Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub en NIH 1U01NS103516.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li><li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain.">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li><li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li><li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+Ca2++imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy.">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li><li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy.">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177 (2019).</li><li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain.">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li><li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser.">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science &amp; Applications. 7, 12 (2018).</li><li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain.">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots.">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull.">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li><li>Xu, C., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+of+molecular+fluorophores+and+nonlinear+laser+microscopy.">Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy.</a> Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , 471-540 (2002).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).</li><li>&#321;ukasiewicz, K., Robacha, M., Bo&#380;ycki, &. #. 3. 2. 1. ;., Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex.">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).</li><li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity.">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).</li><li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms.">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging.">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li><li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1,700+nm.">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain.">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205 (2020).</li><li>Cheng, L. -. C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -. J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy.">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li><li>Huang, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish.">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche.">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li><li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain.">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li><li>Vogel, A., Noack, J., H&#252;ttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues.">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li><li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy.">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li><li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).</li><li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy.">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li></ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dit protocol legt stapsgewijze procedures uit voor het instellen van 3P-beeldvorming met een commerciële microscoop en laserbron. In vergelijking met 2PM heeft 3PM een voordeel in toepassingen die optische toegang vereisen in de diepere gebieden, zoals in de hippocampus van de hersenen van de muis. Hoewel 3PM meestal wordt gebruikt in de neurowetenschappen, kan 3PM mogelijk worden toegepast in andere weefsels zoals lymfeklieren, botten en tumoren voor observatie van diep weefsel.
Het is belangrijk om te controleren of het beeldvormingssysteem dicht bij de opnameruislimiet presteert, wat ervoor zorgt dat de detectie- en data-acquisitie-elektronica verwaarloosbare ruis aan het beeld toevoegt na de PMT's. De onzekerheid in het aantal gedetecteerde fotonen wordt fundamenteel beperkt door fotonopnameruis. Shot-noise beperkte prestaties kunnen worden bereikt in een typische multifotonenmicroscoop met behulp van een high-gain fotodetector (bijvoorbeeld een PMT). Fotonopnameruis volgt een Poisson statistische verdeling, waarbij de standaarddeviatie van de verdeling gelijk is aan de vierkantswortel van het gemiddelde van de verdeling. Als u de prestaties van de opnameruis wilt controleren, volgt u stap 1.14 in de protocolsectie.
Om lichte demping door H2O te voorkomen, is het gebruik van D2O voor onderdompeling nuttig, met name voor ~1.700 nm excitatie. Wanneer D2O wordt gebruikt, is het essentieel om D2O elke ~ 10 minuten te vernieuwen of een groot volume D2O te gebruiken om D2O / H2O-uitwisseling tijdens beeldvorming te voorkomen. Men kan ook de D2O afdichten van de kameromgeving3. Als een wd-objectieflens (long working distance) (bijv. WD bij 4 mm of langer) wordt gebruikt voor beeldvorming, kan de dikte van de dompelvloeistof groter zijn dan 2-3 mm. De toegenomen dikte maakt H2O absorptie niet-verwaarloosbaar, zelfs bij ~1.300 nm21. Daarom kan D2O zelfs nodig zijn voor 1.300 nm 3PM bij gebruik van een lange WD-objectieflens.
Aangezien de 3P-fluorescentie-intensiteit afhankelijk is van de kubus van de excitatiepulsenergie op de focus (Eq. (1)), is het instellen van het juiste laservermogen bijzonder belangrijk om adequate 3P-fluorescentiesignalen te verkrijgen en tegelijkertijd thermische en niet-lineaire schade in levende weefsels te voorkomen. Het gemiddelde laservermogen moet onder de thermische schadedrempel worden gehouden. In het muizenbrein, bijvoorbeeld, om thermische weefselschade te voorkomen, moet het gemiddelde vermogen op het hersenoppervlak van de muis op of onder ~ 100 mW worden gehouden voor ~ 1.300 nm excitatie op een diepte van 1 mm en met een gezichtsveld (FOV) van 230 μm x 230 μm21. Evenzo moet het gemiddelde vermogen op ~ 1.700 nm op of onder ~ 50 mW op ~ 1 mm diepte en een FOV van ~ 230 μm x 230 μm (niet-gepubliceerde gegevens) worden gehouden. Verder, om excitatieverzadiging en potentiële niet-lineaire schade te voorkomen, moet de excitatiepulsenergie op <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2 nJ en <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 nJ worden gehouden voor ~ 1.300 nm en ~ 1.700 nm excitatie, respectievelijk30.
