Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub et NIH 1U01NS103516.

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ce protocole explique les procédures étape par étape pour la mise en place de l’imagerie 3P avec un microscope commercial et une source laser. Par rapport à 14h, 3PM présente un avantage dans les applications nécessitant un accès optique dans les régions plus profondes telles que l’hippocampe cérébral de la souris. Bien que 3PM soit principalement utilisé en neurosciences, 3PM peut être potentiellement appliqué dans d’autres tissus tels que les ganglions lymphatiques, les os et les tumeurs pour l’observation des tissus profonds.
Il est important de vérifier que le système d’imagerie fonctionne à un niveau proche de la limite de bruit de tir, ce qui garantit que l’électronique de détection et d’acquisition de données contribue à un bruit négligeable à l’image après les PMT. L’incertitude du nombre de photons détectés est fondamentalement limitée par le bruit des photons. Un microscope multiphotonique typique peut obtenir des performances limitées en termes de bruit de prise de vue à l’aide d’un photodétecteur à gain élevé (par exemple, un PMT). Le bruit de prise de vue de photons suit une distribution statistique de Poisson, dans laquelle l’écart-type de la distribution est égal à la racine carrée de la moyenne de la distribution. Pour vérifier les performances limitées du bruit de tir, suivez l’étape 1.14 de la section protocole.
Pour éviter l’atténuation de la lumière par H2O, l’utilisation de D2O pour l’immersion est utile, en particulier pour l’excitation d’environ 1 700 nm. Lorsque D2O est utilisé, il est essentiel de rafraîchir D2O toutes les ~10 min ou d’utiliser un grand volume de D2O pour éviter l’échange D2O/H2O pendant l’imagerie. On peut également sceller le D2O de l’environnement de la pièce3. Si une lentille d’objectif à longue distance de travail (WD) (par exemple, WD à 4 mm ou plus) est utilisée pour l’imagerie, l’épaisseur du liquide d’immersion peut dépasser 2-3 mm. L’épaisseur accrue rend l’absorption de H2O non négligeable même à ~1 300 nm21. Par conséquent, D2O peut être nécessaire même pour 1 300 nm 3PM lors de l’utilisation d’un objectif WD long.
Comme l’intensité de fluorescence 3P dépend du cube de l’énergie de l’impulsion d’excitation au foyer (Eq. (1)), le réglage de la puissance laser appropriée est particulièrement important pour obtenir des signaux de fluorescence 3P adéquats tout en évitant les dommages thermiques et non linéaires dans les tissus vivants. La puissance moyenne du laser doit être maintenue en dessous du seuil de dommages thermiques. Dans le cerveau de la souris, par exemple, pour éviter les dommages aux tissus thermiques, la puissance moyenne sur la surface du cerveau de la souris doit être maintenue à ~ 100 mW ou moins pour une excitation d’environ 1 300 nm à une profondeur de 1 mm et avec un champ de vision (FOV) de 230 μm x 230 μm21. De même, la puissance moyenne à ~1 700 nm doit être maintenue à ~50 mW ou moins à ~1 mm de profondeur et un champ de vision d’environ 230 μm x 230 μm (données non publiées). De plus, pour éviter la saturation de l’excitation et les dommages non linéaires potentiels, l’énergie de l’impulsion d’excitation doit être maintenue à <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2 nJ et <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 nJ pour ~1 300 nm et ~1 700 nm d’excitation, respectivement30.
En raison de l’absorption et de la diffusion de la lumière dans les tissus, l’énergie d’impulsion au foyer est atténuée à 1/e (~ 37%) après pénétration des tissus par 1 EAL. L’EAL varie dans différents tissus et avec les longueurs d’onde d’excitation, par exemple, dans le néocortex du cerveau de la souris, l’EAL est d’environ 300 μm et ~400 μm à ~1 300 nm et ~1 700 nm, respectivement 3,29 (Figure 5). Par conséquent, pour maintenir la même énergie d’impulsion au foyer (par exemple, 1 nJ/impulsion) à une profondeur de n ECL, l’énergie d’impulsion de surface doit être multipliée par 1 nJ × en. Pour une imagerie rapide de la dynamique structurelle et fonctionnelle, un laser d’excitation avec un taux de répétition élevé (à 1 MHz ou plus) est souhaitable pour atteindre une fréquence d’images élevéede 5,6,7,10. Cependant, les besoins en énergie d’impulsion et la limite de puissance laser moyenne limitent le taux de répétition applicable.
