب امتصاص الماء الأقل. ومع ذلك ، فإن متوسط الطاقة الأعلى ل 2PE سيدفع عمق تقاطع الإشارة فقط بمقدار 0.9 EALs4. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم تصنيف العينة بكثافة ، فإن 3PE لديه ميزة إضافية تتمثل في SBR أعلى بكثير. لذلك ، حتى قبل الوصول إلى طول تقاطع الإشارة ، يمكن أن يكون 3PM أفضل للتصوير من 2PM. على سبيل المثال ، عند تصوير الأوعية الدموية لدماغ الماوس ، والتي تحتوي على جزء حجمي (أي كثافة وضع العلامات) تبلغ ~ 2٪ ، فإن 1,300 نانومتر 3PM مع قوة إثارة 100 ميجاوات تتفوق على 920 نانومتر 2 مساء مع قوة إثارة 200 ميجاوات على عمق ~ 700 ميكرومتر للفلوريسين.
تتمتع 3PM أيضا بميزة عند التصوير من خلال طبقة رقيقة ولكنها مبعثرة للغاية قد تشوه وظيفة انتشار النقاط لشعاع الإثارة وتولد خلفية إلغاء التركيزالبؤري 4. على سبيل المثال ، من خلال الجمجمة السليمة لدماغ الفأر ، تعاني صور 2PM من خلفية إلغاء التركيز البؤري حتى على عمق ضحل يبلغ <100 ميكرومتر من سطح الدماغ13. لوحظت خلفية مماثلة لإلغاء التركيز البؤري في الساعة 2 مساء مع إثارة 1,280 نانومتر من خلال المادة البيضاء في دماغ الفأر32. لذلك ، عندما يتم تصوير الأنسجة من خلال طبقات عكرة ، يفضل 3PM على 2PM للتصوير عالي التباين بغض النظر عن كثافة وضع العلامات.
لقد أبلغنا مؤخرا عن تحليل وهمي ونظري للخرز يوضح أن حد عمق التصوير في الساعة 3 مساء يزيد عن 8 EALs33 ؛ 8 EALs تعادل ~ 3 مم مع إثارة ~ 1700 نانومتر في قشرة الماوس. ومع ذلك ، فإن الليزر المتاح حاليا لا يحتوي على طاقة نبضية كافية لتحقيق 8 EALs في دماغ الماوس. مزيد من التطوير لليزر أقوى سيدفع الحد الأقصى لعمق التصوير الحالي البالغ 3 مساء.