Door lichtabsorptie en verstrooiing in weefsels wordt de pulsenergie bij focus verzwakt tot 1/e (~37%) na penetratie van weefsels door 1 EAL. De EAL varieert in verschillende weefsels en met de excitatiegolflengten, bijvoorbeeld in de neocortex van het muizenbrein, is de EAL ~ 300 μm en ~ 400 μm bij ~ 1.300 nm en ~ 1.700 nm, respectievelijk 3,29 (figuur 5). Om dezelfde pulsenergie scherp te houden (bijv. 1 nJ/puls) op een diepte van n EHL's, moet de oppervlaktepulsenergie daarom worden vermenigvuldigd met 1 nJ × en. Voor een snelle beeldvorming van structurele en functionele dynamica is een excitatielaser met een hoge herhalingsfrequentie (bij 1 MHz of hoger) wenselijk om een hoge frameratevan 5,6,7,10 te bereiken. De pulsenergiebehoefte en de gemiddelde laservermogenslimiet beperken echter de toepasselijke herhalingssnelheid.
Wanneer we bijvoorbeeld een matig diep gebied bij 4 EPL's (d.w.z. ~ 1,2 mm in de muizencortex met 1.300 nm excitatie) in beeld brengen, is ~ 55 nJ / puls aan het oppervlak nodig om 1 nJ / puls scherp te houden. Wanneer de gemiddelde vermogensbeperking 100 mW is, kunnen we een laserherhalingssnelheid van ~ 2 MHz toepassen. Om echter dieper te fotograferen op een diepte van 7 EPL's, is ~ 1.100 nJ / puls aan het oppervlak vereist om 1 nJ / puls scherp te houden. Ervan uitgaande dat het maximale gemiddelde vermogen 100 mW is om thermische schade te voorkomen, moet de laserherhalingssnelheid worden verlaagd tot 0,1 MHz om een 1.100 nJ / puls aan het oppervlak te bereiken. Tabel 1 geeft een overzicht van typische beeldvormingscondities in de hersenschors van muizen. Merk op dat de beelddiepten in tabel 1 ervan uitgaan dat de EAL uniform is in de gehele cortex van de muis.
Bovendien bestaat er vanwege de beperking van het laservermogen in deep-tissue 3PM een afweging tussen de framesnelheid en de grootte van de beeldpixel, wat vooral belangrijk is voor functionele beeldvorming zoals calciumbeeldvorming. De maximaal beschikbare laserherhalingssnelheid wordt op elke diepte bepaald op basis van de vereiste pulsenergie bij focus en het toepasselijke gemiddelde laservermogen zoals hierboven besproken, bijvoorbeeld 2 MHz op een diepte die overeenkomt met ~ 4 EHL's met 1.300 nm excitatie. Over het algemeen vereist beeldvorming ten minste één puls per pixel. Dienovereenkomstig wordt de minimaal beschikbare pixelverblijftijd bepaald door de laserherhalingssnelheid, bijvoorbeeld 0,5 μs / pixel met 2 MHz excitatie.
Om de hoge ruimtelijke resolutie (~1 μm in lateraal) in 3P-beelden te behouden, is het ideaal om 1 pixel in te stellen op een oppervlakte van ~1 μm2, bijvoorbeeld 256 x 256 pixels voor een FOV van 250 x 250 μm2. Daarom, om snelle beeldvorming uit te voeren met een aanzienlijk grote FOV (bijv. 250 x 250 μm2 met 256 x 256 pixels), 0,5 MHz, 1 MHz en 2 MHz pulsherhalingsfrequenties geven theoretische maximale framesnelheden van respectievelijk ~ 7,6, ~ 15 en ~ 30 frames / s. Evenzo is de optimalisatie van de laserherhalingssnelheid essentieel, afhankelijk van de doeldiepte, scansnelheid en FOV, om voldoende pulsenergie toe te passen onder de thermische schadedrempel. Om de beeldvormingssnelheid te verhogen, kan een adaptieve excitatiebron worden gebruikt om alle excitatiepulsen op de neuronen (d.w.z. interessegebieden) te concentreren door laserpulsen op aanvraag aan de neuronen te leveren31.
3PM is voordelig in vergelijking met 2PM in diepe beeldvorming in levende weefsels en door sterk verstrooiende media zoals een schedel, botten en de witte stoflaag (d.w.z. de externe capsule) van de muizenhersenen. De langere EAL en de hogere orde niet-lineaire excitatie van 3PE komt ten goede aan deep-tissue imaging. Om bijvoorbeeld GCaMP6 in de muizenschors in beeld te brengen, is het 2P-fluorescentiesignaal met 920 nm excitatie hoger dan het 3P-fluorescentiesignaal met 1.300 nm excitatie in ondiepe gebieden bij <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">690 μm (d.w.z. ~ 2,3 EPL's bij 1.300 nm)21. Vanwege de langere EAL bij 1.300 nm in vergelijking met 920 nm, geeft 3PE echter sterkere fluorescentie dan 2P-excitatie (2PE) op een diepte van ~ 690 μm en dieper21. Deze diepte wordt gedefinieerd als 'signaalovergangsdiepte', waarbij de fluorescentiesignaalsterkten van 2PE en 3PE identiek zijn met dezelfde herhalingsfrequentie en dezelfde maximaal toegestane gemiddelde vermogens21. De signaalovergangsdiepte is afhankelijk van de excitatiegolflengten voor 2PE en 3PE en de fluorofoor.