Par exemple, lorsque nous imageons une région modérément profonde à 4 EAL (c’est-à-dire ~ 1,2 mm dans le cortex de la souris avec une excitation de 1 300 nm), ~ 55 nJ / impulsion à la surface est nécessaire pour maintenir 1 nJ / impulsion à la mise au point. Lorsque la limite de puissance moyenne est de 100 mW, nous pouvons appliquer un taux de répétition laser d’environ 2 MHz. Cependant, pour imager plus profondément à une profondeur de 7 EAL, ~ 1 100 nJ / impulsion est nécessaire à la surface pour maintenir 1 nJ / impulsion à la mise au point. En supposant que la puissance moyenne maximale est de 100 mW pour éviter les dommages thermiques, le taux de répétition du laser doit être réduit à 0,1 MHz pour atteindre une impulsion de 1 100 nJ / à la surface. Le tableau 1 résume les conditions d’imagerie typiques dans le cortex cérébral de la souris. Notez que les profondeurs d’imagerie du tableau 1 supposent que l’EAL est uniforme dans l’ensemble du cortex de la souris.
De plus, en raison de la limitation de la puissance laser dans les tissus profonds de 3PM, il existe un compromis entre la fréquence d’images et la taille des pixels de l’image, ce qui est particulièrement important pour l’imagerie fonctionnelle telle que l’imagerie calcique. Le taux de répétition laser maximal disponible est décidé à chaque profondeur en fonction de l’énergie d’impulsion requise au foyer et de la puissance laser moyenne applicable, comme indiqué ci-dessus, par exemple 2 MHz à une profondeur équivalente à ~ 4 EAL avec une excitation de 1 300 nm. En général, l’imagerie nécessite au moins une impulsion par pixel. En conséquence, le temps de séjour minimal disponible des pixels est déterminé par le taux de répétition laser, par exemple 0,5 μs/ pixel avec une excitation de 2 MHz.
Pour conserver la haute résolution spatiale (~1 μm en latéral) dans les images 3P, il est idéal de définir 1 pixel sur une zone d’environ 1 μm2, par exemple 256 x 256 pixels pour un champ de vision de 250 x 250 μm2. Par conséquent, pour effectuer une imagerie rapide avec un champ de vision considérablement grand (par exemple, des taux de répétition d’impulsions de 250 x250 μm 2 avec 256 x 256 pixels), de 0,5 MHz, 1 MHz et 2 MHz, donne des fréquences d’images maximales théoriques de ~ 7,6, ~ 15 et ~ 30 images / s, respectivement. De même, l’optimisation du taux de répétition laser est essentielle, en fonction de la profondeur cible, de la vitesse de balayage et du champ de vision, pour appliquer une énergie d’impulsion adéquate sous le seuil de dommages thermiques. Pour augmenter la vitesse d’imagerie, une source d’excitation adaptative peut être utilisée pour concentrer toutes les impulsions d’excitation sur les neurones (c’est-à-dire les régions d’intérêt) en délivrant des impulsions laser à la demande aux neurones31.
3PM est avantageux par rapport à 2PM en imagerie profonde dans les tissus vivants et à travers des milieux à forte diffusion tels qu’un crâne, des os et la couche de substance blanche (c’est-à-dire la capsule externe) du cerveau de la souris. L’EAL plus long et l’excitation non linéaire d’ordre supérieur du 3PE profitent à l’imagerie des tissus profonds. Par exemple, pour imager GCaMP6 dans le cortex de la souris, le signal de fluorescence 2P avec une excitation de 920 nm est supérieur au signal de fluorescence 3P avec une excitation de 1 300 nm dans les régions peu profondes à 690 μm (c’est-à-dire <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">~ 2,3 EAL à 1 300 nm)21. Cependant, en raison de l’EAL plus long à 1 300 nm par rapport à 920 nm, le 3PE donne une fluorescence plus forte que l’excitation 2P (2PE) à une profondeur d’environ 690 μm et plus profonde21. Cette profondeur est définie comme la « profondeur de croisement du signal », à laquelle les forces du signal de fluorescence de 2PE et 3PE sont identiques avec le même taux de répétition et les mêmes puissances moyennes maximales admissibles21. La profondeur de croisement du signal dépend des longueurs d’onde d’excitation pour 2PE et 3PE et du fluorophore.