في علوم الحياة ، كانت تقنيات الفحص المجهري متعدد الفوتونات (MPM) ، مثل 2PM و 3PM ، أدوات قوية للتصوير العميق في الجسم الحي بدقة مكانية زمانية عالية وتباين عال في الأنسجة المبعثرة. بالإضافة إلى ذلك ، تسبب هذه الطرق تبييضا ضوئيا أقل عند مقارنتها بالمجهر البؤري بفوتون واحد1،2،3،4. يعد 3PM مفيدا لتصوير الأنسجة العميقة عند مقارنته ب 2PM بسبب ميزتين رئيسيتين: (i) استخدام إثارة الطول الموجي الأطول (~ 1,300 nm أو ~ 1,700 nm) يقلل من تشتت الأنسجة ، و (ii) عملية الإثارة ذات الترتيب الأعلى (أي أن إشارة التألق تعتمد على مكعب قوة الإثارة في 3PM بدلا من مربع قوة الإثارة في 2PM) التي تمنع التألق الخلفية غير المرغوب فيه3 . وبالتالي ، يتيح 3PM التصوير عالي التباين في المناطق العميقة في الأنسجة الحية مثل الحصين في دماغ فأر بالغ سليم3،5،6،7،8،9،10،11 والدماغ الأمامي بأكمله من الزرد البالغ 12 ، بما في ذلك Ca2 + تسجيل النشاط والملاحظات متعددة الألوان. علاوة على ذلك ، تم الحصول على صور عالية التباين مع 3PM من خلال الجماجم السليمة للفئران وأسماك الزرد البالغة12,13.
اليوم ، تتوفر مصادر ليزر الإثارة المناسبة لإثارة 3P (3PE) عند ~ 1,300 و ~ 1,700 نانومتر تجاريا. نظرا لأن نظام المسح الضوئي بالليزر هو نفسه في الأساس في 2PM و 3PM ، فإن تحويل إعداد 2P الحالي إلى إعداد 3P ممكن في مختبرات البيولوجيا مع تركيب ليزر متاح تجاريا ل 3PE. تعتمد إشارة التألق 3P على طاقة الليزر ومدة النبض ومعدل تكرار الليزر والفتحة العددية (NA) للعدسة الموضوعية. بافتراض التركيز البؤري المحدود بالحيود (أي أن الفتحة الخلفية للعدسة الموضوعية ممتلئة بشعاع الإثارة) ، يصف Eq (1) تدفق فوتون التألق في المتوسط الزمني من الحجم البؤري الناتج عن 3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
حيث f هو معدل تكرار الليزر ، τ هو مدة نبضة الليزر (العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى) ، φ هو كفاءة جمع النظام ، η هو الكفاءة الكمومية الفلورية ، σ3 هو المقطع العرضي لامتصاص 3P ، C هو تركيز الفلوروفور ، n0 هو المؤشر العاكس لوسط العينة (على سبيل المثال ، الماء) ، λ هو الطول الموجي للإثارة في الفراغ ، NA هي الفتحة العددية للعدسة الموضوعية ، و 3 هي ثابت التكامل المكاني للحجم البؤري ، وهي تدفق فوتون الإثارة المتوسط زمنيا (الفوتونات / الفوتونات) تحت العدسة الموضوعية ، z هو العمق المصور ، <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> و EAL هو طول التوهين الفعال14. هنا افترضنا أن EAL (عادة > 100 ميكرومتر) أكبر بكثير من الدقة المحورية للمجهر (عادة < 10 ميكرومتر). تحت التقريب الباراكسي ، يساوي3 28.114. g p(3) هو التماسك الزمني من الدرجة الثالثة لمصدر الإثارة ، و g p(3) هو 0.41 و 0.51 للنبضات المربعة القاطعة المفرطة والنبضات الغاوسية ، على التوالي. يمكن تقدير كفاءة الجمع φ من خلال النظر في جمع التألق بواسطة العدسة الموضوعية ، ونفاذية العدسة الموضوعية ، وانعكاسية المرآة ثنائية اللون ، ونفاذية المرشحات ، وكفاءة الكشف عن الكاشف (على سبيل المثال ، أنبوب المضاعف الضوئي ، أو PMT). نظرا لأن كثافة التألق 3P تعتمد بشكل كبير على معلمات مختلفة ، فإن تحسين إعداد 3P مطلوب لزيادة إشارات التألق 3P إلى أقصى حد.
يوضح هذا البروتوكول عملية التحسين لإعداد 3P النموذجي ، والذي سيكون مفيدا بشكل خاص لمختبرات البيولوجيا التي لديها إعداد 2P وتخطط لتوسيع قدرتها على التصوير 3P أو للحفاظ على إعداد 3P التجاري الخاص بها في الأداء الأمثل. توضح مقالة الفيديو هذه أيضا تصوير 3P للأنسجة العميقة في أدمغة الحيوانات الحية. يتناول القسم الأول تحسين إعداد 3P النموذجي باستخدام مصدر ليزر متاح تجاريا ومجهر متعدد الفوتونات. يصف القسمان الثاني والثالث إعداد الزرد والفأر ، على التوالي ، ل 3PM من الهياكل والأنشطة العصبية. تم الإبلاغ عن جراحة استئصال القحف بالفئران سابقا في أوراق البروتوكول وكذلك 15،16،17. يوضح القسم الرابع التصوير 3P داخل الحيوية في أدمغة الزرد والفئران.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