In de praktijk maakt 920 nm excitatie een hoger gemiddeld laservermogen mogelijk dan 1.300 nm excitatie door minder waterabsorptie. Het hogere gemiddelde vermogen van 2PE zou de signaalovergangsdiepte echter slechts met 0,9 EPL'sduwen 4. Bovendien, wanneer het monster dicht gelabeld is, heeft 3PE het extra voordeel van een veel hogere SBR. Daarom kan 3PM, zelfs voordat de crossover-lengte van het signaal wordt bereikt, beter zijn voor beeldvorming dan 2PM. Bijvoorbeeld, bij het afbeelden van de hersenen van de muis, die een volumefractie (d.w.z. labelingdichtheid) heeft van ~ 2%, 1.300 nm 3PM met 100 mW excitatievermogen presteert beter dan 920 nm 2PM met 200 mW excitatievermogen op een diepte van ~ 700 μm voor fluoresceïne.
3PM heeft ook een voordeel bij beeldvorming door een dunne maar sterk verstrooiende laag die de puntspreidingsfunctie van de excitatiestraal kan vervormen en een onscherpte-achtergrond kan genereren4. Bijvoorbeeld, door de intacte schedel van het muizenbrein lijden 2PM-beelden aan de onscherpte-achtergrond, zelfs op de ondiepe diepte van <100 μm van het hersenoppervlak13. Een vergelijkbare onscherpte-achtergrond werd waargenomen in 2PM met 1.280 nm excitatie door de witte stof in het muizenbrein32. Daarom, wanneer weefsels worden afgebeeld door troebele lagen, heeft 3PM de voorkeur boven 2PM voor beeldvorming met hoog contrast, ongeacht de labelingdichtheid.
We hebben onlangs een fantoom- en theoretische analyse van kralen gemeld waaruit blijkt dat de beelddieptelimiet van 3PM meer dan 8 EPL's33 is; 8 EOL's zijn gelijk aan ~3 mm met ~1.700 nm excitatie in de muizenschors. De momenteel beschikbare laser heeft echter niet genoeg pulsenergie om 8 EPL's in het muizenbrein te bereiken. Verdere ontwikkeling van sterkere lasers zal de huidige beelddieptegrens van 15.00 uur verleggen.

In de biowetenschappen zijn multifotonenmicroscopie (MPM) -technieken, zoals 2PM en 3PM, krachtige hulpmiddelen geweest voor diepe in vivo beeldvorming met een hoge spatiotemporale resolutie en een hoog contrast in verstrooiende weefsels. Bovendien veroorzaken deze methoden minder fotobleaching in vergelijking met confocale microscopiemet één foton 1,2,3,4. 3PM is voordelig voor beeldvorming van dieper weefsel in vergelijking met 2PM vanwege twee belangrijke kenmerken: (i) het gebruik van excitatie met een langere golflengte (~ 1.300 nm of ~ 1.700 nm) vermindert weefselverstrooiing, en (ii) het excitatieproces van hogere orde (d.w.z. fluorescentiesignaal hangt af van de kubus van het excitatievermogen in 3PM in plaats van het kwadraat van het excitatievermogen in 2PM) dat de ongewenste achtergrondfluorescentie onderdrukt3 . Bijgevolg maakt 3PM beeldvorming met hoog contrast mogelijk op diepere gebieden in levende weefsels zoals de hippocampus in een intact volwassen muizenbrein 3,5,6,7,8,9,10,11 en de volledige voorhersenen van volwassen zebravissen12, inclusief Ca2+ activiteitsregistratie en veelkleurige waarnemingen. Bovendien zijn contrastrijke beelden verkregen met 3PM door de intacte schedels van muis en volwassen zebravis12,13.