En pratique, l’excitation de 920 nm permet une puissance laser moyenne supérieure à une excitation de 1 300 nm en raison d’une absorption d’eau moindre. Cependant, la puissance moyenne plus élevée de 2PE ne pousserait la profondeur de croisement du signal que de 0,9 EAL4. De plus, lorsque l’échantillon est densément étiqueté, le 3PE présente l’avantage supplémentaire d’un SBR beaucoup plus élevé. Par conséquent, avant même d’atteindre la longueur de croisement du signal, 3PM peut être meilleur pour l’imagerie que 2PM. Par exemple, lors de l’imagerie du système vasculaire cérébral de la souris, qui a une fraction volumique (c’est-à-dire une densité de marquage) d’environ 2%, 1 300 nm 3PM avec une puissance d’excitation de 100 mW surpasse 920 nm 2PM avec une puissance d’excitation de 200 mW à une profondeur d’environ 700 μm pour la fluorescéine.
3PM présente également un avantage lors de l’imagerie à travers une couche mince mais très diffusante qui peut déformer la fonction d’étalement ponctuel du faisceau d’excitation et générer un arrière-plan de défocalisation4. Par exemple, à travers le crâne intact du cerveau de la souris, les images de 14h souffrent de l’arrière-plan de défocalisation même à la faible profondeur de <100 μm de la surface du cerveau13. Un fond de défocalisage similaire a été observé en 2PM avec une excitation de 1 280 nm à travers la substance blanche dans le cerveau de la souris32. Par conséquent, lorsque les tissus sont imagés à travers des couches troubles, 3PM est préférable à 2PM pour l’imagerie à contraste élevé, quelle que soit la densité d’étiquetage.
Nous avons récemment rapporté un fantôme de perles et une analyse théorique montrant que la limite de profondeur d’imagerie de 15 heures est supérieure à 8EAL 33; 8 EAL équivalent à ~3 mm avec une excitation d’environ 1 700 nm dans le cortex de la souris. Cependant, le laser actuellement disponible n’a pas assez d’énergie d’impulsion pour atteindre 8 EAL dans le cerveau de la souris. La poursuite du développement de lasers plus puissants repoussera la limite actuelle de profondeur d’imagerie de 15 heures.

Dans les sciences de la vie, les techniques de microscopie multiphotonique (MPM), telles que 2PM et 3PM, ont été des outils puissants pour l’imagerie in vivo profonde avec une résolution spatio-temporelle élevée et un contraste élevé dans les tissus en diffusion. De plus, ces méthodes provoquent moins de photoblanchiment par rapport à la microscopie confocale à un photon 1,2,3,4. 3PM est avantageux pour l’imagerie des tissus plus profonds par rapport à 2PM en raison de deux caractéristiques majeures : (i) l’utilisation d’une excitation de longueur d’onde plus longue (~1 300 nm ou ~1 700 nm) réduit la diffusion tissulaire, et (ii) le processus d’excitation d’ordre supérieur (c’est-à-dire que le signal de fluorescence dépend du cube de la puissance d’excitation en 3PM au lieu du carré de la puissance d’excitation en 2PM) qui supprime la fluorescence de fond indésirable3 . Par conséquent, 3PM permet une imagerie à contraste élevé dans des régions plus profondes des tissus vivants tels que l’hippocampe dans un cerveau de souris adulte intact 3,5,6,7,8,9,10,11 et l’ensemble du cerveau antérieur du poisson-zèbre adulte12, y compris Ca 2+ enregistrement d’activité et observations multicolores. De plus, des images à contraste élevé ont été obtenues à 15h à travers les crânes intacts de souris et de poissons-zèbres adultes12,13.