تعد تقنيات الفحص المجهري متعدد الفوتونات ، مثل المجهر ثنائي الفوتون (2PM) والمجهر ثلاثي الفوتونات (3PM) ، أدوات قوية للتصوير العميق للأنسجة في الجسم الحي بدقة دون الخلايا. 3PM له ميزتان رئيسيتان لتصوير الأنسجة العميقة على مدار 2 مساء والتي تم استخدامها على نطاق واسع في مختبرات الأحياء: (i) طول التوهين الأطول في الأنسجة المبعثرة عن طريق استخدام ~ 1,300 نانومتر أو ~ 1,700 نانومتر ليزر الإثارة. (ii) توليد تألق أقل في الخلفية بسبب الإثارة غير الخطية ذات الترتيب الأعلى. ونتيجة لذلك ، يسمح 3PM بالتصوير الهيكلي والوظيفي عالي التباين في عمق الأنسجة المتناثرة مثل دماغ الفأر السليم من الطبقات القشرية إلى الحصين والدماغ الأمامي بأكمله لأسماك الزرد البالغة.
اليوم ، تتوفر مصادر الليزر المناسبة ل 3PM تجاريا ، مما يتيح تحويل نظام تصوير حالي ثنائي الفوتون (2P) إلى نظام ثلاثي الفوتون (3P). بالإضافة إلى ذلك ، تتوفر العديد من المجاهر التجارية 3P ، مما يجعل هذه التقنية متاحة بسهولة لمختبرات أبحاث علم الأحياء. تظهر هذه الورقة تحسين إعداد 3PM النموذجي ، خاصة استهداف مجموعات البيولوجيا التي لديها بالفعل إعداد 2P ، وتوضح التصوير ثلاثي الأبعاد داخل الحيوية في أدمغة الفئران وأسماك الزرد البالغة السليمة. يغطي هذا البروتوكول الإجراء التجريبي الكامل للتصوير ثلاثي الأبعاد ، بما في ذلك محاذاة المجهر ، والنقيق المسبق لنبضات الليزر ~ 1,300 و ~ 1,700 نانومتر ، وإعداد الحيوانات ، والتصوير الفلوري 3P داخل الحيوية في عمق أزهار الزرد والفئران البالغة.