Tegenwoordig zijn excitatielaserbronnen die geschikt zijn voor 3P-excitatie (3PE) bij ~ 1.300 en ~ 1.700 nm in de handel verkrijgbaar. Omdat het laserscansysteem in wezen hetzelfde is voor 2PM en 3PM, is het omzetten van een bestaande 2P-opstelling naar een 3P-opstelling mogelijk in biologielaboratoria met de installatie van een commercieel verkrijgbare laser voor 3PE. Het 3P-fluorescentiesignaal is afhankelijk van het laservermogen, de pulsduur, de laserherhalingsfrequentie en het numerieke diafragma (NA) van de objectieflens. Uitgaande van een diffractie-beperkte focus (d.w.z. het achterste diafragma van de objectieflens wordt overvuld door de excitatiebundel), beschrijft Eq (1) de tijdgemiddelde fluorescentiefotonenflux van het brandpuntsvolume als gevolg van 3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Waarbij f de laserherhalingssnelheid is, τ de duur van de laserpuls (volledige breedte bij maximaal de helft), φ de efficiëntie van de systeemverzameling is, η de fluorescentie-kwantumefficiëntie is, σ3 de 3P-absorptiedoorsnede is, C de fluorofoorconcentratie, n0 de reflecterende index van het monstermedium (bijv. Water), λ de excitatiegolflengte in vacuüm is, NA is het numerieke diafragma van de objectieflens, een3 is de ruimtelijke integratieconstante van het brandpuntsvolume, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> is de tijdgemiddelde excitatiefotonenflux (fotonen / s) onder de objectieflens, z is de bebeelde diepte en EAL is de effectieve dempingslengte14. Hier hebben we aangenomen dat de EAL (meestal > 100 μm) veel groter is dan de axiale resolutie van de microscoop (meestal < 10 μm). Bij paraxiale benadering is een3 gelijk aan 28,114. gp(3) is de3e-orde temporele coherentie van de excitatiebron, en gp(3) is respectievelijk 0,41 en 0,51 voor hyperbolisch-secant-kwadraatpulsen en gaussische pulsen. De opvangefficiëntie φ kan worden geschat door rekening te houden met de fluorescentieverzameling door de objectieflens, de transmissie van de objectieflens, de reflectiviteit van de dichroïsche spiegel, de transmissie van de filters en de detectie-efficiëntie van de detector (bijv. Fotomultiplicatorbuis of PMT). Omdat de 3P-fluorescentie-intensiteit sterk afhankelijk is van verschillende parameters, is optimalisatie van de 3P-opstelling vereist om de 3P-fluorescentiesignalen te maximaliseren.
Dit protocol illustreert het optimalisatieproces van een typische 3P-opstelling, wat met name nuttig zal zijn voor biologielaboratoria die een 2P-opstelling hebben en van plan zijn om de mogelijkheden uit te breiden naar 3P-beeldvorming of om hun commerciële 3P-opstelling op optimale prestaties te houden. Dit video-artikel demonstreert ook deep-tissue 3P-beeldvorming in levende dierlijke hersenen. Het eerste deel behandelt de optimalisatie van een typische 3P-opstelling met een in de handel verkrijgbare laserbron en multifotonenmicroscoop. Het tweede en derde deel beschrijven respectievelijk zebravissen en muizenvoorbereiding voor 3PM van neuronale structuren en activiteiten. De craniotomiechirurgie bij muizen is eerder gemeld in protocoldocumentenen 15,16,17. Het vierde deel toont intravitale 3P-beeldvorming in zebravis- en muizenhersenen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

Multifotonenmicroscopietechnieken, zoals tweefotonenmicroscopie (2PM) en drie-fotonenmicroscopie (3PM), zijn krachtige hulpmiddelen voor deep-tissue in vivo beeldvorming met subcellulaire resolutie. 3PM heeft twee grote voordelen voor deep-tissue beeldvorming over 2PM die op grote schaal is gebruikt in biologielaboratoria: (i) langere dempingslengte in verstrooiende weefsels door gebruik te maken van ~ 1.300 nm of ~ 1.700 nm excitatielaser; ii) minder achtergrondfluorescentiegeneratie als gevolg van niet-lineaire excitatie van hogere orde. Als gevolg hiervan maakt 3PM structurele en functionele beeldvorming met hoog contrast diep in verstrooiende weefsels mogelijk, zoals intact muizenbrein van de corticale lagen naar de hippocampus en de volledige voorhersenen van volwassen zebravissen.
Tegenwoordig zijn laserbronnen die geschikt zijn voor 3PM commercieel beschikbaar, waardoor een bestaand twee-foton (2P) beeldvormingssysteem kan worden omgezet in een drie-foton (3P) systeem. Bovendien zijn er meerdere commerciële 3P-microscopen beschikbaar, waardoor deze techniek gemakkelijk beschikbaar is voor biologische onderzoekslaboratoria. Dit artikel toont de optimalisatie van een typische 3PM-opstelling, met name gericht op biologiegroepen die al een 2P-opstelling hebben, en demonstreert intravitale 3D-beeldvorming in intacte muizen- en volwassen zebravishersenen. Dit protocol omvat de volledige experimentele procedure van 3P-beeldvorming, inclusief microscoopuitlijning, prechirping van ~ 1.300 en ~ 1.700 nm laserpulsen, diervoorbereiding en intravitale 3P-fluorescentiebeeldvorming diep in volwassen zebravis- en muizenhersenen.

De succesvolle afronding van dit protocol zal resulteren in een goed uitgelijnde microscoop met optimale lichtparameters (bijv. pulsduur, NA) en dierlijke preparaten die geschikt zijn voor in vivo 3PM. De in de handel verkrijgbare 3P-opstelling bestaat uit geschikte spiegels en lenzen voor zowel ~ 1.300 nm als ~ 1.700 nm; daarom is er geen verandering in de optica nodig wanneer de excitatiegolflengte wordt geschakeld tussen 1.300 nm en 1.700 nm. Als de lenzen in een 3P-opstelling geen geschikte coating hebben voor 1.300 en 1.700 nm, moeten deze worden vervangen door geschikte lenzen om laservermogensverlies te verminderen. Met de geoptimaliseerde 3PM en de juiste diervoorbereiding kunnen in vivo fluorescentie- en THG-beelden met een hoog contrast diep in de hersenen worden verzameld.