Aujourd’hui, des sources laser d’excitation adaptées à l’excitation 3P (3PE) à ~1 300 et ~1 700 nm sont disponibles dans le commerce. Comme le système de balayage laser est essentiellement le même pour 14h et 15h, la conversion d’une configuration 2P existante en une configuration 3P est possible dans les laboratoires de biologie avec l’installation d’un laser disponible dans le commerce pour 3PE. Le signal de fluorescence 3P dépend de la puissance du laser, de la durée de l’impulsion, du taux de répétition du laser et de l’ouverture numérique (NA) de l’objectif. En supposant une mise au point limitée par diffraction (c.-à-d. que l’ouverture arrière de la lentille de l’objectif est surchargée par le faisceau d’excitation), Eq (1) décrit le flux de photons de fluorescence moyen dans le temps à partir du volume focal résultant de 3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Où f est le taux de répétition laser, τ est la durée de l’impulsion laser (pleine largeur à la moitié maximale), φ est l’efficacité de collecte du système, η est l’efficacité quantique de fluorescence, σ3 est la section transversale d’absorption 3P, C est la concentration de fluorophore, n0 est l’indice réfléchissant du milieu de l’échantillon (par exemple, l’eau), λ est la longueur d’onde d’excitation dans le vide, NA est l’ouverture numérique de l’objectif, a3 est la constante d’intégration spatiale du volume focal, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> est le flux de photons d’excitation moyenné dans le temps (photons / s) sous l’objectif, z est la profondeur imagée et EAL est la longueur d’atténuation effective14. Ici, nous avons supposé que l’EAL (généralement > 100 μm) est beaucoup plus grande que la résolution axiale du microscope (généralement < 10 μm). Sous approximation paraxiale, un3 est égal à 28,114. gp(3) est la cohérence temporelle du3e ordre de la source d’excitation, et gp(3) est 0,41 et 0,51 pour les impulsions hyperboliques-sécantes-carrées et les impulsions gaussiennes, respectivement. L’efficacité de la collecte φ peut être estimée en tenant compte de la collecte de fluorescence par la lentille de l’objectif, de la transmittance de la lentille de l’objectif, de la réflectivité du miroir dichroïque, de la transmittance des filtres et de l’efficacité de détection du détecteur (par exemple, tube photomultiplicateur ou PMT). Comme l’intensité de fluorescence 3P dépend fortement de divers paramètres, une optimisation de la configuration 3P est nécessaire pour maximiser les signaux de fluorescence 3P.
Ce protocole illustre le processus d’optimisation d’une configuration 3P typique, ce qui sera particulièrement utile pour les laboratoires de biologie qui ont une configuration 2P et prévoient d’étendre sa capacité à l’imagerie 3P ou de maintenir leur configuration 3P commerciale à des performances optimales. Cet article vidéo démontre également l’imagerie 3P des tissus profonds dans les cerveaux d’animaux vivants. La première section traite de l’optimisation d’une configuration 3P typique avec une source laser disponible dans le commerce et un microscope multiphotonique. Les deuxième et troisième sections décrivent la préparation du poisson-zèbre et de la souris, respectivement, pour 3PM des structures et des activités neuronales. La chirurgie de craniotomie de la souris a déjà été rapportée dans les documents de protocole ainsi que 15,16,17. La quatrième section démontre l’imagerie 3P intravitale dans le cerveau des poissons-zèbres et des souris.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

Les techniques de microscopie multiphotonique, telles que la microscopie à deux photons (2PM) et la microscopie à trois photons (3PM), sont des outils puissants pour l’imagerie in vivo des tissus profonds avec une résolution subcellulaire. 3PM présente deux avantages majeurs pour l’imagerie des tissus profonds par rapport à 2PM qui a été largement utilisée dans les laboratoires de biologie: (i) une longueur d’atténuation plus longue dans les tissus diffusants en utilisant un laser d’excitation ~ 1 300 nm ou ~ 1 700 nm; (ii) moins de génération de fluorescence de fond en raison d’une excitation non linéaire d’ordre supérieur. En conséquence, 3PM permet une imagerie structurelle et fonctionnelle à contraste élevé profondément dans les tissus de diffusion tels que le cerveau intact de la souris des couches corticales à l’hippocampe et à l’ensemble du cerveau antérieur du poisson-zèbre adulte.