سيؤدي الانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول إلى مجهر محاذاة بشكل صحيح مع معلمات الضوء المثلى (على سبيل المثال ، مدة النبض ، NA) والاستعدادات الحيوانية المناسبة في الجسم الحي 3PM. يتضمن إعداد 3P المتاح تجاريا مرايا وعدسات مناسبة لكل من ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر. لذلك ، لا يلزم إجراء أي تغيير في البصريات عند تبديل الطول الموجي للإثارة بين 1300 نانومتر و 1700 نانومتر. إذا لم يكن للعدسات في إعداد 3P طلاء مناسب ل 1,300 و 1,700 نانومتر ، فيجب استبدالها بأخرى مناسبة لتقليل فقد طاقة الليزر. مع 3PM الأمثل والإعداد المناسب للحيوانات ، يمكن جمع صور التألق و THG في الجسم الحي ذات التباين العالي في أعماق الأدمغة.
يوضح الشكل 3 صورا تمثيلية ثلاثية الأبعاد لأسماك الزرد البالغة السليمة. يتم تحقيق تصوير عالي الدقة وغير جراحي وعميق للخلايا العصبية المصنفة وراثيا في دماغ الزرد البالغ باستخدام الساعة 3 مساء. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن التصوير في منطقة telencephalon في دماغ الزرد البالغ باستخدام 2PM 24,25,26,27 ، إلا أن 3PM يتيح الوصول إلى telencephalon بأكمله والمناطق الأكثر تحديا أو المستحيل ملاحظتها باستخدام تقنيات أخرى. يمكن ملاحظة توزيع طبقات الخلايا في التكتوم البصري والمخيخ في الشكل 3C. في جلسة تصوير ناجحة، يكون العظم مرئيا في قناة THG والخلايا العصبية مرئية في قناة التألق. بالنسبة لتصوير أسماك الزرد البالغة ، تم استخدام ميزة الكاميرا في المجهر لتحديد موقع الأسماك (الشكل 3A). هذه الخطوة ليست ضرورية لتصوير دماغ الفأر لأن النافذة الزجاجية كبيرة بما يكفي لجعل الدماغ سهل الوصول. تم الحصول على صور هيكلية عالية الدقة لدماغ الزرد البالغ باستخدام النظام الموصوف في الأقسام السابقة. تظهر الجمجمة في قناة THG (الشكل 3B) ، مما يساعد على التنقل في الدماغ والعثور على السطح العلوي. كما لوحظ في الشكل 3C ، يمكن تمييز الخلايا العصبية بنسبة إشارة إلى خلفية عالية (SBR) في عمق دماغ البالغين. الأنسجة فوق الدماغ مرئية في قناة التألق بسبب التألق الذاتي.
يوضح الشكل 4 صورا متعددة الألوان ل 3P للخلايا العصبية المصنفة GCaMP6s (باللون الأخضر) والأوعية الدموية ذات العلامات الحمراء في تكساس (الحمراء) جنبا إلى جنب مع إشارات THG (الأزرق) في دماغ الفأر البالغ مع إثارة 1,340 نانومتر10. الصور مستنسخة من العمل السابق10. في الشكل 4 ، تم الحفاظ على طاقة النبض في التركيز عند ~ 1.5 نانوجول في العمق بأكمله للحصول على إشارات التألق و THG الكافية ، وكان الحد الأقصى لمتوسط طاقة الليزر ~ 70 mW. تم تعديل مدة النبض إلى ~ 60 fs ، وكان NA الفعال ~ 0.8. مع تحسين إعداد 3PM ، تم الحصول على صور عالية التباين بنجاح حتى 1.2 مم من سطح الدماغ ، في منطقة الحصين CA1 (الشكل 4A ، B). يوضح الشكل 4C ، D آثار نشاط Ca2 + للخلايا العصبية الموسومة GCaMP6s على عمق 750 ميكرومتر لجلسة تسجيل مدتها 10 دقائق ، مما يدل على دقة تسجيل عالية.
إذا كان ليزر الإثارة غير محاذاة ، فقد يلاحظ عدم الانتظام في سطوع الإشارة عبر مجال الرؤية. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لم يتم تحسين معلمات الليزر ، مثل مدة النبض ، وطاقة نبض الإثارة عند التركيز ، و NA الفعال ، فلن تكون صورة THG من جمجمة السمك أو نافذة بضع القحف في دماغ الفأر مرئية و / أو تتطلب طاقة نبض إثارة عالية (على سبيل المثال ، >2 nJ / نبضة عند التركيز). وبالتالي ، يمكن استخدام إشارات THG على سطح الدماغ كمؤشر لإعداد 3PM الأمثل قبل البدء في تصوير الأنسجة العميقة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لإعداد الساعة 3مساء. يتم تعيين الطول الموجي لليزر الإثارة عند ~ 1,300 نانومتر أو ~ 1,700 نانومتر ، وهو ناتج من منفذ الخمول في NOPA. يتم استخدام ضاغط زوج المنشور وضاغط لوحة Si لليزر ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر ، على التوالي ، لتحفيز نبضة ليزر الإثارة. يمكن تبديل حزم الليزر ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر مع مرايا الزعانف. يتم استخدام منفذ إشارة NOPA للحصول على إشارة التشغيل. يتم استخدام نصف لوحة موجية و PBS للتحكم في قوة الإثارة. يتم الكشف عن التألق و THG بواسطة GaAsP PMTs. يتم استخدام مجموعات مناسبة من المرايا ثنائية اللون ومرشحات تمرير النطاق الترددي لفصل إشارات التألق و THG. الاختصارات: 3PM = المجهر ثلاثي الفوتونات. NOPA = مكبر صوت بارامتري بصري غير خطي ؛ PBS = مقسم شعاع الاستقطاب ؛ THG = الجيل التوافقي الثالث ؛ DAQ = الحصول على البيانات; PMT = أنبوب المضاعف الضوئي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> الشكل 2: لقطات شاشة تمثيلية للتصوير داخل الجسم في الأسماك (قسم البروتوكول 4.1). (أ) عرض وضع الكاميرا لبرنامج الحصول على الصورة مع عدسة موضوعية 4x في مكانها. يتم تحديد الميزات الرئيسية للبرنامج وترقيمها على النحو التالي: 1. وضع التصوير لبرنامج الحصول على الصور. خيارات الوضع هي الكاميرا والفوتون المتعدد والفوتون المتعدد GG. بالنسبة للتصوير بالضوء الأبيض باستخدام كاميرا CCD، يتم اختيار وضع الكاميرا . 2. يؤدي النقر فوق الزر Live إلى تشغيل الكاميرا (أو PMTs إذا كان ذلك في خيارات الفوتون المتعدد) ، ويمكن ملاحظة عرض المجهر في الوقت الفعلي. 3. في علامة التبويب إعداد الالتقاط ، يتم تعيين معلمات التصوير المطلوبة (الطاقة والموقع والعمق). 4. في علامة التبويب التقاط ، يتم تعيين موقع مجلد للصور المراد حفظها. يمكن بدء التصوير في علامة التبويب هذه. 5. يتحكم إعداد Z Control في عمق التصوير عن طريق تحريك محرك المرحلة z. 6. صورة تمثيلية لرأس الزرد. الجانب السطحي من الرأس على اليسار. (ب) عرض تمثيلي لوضع الكاميرا مع عدسة موضوعية 25x. (ج) عرض تمثيلي لوضع GG متعدد الفوتونات يحتوي على صورة THG للصورة التي تظهر في (B). الاختصارات: CCD = جهاز مقترن بالشحنة. PMT = أنبوب المضاعف الضوئي ؛ THG = الجيل التوافقي الثالث. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> الشكل 3: صور تمثيلية لدماغ الزرد البالغ الذي تم الحصول عليه باستخدام برنامج الحصول على الصور. (أ) صورة وضع الكاميرا لرأس الزرد البالغ التي تم الحصول عليها باستخدام عدسة موضوعية 4x. الجزء العلوي من الصورة هو اتجاه السطح. يتم تحديد فصوص OT و CB. (ب) صورة تمثيلية تم الحصول عليها في وضع GG متعدد الفوتونات مع عدسة موضوعية 25x تحتوي على صورة THG ل (A). (ج) صور التألق لدماغ الزرد البالغ عند تقاطع المخيخ والتكتوم البصري حيث يتم التعبير عن GFP في سيتوبلازم الخلايا العصبية في أعماق مختلفة. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: OT = التكتام البصري; CB = المخيخ; THG = الجيل التوافقي الثالث ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> الشكل 4: متعدد الألوان 3 مساء من الخلايا العصبية المصنفة GCaMP6s (أخضر) ، وأوعية دموية تحمل علامة حمراء في تكساس (حمراء) ، والجيل التوافقي الثالث (أزرق) عند إثارة 1,340 نانومتر في دماغ الماوس. (A) صور Z-stack تصل إلى 1,200 ميكرومتر من سطح الدماغ مع مجال رؤية 270 × 270 ميكرومتر (512 × 512 