Figuur 3 toont representatieve 3P-beelden van intacte volwassen zebravissen. Hoge resolutie, niet-invasieve en diepe beeldvorming van genetisch gelabelde neuronen in het hersenen van volwassen zebravissen wordt bereikt met behulp van 3PM. Hoewel beeldvorming in het telencephalongebied is gemeld in de hersenen van volwassen zebravissen met behulp van 2PM 24,25,26,27, biedt 3PM toegang tot het volledige telencephalon en regio's die uitdagender of onmogelijk te observeren zijn met behulp van andere technieken. De verdeling van cellagen in het optische tectum en cerebellum kan worden waargenomen in figuur 3C. Bij een succesvolle beeldvormingssessie is het bot zichtbaar in het THG-kanaal en neuronen zichtbaar in het fluorescentiekanaal. Voor beeldvorming van volwassen zebravissen werd de camerafunctie van de microscoop gebruikt om de vis te lokaliseren (figuur 3A). Deze stap is niet nodig voor beeldvorming van muizenhersenen, omdat het glazen venster groot genoeg is om de hersenen gemakkelijk toegankelijk te maken. Hoge resolutie structurele beelden van volwassen zebravis hersenen werden verkregen met behulp van het systeem beschreven in de vorige secties. De schedel is te zien in het THG-kanaal (figuur 3B), dat helpt bij het navigeren door de hersenen en het vinden van het bovenste oppervlak. Zoals waargenomen in figuur 3C, zijn neuronen te onderscheiden met een hoge signaal-achtergrondverhouding (SBR) diep in het volwassen brein. Het weefsel boven de hersenen is zichtbaar in het fluorescentiekanaal als gevolg van autofluorescentie.
Figuur 4 toont meerkleurige 3P-afbeeldingen van GCaMP6s-gelabelde neuronen (groen) en Texas Red-gelabelde bloedvaten (rood) samen met THG (blauw) signalen in het volwassen muizenbrein met 1.340 nm excitatie10. De beelden zijn gereproduceerd uit eerder werk10. In figuur 4 werd de pulsenergie bij focus op ~ 1,5 nJ in de gehele diepte gehouden om voldoende fluorescentie- en THG-signalen te verkrijgen, en het maximale gemiddelde laservermogen was ~ 70 mW. De pulsduur werd aangepast tot ~ 60 fs en de effectieve NA was ~ 0,8. Met optimalisatie van de 3PM-opstelling werden met succes contrastrijke beelden verkregen tot op 1,2 mm van het hersenoppervlak, in het CA1 hippocampusgebied (figuur 4A,B). Figuur 4C,D toont Ca2+ activiteitssporen van GCaMP6s-gelabelde neuronen op een diepte van 750 μm voor een opnamesessie van 10 minuten, met een hoge opnamegetrouwheid.
Als de excitatielaser verkeerd is uitgelijnd, kan niet-uniformiteit in signaalhelderheid over het gezichtsveld worden waargenomen. Bovendien, als de laserparameters, zoals de pulsduur, de excitatiepulsenergie bij focus en de effectieve NA, niet zijn geoptimaliseerd, zal het THG-beeld van de visschedel of het craniotomievenster van het muizenbrein niet zichtbaar zijn en / of een hoge excitatiepulsenergie vereisen (bijv. >2 nJ / puls bij focus). Daarom kunnen de THG-signalen aan het hersenoppervlak worden gebruikt als een indicator voor een geoptimaliseerde 3PM-opstelling voordat met deep-tissue imaging wordt begonnen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> Figuur 1: Schematische illustratie van een opstelling om 15.00uur. De golflengte van de excitatielaser is ingesteld op ~1.300 nm of ~1.700 nm, output van de idlerpoort van de NOPA. De prisma-paar compressor en de Si-plaatcompressor worden gebruikt voor respectievelijk de ~ 1.300 nm en ~ 1.700 nm laser om de excitatielaserpuls vooraf te chirpen. De ~1.300 nm en ~1.700 nm laserstralen kunnen worden geschakeld met flipperspiegels. De signaalpoort van de NOPA wordt gebruikt om het triggersignaal te verkrijgen. Een halve golfplaat en een PBS worden gebruikt om het excitatievermogen te regelen. De fluorescentie en THG worden gedetecteerd door GaAsP PMT's. Geschikte combinaties van dichroïsche spiegels en bandpassfilters worden gebruikt om de fluorescentie- en THG-signalen te scheiden. Afkortingen: 3PM = drie-fotonenmicroscopie; NOPA = niet-collineaire optische parametrische versterker; PBS = polariserende bundelsplitser; THG = derde-harmonische generatie; DAQ = data-acquisitie; PMT = fotomultiplicatorbuis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> Figuur 2: Representatieve screenshots voor intravitale beeldvorming bij vissen (protocolsectie 4.1). (A) Cameramodusweergave van de beeldacquisitiesoftware met 4x objectieve lens op zijn plaats. De belangrijkste kenmerken van de software zijn als volgt beschreven en genummerd: 1. Beeldmodus van de beeldacquisitiesoftware. De modusopties zijn Camera, Multiphoton en Multiphoton GG. Voor witlichtbeelden met CCD-camera wordt de cameramodus gekozen. 2. Als u op de Live-knop klikt, wordt de camera ingeschakeld (of PMT's als deze in multifoton-opties zijn) en kan een realtime weergave van de microscoop worden waargenomen. 3. Op het tabblad Capture Setup worden de gewenste beeldparameters (vermogen, locatie, diepte) ingesteld. 4. Op het tabblad Vastleggen wordt een maplocatie toegewezen voor de afbeeldingen die moeten worden opgeslagen. De beeldvorming kan in dit tabblad worden gestart. 