Aujourd’hui, des sources laser adaptées à 3PM sont disponibles dans le commerce, permettant la conversion d’un système d’imagerie à deux photons (2P) existant en un système à trois photons (3P). De plus, plusieurs microscopes 3P commerciaux sont disponibles, ce qui rend cette technique facilement accessible aux laboratoires de recherche en biologie. Cet article montre l’optimisation d’une configuration typique de 15 heures, ciblant en particulier les groupes de biologie qui ont déjà une configuration 2P, et démontre l’imagerie 3D intravitale dans des cerveaux intacts de souris et de poissons-zèbres adultes. Ce protocole couvre la procédure expérimentale complète de l’imagerie 3P, y compris l’alignement au microscope, le prépuce d’impulsions laser ~1 300 et ~1 700 nm, la préparation animale et l’imagerie de fluorescence 3P intravitale au plus profond du cerveau des poissons-zèbres et des souris adultes.

La réussite de ce protocole se traduira par un microscope correctement aligné avec des paramètres de lumière optimaux (par exemple, la durée du pouls, NA) et des préparations animales appropriées pour 3PM in vivo . La configuration 3P disponible dans le commerce comprend des miroirs et des objectifs appropriés pour ~ 1 300 nm et ~ 1 700 nm; par conséquent, aucun changement d’optique n’est nécessaire lorsque la longueur d’onde d’excitation est commutée entre 1 300 nm et 1 700 nm. Si les lentilles d’une configuration 3P n’ont pas un revêtement approprié pour 1 300 et 1 700 nm, elles doivent être remplacées par des lentilles appropriées pour réduire la perte de puissance laser. Avec le 3PM optimisé et une préparation animale appropriée, la fluorescence in vivo et les images THG à contraste élevé peuvent être collectées profondément dans le cerveau.
La figure 3 montre des images 3P représentatives de poissons-zèbres adultes intacts. L’imagerie à haute résolution, non invasive et profonde des neurones génétiquement marqués dans le cerveau du poisson-zèbre adulte est réalisée à l’aide de 15 heures. Bien que l’imagerie dans la région du télencéphale ait été rapportée dans le cerveau du poisson zèbre adulte en utilisant2PM 24,25,26,27, 3PM permet d’accéder à l’ensemble du télencéphale et aux régions qui sont plus difficiles ou impossibles à observer en utilisant d’autres techniques. La distribution des couches cellulaires dans le tectum optique et le cervelet peut être observée à la figure 3C. Lors d’une séance d’imagerie réussie, l’os est visible dans le canal THG et les neurones visibles dans le canal de fluorescence. Pour l’imagerie du poisson-zèbre adulte, la fonction de caméra du microscope a été utilisée pour localiser le poisson (Figure 3A). Cette étape n’est pas nécessaire pour l’imagerie cérébrale de la souris car la fenêtre en verre est suffisamment grande pour rendre le cerveau facilement accessible. Des images structurelles à haute résolution du cerveau du poisson zèbre adulte ont été obtenues à l’aide du système décrit dans les sections précédentes. Le crâne est vu dans le canal THG (Figure 3B), ce qui aide à naviguer dans le cerveau et à trouver la surface supérieure. Comme on l’observe à la figure 3C, les neurones se distinguent par un rapport signal/arrière-plan (SBR) élevé profondément dans le cerveau adulte. Le tissu au-dessus du cerveau est visible dans le canal de fluorescence en raison de l’autofluorescence.
La figure 4 montre des images 3P multicolores de neurones marqués GCaMP6s (vert) et de vaisseaux sanguins marqués Texas Red (rouge) ainsi que des signaux THG (bleu) dans le cerveau de souris adulte avec une excitation de 1 340 nm10. Les images sont reproduites à partir de travaux antérieurs10. Dans la figure 4, l’énergie d’impulsion au foyer a été maintenue à ~ 1,5 nJ dans toute la profondeur pour obtenir suffisamment de signaux de fluorescence et de THG, et la puissance laser moyenne maximale était d’environ 70 mW. La durée de l’impulsion a été ajustée à ~60 fs, et le NA effectif était d’environ 0,8. Grâce à l’optimisation de la configuration de 15 heures, des images à contraste élevé ont été obtenues avec succès jusqu’à 1,2 mm de la surface du cerveau, dans la région de l’hippocampe CA1 (Figure 4A, B). La figure 4C,D montre des traces d’activité Ca2+ de neurones marqués GCaMP6s à une profondeur de 750 μm pour une session d’enregistrement de 10 minutes, montrant une haute fidélité d’enregistrement.