بكسل لكل إطار). تنوعت طاقة الليزر وفقا لعمق التصوير للحفاظ على طاقة نبض ~ 1.5 نانو جول في التركيز. وكان الحد الأقصى لمتوسط القدرة تحت الهدف 70 ميغاواط. (ب) صور مختارة 2D على أعماق تصوير مختلفة. (ج) موقع تسجيل النشاط عند 750 ميكرومتر تحت الجرة مع مجال رؤية 270 × 270 ميكرومتر (256 × 256 بكسل). (د) آثار نشاط الدماغ التلقائي المسجلة في فأر مستيقظ من الخلايا العصبية الموصوفة المشار إليها في (C). كان معدل الإطارات 8.3 هرتز ، مع وقت سكن بكسل قدره 0.51 ميكروثانية. كان معدل تكرار الليزر 2 ميجاهرتز ، وكان متوسط الطاقة تحت العدسة الموضوعية 56 ميجاوات. تم تطبيع كل أثر إلى خط الأساس الخاص به وتمت تصفيته باستخدام نافذة هامينغ ثابتة زمنيا تبلغ 0.72 ثانية. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. يتم استنساخ هذا الرقم وأسطورة الشكل من 10. اختصار: 3PM = المجهر ثلاثي الفوتونات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> الشكل 5: طول التوهين الفعال في القشرة المخية الحديثة لدماغ الفأر. يتم حساب EAL (الخط الأرجواني) من تشتت الأنسجة (الخط الأحمر) وامتصاص الماء في الأنسجة (الخط الأزرق) ، بافتراض تكوين الماء بنسبة 75٪. تشير النجوم السوداء إلى البيانات التجريبية المبلغ عنها ل EAL في القشرة المخية الحديثة لدماغ الفأر3،21،28،29. لاحظ أن EAL يختلف في الأنسجة المختلفة. اختصار: EAL = طول التوهين الفعال. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الطول الموجي للإثارة (نانومتر)</td>
			<td>مياه الغمر</td>
			<td>أقصى طاقة ليزر (ميغاواط)</td>
			<td>طاقة نبض قصوى عند التركيز البؤري* (نيوجيرسي)</td>
			<td>EAL نموذجي في قشرة الفأر (ميكرومتر)</td>
			<td>عمق التصوير في قشرة الفأر** (مم)</td>
			<td>طاقة النبض تحت الهدف*** (نيوجيرسي)</td>
			<td>الحد الأقصى لمعدل تكرار الليزر**** (ميغاهرتز)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O أو D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~ 300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~ 14</td>
			<td>~ 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~ 55</td>
			<td>~ 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~ 210</td>
			<td>~ 0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~ 1100</td>
			<td>~ 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">د2س</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~ 400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~ 7</td>
			<td>~ 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~ 20</td>
			<td>~ 2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~ 55</td>
			<td>~ 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~ 190</td>
			<td>~ 0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: ظروف الإثارة النموذجية 3P لتصوير قشرة الفأر. * مع هدف NA مرتفع (~ 1.0) ، وعرض النبض ~ 50 fs ، والفلوروفورات النموذجية مثل البروتينات الفلورية (على سبيل المثال ، GFP و RFP). ** مع افتراض أن EAL موحد في القشرة بأكملها. لتحقيق ~ 1 نانوجول / نبض في التركيز البؤري ، محسوبة من EAL وعمق التصوير. محسوبة من طاقة النبض تحت الهدف والحد الأقصى لطاقة الليزر المتساهلة. الاختصارات: 3P = ثلاثة فوتون. NA = فتحة عددية; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; RFP = بروتين الفلورسنت الأحمر; EAL = طول التوهين الفعال.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