5. De Z Control-instelling regelt de diepte van de beeldvorming door de z-trapsmotor te verplaatsen. 6. Representatief beeld van een zebraviskop. De rostrale kant van het hoofd bevindt zich aan de linkerkant. (B) Representatieve weergave van de cameramodus met 25x objectieflens. (C) Representatieve weergave van de multifotonen GG-modus met het THG-beeld van het beeld in (B). Afkortingen: CCD = charge-coupled device; PMT = fotomultiplicatorbuis; THG = derde-harmonische generatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> Figuur 3: Representatieve beelden van het volwassen zebravisbrein verkregen met de beeldacquisitiesoftware. (A) Cameramodusbeeld van volwassen zebraviskop verkregen met een 4x objectieve lens. De bovenkant van het beeld is de rostrale richting. De OT-lobben en CB zijn geschetst. (B) Representatief beeld verkregen in multifoton GG-modus met een 25x objectieflens met het THG-beeld van (A). (C) Fluorescentiebeelden van volwassen zebravishersenen op het snijpunt van het cerebellum en het optische tectum waar GFP tot expressie komt in cytoplasma van neuronen in verschillende diepten. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: OT = optic tectam; CB = cerebellum; THG = derde-harmonische generatie; GFP = groen fluorescerend eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> Figuur 4: Multicolor 3PM van GCaMP6s-gelabelde neuronen (groen), Texas Red-gelabelde bloedvaten (rood) en derde harmonische generatie (blauw) bij 1.340 nm excitatie in het muizenbrein. (A) Z-stack beelden tot 1.200 μm van het hersenoppervlak met een gezichtsveld van 270 x 270 μm (512 x 512 pixels per frame). Het laservermogen werd gevarieerd afhankelijk van de beelddiepte om ~ 1,5 nJ pulsenergie bij de focus te behouden. Het maximale gemiddelde vermogen onder de doelstelling was 70 mW. (B) Geselecteerde 2D-beelden op verschillende beelddiepten. (C) Activiteitsregistratieplaats op 750 μm onder de dura met een gezichtsveld van 270 x 270 μm (256 x 256 pixels). (D) Spontane hersenactiviteit sporen geregistreerd in een wakkere muis van de gelabelde neuronen aangegeven in (C). De framerate was 8,3 Hz, met een pixel verblijftijd van 0,51 μs. De laserherhalingssnelheid was 2 MHz en het gemiddelde vermogen onder de objectieflens was 56 mW. Elk spoor werd genormaliseerd tot de basislijn en low-pass gefilterd met behulp van een hammingvenster van 0,72 s tijdconstante. Schaalbalken = 50 μm. Deze figuur en de figuurlegende zijn gereproduceerd uit 10. Afkorting: 3PM = drie-fotonenmicroscopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> Figuur 5: Effectieve dempingslengte in de neocortex van het muizenbrein. EAL (magenta-lijn) wordt berekend op basis van de weefselverstrooiing (rode lijn) en de waterabsorptie in het weefsel (blauwe lijn), uitgaande van 75% watersamenstelling. De zwarte sterren wijzen op gerapporteerde experimentele gegevens van EAL in de neocortex van het muizenbrein 3,21,28,29. Merk op dat EAL varieert in verschillende weefsels. Afkorting: EAL = effectieve dempingslengte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Excitatie golflengte nm)</td>
			<td>Onderdompelingswater</td>
			<td>Maximaal laservermogen (mW)</td>
			<td>Maximale pulsenergie bij focus* (nJ)</td>
			<td>Typische EAL in de muizenschors (μm)</td>
			<td>Beelddiepte in de cortex van de muis** (mm)</td>
			<td>Pulsenergie onder het doel*** (nJ)</td>
			<td>Maximale laserherhalingssnelheid**** (MHz)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O of D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~ 300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~ 14</td>
			<td>~ 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~ 55</td>
			<td>~ 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~ 210</td>
			<td>~ 0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~ 1100</td>
			<td>~ 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~ 400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~ 7</td>
			<td>~ 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~ 20</td>
			<td>~ 2,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~ 55</td>
			<td>~ 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~ 190</td>
			<td>~ 0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Typische 3P excitatie condities voor muis cortex beeldvorming. * Met een hoge NA (~ 1,0) objectief, pulsbreedte van ~ 50 fs, en typische fluoroforen zoals fluorescerende eiwitten (bijv. GFP en RFP). ** Met de aanname dat de EAL uniform is in de gehele cortex. Om ~1 nJ/puls bij focus te bereiken, berekend op basis van de EAL en de beelddiepte. Berekend op basis van de pulsenergie onder het objectief en het maximale permissieve laservermogen. Afkortingen: 3P = drie-foton; NA = numeriek diafragma; GFP = groen fluorescerend eiwit; RFP = rood fluorescerend eiwit; EAL = effectieve dempingslengte.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Drie-fotonenmicroscopie maakt fluorescentiebeeldvorming met hoog contrast mogelijk diep in levende biologische weefsels, zoals muizen- en zebravishersenen, met een hoge spatiotemporale resolutie.