يتيح الفحص المجهري ثلاثي الفوتونات التصوير الفلوري عالي التباين في عمق الأنسجة البيولوجية الحية، مثل أدمغة الفئران وأسماك الزرد، بدقة مكانية زمانية عالية.

المجهر الفلوري ثلاثي الفوتون للأنسجة العميقة في دماغ الفأر وسمك الزرد السليم

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

يوضح البروتوكول كيفية إجراء الفحص المجهري ثلاثي الفوتون في الأنسجة العميقة في الجسم الحي في دماغ الفأر والزرد البالغ. نظامان نموذجيان مهمان في علوم الحياة. يتيح الفحص المجهري ثلاثي الفوتونات طويل الطول الموجي التصوير المكاني عالي الدقة للأنسجة أو الأعضاء السليمة في أعماق لا يمكن الوصول إليها بواسطة المجهر ثنائي الفوتون.يمكن أن تساعدنا هذه التقنية على فهم الآليات الكامنة وراء الأمراض العصبية ، مثل مرض الزهايمر والتوحد ، حيث لا يوجد فهم كامل لكيفية تأثير المرض على الدماغ. سيتم عرض إجراء تصوير دماغ الفأر Kibaek Choe ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبرنا وإظهار إجراء تصوير دماغ الزرد سيكون كريستين كولكمان ، وهي باحثة مشاركة من مختبر أبحاث Fetcho. للبدء ، قم بتشغيل الليزر واضبط الطول الموجي المركزي لخرج الخمول للمضخم البصري البارامتري غير الخطي على 1،300 أو 1،700 نانومتر ، ثم ضع ضواغط النبض على مسار الضوء لتغريد ليزر الفيمتو ثانية مسبقا وتحسين مدة النبض للتصوير ثلاثي الفوتونات.اضبط الزاوية بين صفيحة السيليكون ومسار الليزر بزاوية بروستر لزيادة نفاذية الليزر إلى أقصى حد ، ثم قم بتدوير صفيحة السيليكون لتحقيق زاوية بروستر عن طريق تقليل الانعكاس. بعد ذلك ، ضع مرايا الزعانف للتبديل بسهولة بين خطوط شعاع 1،300 و 1 ، 700 نانومتر. ضع صفيحة موجية نصف مثبتة على مرحلة دوران ومقسم شعاع استقطاب للتحكم في شدة الليزر ، ثم ضع مانع شعاع في مسار انعكاس مقسم الشعاع.تحضير طبق بتري مع 0.5 سم من 2٪ من أجار درجة الانصهار العالية 2٪. بمجرد أن يبرد الأجار ويتصلب ، قم بقطع ثقب مستطيل في الآجار لفترة أطول وأوسع قليلا من الأسماك. باستخدام الشمع ، قم بتوصيل أنابيب رقيقة بطبق Petri مع نهاية واحدة في المستطيل وأنبوب أكبر قطرا على حافة طبق Petri.بعد ذلك ، قم بتخدير الأسماك عن طريق وضعها في محلول تريكاين 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر ، ثم ضع السمكة المخدرة على جانبها على إسفنجة رطبة ، ثم باستخدام حقنة دقيقة ، حقن 3 ميكرولترات من بروميد الباكورونيوم في المدار الرجعي لشل الأسماك ووضعها لفترة وجيزة في محلول هانك لضمان شلولها بالكامل. بعد ذلك ، ضع الجانب الظهري للسمك في طبق بتري مع الرأس نحو الأنابيب ، ثم باستخدام الملقط ، افتح فم السمكة بلطف وحرك الأنبوب في الفم. حرك السمكة برفق نحو الأنابيب بحيث تكون الأنابيب في الجزء الخلفي من فم السمكة.بسرعة ، ولكن بلطف ، قم بتجفيف الآجار حول الأسماك وإزالة الماء فوق السمكة. اغمس قطعة صغيرة من أنسجة المختبر في غراء المختبر وضع الأنسجة على الآجار على جانبي السمكة وفوق ظهر السمكة الذيلية إلى الخياشيم. بعد ذلك ، قم بتخدير جلد السمكة عن طريق وضع قطرة صغيرة من بوبيفاكايين مباشرة على سطح الرأس ، ثم أحضر طبق بتري مع السمك إلى المجهر.املأ الطبق بمياه مرفق الأسماك وقم بتوصيله بالأنابيب إلى مضخة مياه لضخ مياه النظام في فم السمكة. تأكد من أكسجة الماء باستخدام فقاعة وتسخينه إلى 30 درجة مئوية باستخدام سخان حوض السمك. للتصوير ، ضع هدفا منخفض التكبير على المجهر ثلاثي الفوتون ، ثم ضع طبق بتري الذي يحتوي على الأسماك والأنابيب تحت المجهر واستخدم مصدر ضوء LED لإضاءة طبق بتري.من برنامج الحصول على الصور، افتح وضع الكاميرا، وانقر على لايف، واختر القناة A على الجانب الأيمن من الشاشة واضبط إعدادات الرسم البياني لرؤية الصورة بوضوح. بعد ضبط إعداد المحرك على وحدة التحكم في المحرك إلى القاعدة ، اخفض الهدف حتى تصبح الأسماك مرئية. ضع مركز رأس السمكة في وسط مجال الرؤية ، ثم حرك الهدف لأعلى وبعيدا عن رأس السمكة.استبدل العدسة الموضوعية منخفضة التكبير بالعدسة الموضوعية ذات الفتحة العددية العالية للتصوير ثلاثي الفوتونات، ثم حركها بالقرب من رأس السمكة. اضبط قيم المحاور لجميع المحركات على الصفر. اخفض العدسة الموضوعية ببطء ، مما يضمن عدم اتصال الهدف بالرأس جسديا.في برنامج كاميرا CCD ، توقف عن تحريك الهدف عندما يكون الجزء العلوي من الرأس مرئيا واضبط مواقع X و Y و Z على الصفر. أطفئ مصدر ضوء LED وأغلق الستارة المظلمة حول النظام ، ثم اضبط برنامج الحصول على التصوير على وضع GG متعدد الفوتونات للتصوير ثلاثي الفوتونات واضبط الطاقة تحت العدسة الموضوعية على أقل من مللي واط واحد. انقر على زر Live في برنامج الحصول على الصور.افتح قنوات PMT واضبط مستوى اكتساب PMT والخلفية حسب الحاجة. حرك ببطء العدسة الموضوعية لتحديد موقع سطح الرأس عن طريق مراقبة قناة THG من الأوعية الدموية الكبيرة وسطح زجاج النافذة. بعد تحريك عدسة الهدف بالقرب من النافذة ، ضع الماء بين الهدف ونافذة الجمجمة ، ثم اضبط قيم المحور لجميع المحركات على الصفر.انقر على زر Live في برنامج الحصول على الصور. افتح قنوات PMT واضبط مستوى كسب PMT والخلفية حسب الحاجة ، ثم حرك ببطء العدسة الموضوعية لتحديد موقع سطح انزلاق الغطاء عن طريق مراقبة قناة THG من الأوعية الدموية الكبيرة وسطح زجاج النافذة. اضبط اتجاه النافذة إذا لزم الأمر ، ثم صفر المحركات لتحديد سطح الدماغ.قم بإجراء التصوير وضبط مستوى الطاقة وفقا لعمق التصوير. يتم تحقيق تصوير عالي الدقة وغير غازي وعميق للخلايا العصبية ذات العلامات الوراثية في دماغ الزرد البالغ باستخدام المجهر ثلاثي الفوتونات. يمكن أيضا ملاحظة توزيع طبقات الخلايا في التكتوم البصري والمخيخ.تم استخدام ميزة الكاميرا في المجهر لتحديد موقع الأسماك. وينظر إلى الجمجمة في قناة THG ، مما يساعد على التنقل في الدماغ والعثور على السطح العلوي. يمكن تمييز الخلايا العصبية بنسبة إشارة إلى خلفية عالية في عمق دماغ البالغين.يتم عرض صور متعددة الألوان ثلاثية الفوتونات للخلايا العصبية التي تحمل علامة GCaMP6s والأوعية الدموية ذات العلامات الحمراء في تكساس مع إشارات THG في دماغ الفأر البالغ هنا. مع تحسين الإعداد ، تم الحصول على صور عالية التباين بنجاح حتى 1.2 ملم من سطح الدماغ في منطقة الحصين CA1. أظهرت آثار نشاط الكالسيوم للخلايا العصبية الموسومة GCaMP6s على عمق 750 ميكرومتر لجلسة تسجيل مدتها 10 دقائق دقة تسجيل عالية.يمكن أن يساعد هذا الإعداد في تصور النشاط العصبي لفهم وظائف الدماغ. ويمكن أيضا أن تستخدم لتتبع حركة الخلايا داخل الأنسجة البيولوجية لفهم النظم البيولوجية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا قياس سرعة تدفق الدم لمراقبة صحة الحيوان.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

تسجيل الكهربية في الدماغ سليمة من اسماك الزرد الكبار

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

تنقية ماوس سفن الدماغ

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

في التصوير في الجسم من نقل السائل الدماغي الشوكي من خلال جمجمة الماوس سليمة باستخدام التنظير الكلي الفلوري

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

تصوير خلية واحدة للدماغ بالكامل وتحليل أدمغة الفئران حديثي الولادة السليمة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي ومسح الأنسجة والفحص المجهري للورقة الضوئية

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...