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Het protocol illustreert hoe in vivo deep-tissue drie-fotonenmicroscopie kan worden uitgevoerd in muizenhersenen en volwassen zebravissen. Twee belangrijke modelsystemen in de life sciences. Lange golflengte drie-foton microscopie maakt in vivo hoge ruimtelijke resolutie beeldvorming van intacte weefsels of organen mogelijk op diepten die ontoegankelijk zijn door twee-fotonenmicroscopie.Deze techniek kan ons helpen de onderliggende mechanismen van neurologische ziekten te begrijpen, zoals alzheimer en autisme, waarbij een volledig begrip van hoe de ziekte de hersenen beïnvloedt ontbreekt. Kibaek Choe, de postdoctorale onderzoeker van ons laboratorium en de zebravis hersenbeeldvormingsprocedure demonstreert Kristine Kolkman, een onderzoeksmedewerker van het Fetcho Research Laboratory. Schakel om te beginnen de laser in en stel de middelste golflengte van de idler-uitgang van de niet-collineaire optische parametrische versterker in op 1, 300 of 1, 700 nanometer, plaats vervolgens pulscompressoren op het lichtpad om de femtosecondelaser vooraf te tsjilpen en de pulsduur te optimaliseren voor beeldvorming met drie fotonen.Stel de hoek tussen de siliciumplaat en het laserpad in de hoek van Brewster in om de lasertransmissie te maximaliseren en draai vervolgens de siliciumplaat om de hoek van Brewster te bereiken door de reflectie te minimaliseren. Plaats vervolgens flipperspiegels om gemakkelijk te schakelen tussen de 1, 300 en 1, 700-nanometer bundellijnen. Plaats een halve golfplaat gemonteerd op een rotatietrap en een polariserende straalsplitter om de intensiteit van de laser te regelen en plaats vervolgens een bundelblokker in het reflectiepad van de bundelsplitser.Bereid een petrischaaltje met 0,5 centimeter 2% hoogsmeltpunt agar. Zodra de agar is afgekoeld en gestold, snijdt u een rechthoekig gat in de agar dat langer en iets breder is dan de vis. Bevestig met behulp van was dunne buizen aan de petrischaal met één uiteinde in de rechthoek en een buis met een grotere diameter aan de rand van de petrischaal.Verdoof vervolgens de vis door hem in een tricaïne-oplossing van 0,2 milligram per milliliter te plaatsen, plaats vervolgens de verdoofde vis op zijn kant op een natte spons, gebruik vervolgens een microsyringe, retro-orbitaal injecteer 3 microliter pancuroniumbromide om de vis te verlammen en plaats hem kort in de oplossing van Hank om ervoor te zorgen dat deze volledig verlamd is. Plaats vervolgens de dorsale kant van de vis in de petrischaal met de kop naar de slang, gebruik vervolgens een tang, open voorzichtig de mond van de vis en schuif de slang in de mond. Schuif de vis voorzichtig naar de slang zodat de slang aan de achterkant van de bek van de vis komt te staan.Droog snel, maar voorzichtig, de agar rond de vis en verwijder het water bovenop de vis. Doop een klein stukje laboratoriumweefsel in laboratoriumlijm en leg het weefsel op de agar aan beide zijden van de vis en over de rug van de vis caudaal naar de kieuwen. Verdoof vervolgens de huid van de vis door een kleine druppel bupivacaïne direct op het oppervlak van het hoofd te plaatsen en breng vervolgens de petrischaal met de vis naar de microscoop.Vul de schaal met viswater en sluit de slang aan op een waterpomp om systeemwater in de bek van de vis te pompen. Zorg ervoor dat het water met een bubbler van zuurstof wordt voorzien en met een aquariumverwarmer wordt opgewarmd tot 30 graden Celsius. Plaats voor beeldvorming een objectief met lage vergroting op de microscoop met drie fotonen, plaats vervolgens de petrischaal met de vis en de buizen onder de microscoop en gebruik een LED-lichtbron om de petrischaal te verlichten.Open in de beeldacquisitiesoftware de cameramodus, klik op Live, kies kanaal A aan de rechterkant van het scherm en pas de histograminstellingen aan om de afbeelding duidelijk te zien. Nadat u de motorinstelling op de motorcontroller op de basis hebt ingesteld, verlaagt u het doel totdat de vis zichtbaar is. Plaats het midden van de viskop in het midden van het gezichtsveld en beweeg het doel omhoog en weg van de kop van de vis.Vervang de objectieflens met lage vergroting door de objectieflens met hoog numeriek diafragma voor beeldvorming met drie fotonen en beweeg deze vervolgens dicht bij het hoofd van de vis. Stel de aswaarden van alle motoren in op nul. Laat de objectieflens langzaam zakken en zorg ervoor dat het objectief geen fysiek contact maakt met het hoofd.Stop in de CCD-camerasoftware met het bewegen van het objectief wanneer de bovenkant van de kop zichtbaar is en stel de X-, Y- en Z-locaties in op nul. Schakel de LED-lichtbron uit en sluit het donkere gordijn rond het systeem, stel vervolgens de beeldverwerkingssoftware in op de multifoton GG-modus voor beeldvorming met drie fotonen en stel het vermogen onder de objectieflens in op minder dan een milliwatt. Klik op de knop Live in de beeldacquisitiesoftware.Open PMT-kanalen en pas de PMT-versterking en het achtergrondniveau indien nodig aan. Beweeg langzaam de objectieflens omhoog om het oppervlak van het hoofd te lokaliseren door het THG-kanaal te bewaken vanuit de grote bloedvaten en het glazen oppervlak van het venster. Nadat u de objectieflens dicht bij het venster hebt geplaatst, brengt u water aan tussen het objectief en het schedelvenster en stelt u de aswaarden van alle motoren in op nul.Klik op de knop Live in de beeldacquisitiesoftware. Open PMT-kanalen en pas de PMT-versterking en het achtergrondniveau indien nodig aan, en beweeg vervolgens langzaam de objectieflens omhoog om het oppervlak van de afdekslip te lokaliseren door het THG-kanaal te bewaken vanaf de grote bloedvaten en het glasoppervlak van het venster. Pas indien nodig de vensteroriëntatie aan en zet vervolgens de motoren op nul om het oppervlak van de hersenen te definiëren.Voer beeldvorming uit en pas het vermogensniveau aan op basis van de beelddiepte. Hoge resolutie, niet-invasieve en diepe beeldvorming van genetisch gelabelde neuronen in het hersenen van volwassen zebravissen wordt bereikt met behulp van drie-fotonenmicroscopie. De verdeling van cellagen in het optische tectum en cerebellum kan ook worden waargenomen.De camerafunctie van de microscoop werd gebruikt om de vis te lokaliseren. De schedel is te zien in het THG-kanaal, dat helpt bij het navigeren door de hersenen en het vinden van het bovenste oppervlak. Neuronen zijn te onderscheiden met een hoge signaal-tot-achtergrondverhouding diep in het volwassen brein.Veelkleurige driefotonenafbeeldingen van GCaMP6s-gelabelde neuronen en Texas Red-gelabelde bloedvaten samen met THG-signalen in het volwassen muizenbrein worden hier getoond. Met setup-optimalisatie werden met succes contrastrijke beelden verkregen tot op 1,2 millimeter van het hersenoppervlak in het CA1-hippocampusgebied. Calciumactiviteitssporen van GCaMP6s-gelabelde neuronen op een diepte van 750 micrometer voor een opnamesessie van 10 minuten toonden een hoge opnamegetrouwheid.Deze opstelling kan helpen bij het visualiseren van neuronale activiteit om de hersenfunctie te begrijpen. Het kan ook worden gebruikt om celbewegingen in biologisch weefsel te volgen om verschillende biologische systemen te begrijpen. Bovendien kan de bloedstroomsnelheid ook worden gemeten om de gezondheid van het dier te controleren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Gericht Ion Beam Frezen en Scanning Electron Microscopy van hersenweefsel

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton Microscopie van Gewist Mouse Brain uiten YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Het olfactorisch systeem als model om axonale groeipatronen en morfologie Bestudeer<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Zuivering van Mouse Brain Schepen

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In vivo beeldvorming van cerebrospinale vloeistof transport door de intact Mouse schedel met behulp van fluorescentie Macroscopie

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...