Si le laser d’excitation est mal aligné, une non-uniformité de la luminosité du signal dans le champ de vision peut être observée. De plus, si les paramètres du laser, tels que la durée de l’impulsion, l’énergie de l’impulsion d’excitation au foyer et le NA effectif, ne sont pas optimisés, l’image THG du crâne du poisson ou de la fenêtre de craniotomie du cerveau de la souris ne sera pas visible et / ou nécessite une énergie d’impulsion d’excitation élevée (par exemple, >2 nJ / impulsion au foyer). Par conséquent, les signaux THG à la surface du cerveau peuvent être utilisés comme indicateur pour une configuration optimisée de 15 heures avant de commencer l’imagerie des tissus profonds.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> Figure 1 : Illustration schématique d’une configuration à 15heures. La longueur d’onde du laser d’excitation est réglée à ~1 300 nm ou ~1 700 nm, sortie du port de ralenti du NOPA. Le compresseur à paire de prismes et le compresseur à plaque Si sont utilisés pour le laser ~1 300 nm et ~1 700 nm, respectivement, pour prépucer l’impulsion laser d’excitation. Les faisceaux laser ~1 300 nm et ~1 700 nm peuvent être commutés avec des miroirs flipper. Le port de signal du NOPA est utilisé pour obtenir le signal de déclenchement. Une demi-plaque d’onde et un PBS sont utilisés pour contrôler la puissance d’excitation. La fluorescence et le THG sont détectés par les PMT GaAsP. Des combinaisons appropriées de miroirs dichroïques et de filtres passe-bande sont utilisées pour séparer les signaux de fluorescence et de THG. Abréviations : 3PM = microscopie à trois photons ; NOPA = amplificateur paramétrique optique non collinéaire; PBS = séparateur de faisceau polarisant; THG = troisième génération harmonique; DAQ = acquisition de données; PMT = tube photomultiplicateur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> Figure 2 : Captures d’écran représentatives de l’imagerie intravitale chez les poissons (section 4.1 du protocole). (A) Vue en mode caméra du logiciel d’acquisition d’images avec objectif 4x en place. Les principales caractéristiques du logiciel sont décrites et numérotées comme suit: 1. Mode d’imagerie du logiciel d’acquisition d’images. Les options de mode sont Appareil photo, Multiphoton et Multiphoton GG. Pour l’imagerie en lumière blanche avec caméra CCD, le mode Caméra est choisi. 2. Cliquez sur le bouton Live pour allumer l’appareil photo (ou les PMT si dans les options multiphotons), et une vue en temps réel du microscope peut être observée. 3. Dans l’onglet Configuration de la capture, les paramètres d’imagerie souhaités (puissance, emplacement, profondeur) sont définis. 4. Dans l’onglet Capture, un emplacement de dossier est attribué pour les images à enregistrer. L’imagerie peut être démarrée dans cet onglet. 5. Le paramètre Contrôle Z contrôle la profondeur de l’imagerie en déplaçant le moteur de l’étage z. 6. Image représentative d’une tête de poisson zèbre. Le côté rostral de la tête est à gauche. (B) Vue représentative du mode Appareil photo avec objectif 25x. (C) Vue représentative du mode Multiphoton GG contenant l’image THG de l’image vue en (B). Abréviations: CCD = dispositif à couplage de charge; PMT = tube photomultiplicateur; THG = troisième génération harmonique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> Figure 3 : Images représentatives du cerveau du poisson zèbre adulte acquises avec le logiciel d’acquisition d’images. (A) Image en mode caméra de la tête du poisson zèbre adulte acquise avec un objectif 4x. Le haut de l’image est la direction rostrale. Les lobes OT et CB sont décrits. (B) Image représentative acquise en mode Multiphoton GG avec un objectif 25x contenant l’image THG de (A). (C) Images de fluorescence du cerveau du poisson zèbre adulte à l’intersection du cervelet et du tectum optique où la GFP est exprimée dans le cytoplasme des neurones à différentes profondeurs. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations: OT = tectam optique; CB = cervelet; THG = troisième génération harmonique; GFP = protéine fluorescente verte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> Figure 4 : Multicolore 3 PM de neurones marqués GCaMP6s (vert), Texas Red marqués vaisseaux sanguins (rouge) et troisième génération harmonique (bleu) lors d’une excitation de 1 340 nm dans le cerveau de la souris. (A) Images Z-stack jusqu’à 1 200 μm de la surface du cerveau avec un champ de vision de 270 x 270 μm (512 x 512 pixels par image). La puissance du laser a été modifiée en fonction de la profondeur d’imagerie pour maintenir une énergie d’impulsion d’environ 1,5 nJ au foyer. La puissance moyenne maximale sous l’objectif était de 70 mW. (B) Images 2D sélectionnées à différentes profondeurs d’imagerie. (C) Site d’enregistrement d’activité à 750 μm sous la dure-mère avec un champ de vision de 270 x 270 μm (256 x 256 pixels). (D) Traces spontanées d’activité cérébrale enregistrées chez une souris éveillée à partir des neurones marqués indiqués en (C). La fréquence d’images était de 8,3 Hz, avec un temps de séjour en pixels de 0,51 μs. Le taux de répétition laser était de 2 MHz et la puissance moyenne sous la lentille de l’objectif était de 56 mW. Chaque trace a été normalisée à sa ligne de base et filtrée passe-bas à l’aide d’une fenêtre de hamming de 0,72 s de constante de temps. Barres d’échelle = 50 μm. Cette figure et la légende de la figure sont reproduites à partir de 10. Abréviation : 3PM = microscopie à trois photons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> Figure 5 : Longueur d’atténuation effective dans le néocortex du cerveau de la souris. L’EAL (ligne magenta) est calculée à partir de la diffusion tissulaire (ligne rouge) et de l’absorption d’eau dans le tissu (ligne bleue), en supposant une composition en eau de 75%. Les étoiles noires indiquent des données expérimentales rapportées d’EAL dans le néocortex du cerveau de la souris 3,21,28,29. Notez que l’EAL varie selon les tissus. Abréviation : EAL = longueur d’atténuation effective. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Longueur d’onde d’excitation (nm)</td>
			<td>Eau d’immersion</td>
			<td>Puissance laser maximale (mW)</td>
			<td>Énergie d’impulsion maximale au foyer* (nJ)</td>
			<td>EAL typique dans le cortex de la souris (μm)</td>
			<td>Profondeur d’imagerie dans le cortex de la souris** (mm)</td>
			<td>Énergie pulsée dans le cadre de l’objectif*** (nJ)</td>
			<td>Taux de répétition laser maximal**** (MHz)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O ou D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Conditions typiques d’excitation de 3P pour l’imagerie du cortex de la souris. *Avec un objectif NA (~1,0) élevé, une largeur d’impulsion d’environ 50 fs et des fluorophores typiques tels que les protéines fluorescentes (par exemple, GFP et RFP). ** Avec l’hypothèse que l’EAL est uniforme dans tout le cortex. Pour atteindre ~1 nJ/impulsion au foyer, calculé à partir de l’EAL et de la profondeur d’imagerie. Calculé à partir de l’énergie d’impulsion sous l’objectif et de la puissance maximale permissive du laser. Abréviations : 3P = trois photons ; NA = ouverture numérique; GFP = protéine fluorescente verte; RFP = protéine fluorescente rouge; EAL = longueur d’atténuation effective.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

La microscopie à trois photons permet une imagerie par fluorescence à contraste élevé en profondeur dans les tissus biologiques vivants, tels que les cerveaux de souris et de poissons-zèbres, avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Microscopie à fluorescence à trois photons des tissus profonds dans le cerveau intact d’une souris et d’un poisson-zèbre

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Le protocole illustre comment effectuer une microscopie in vivo à trois photons des tissus profonds dans le cerveau de souris et le poisson-zèbre adulte. Deux systèmes modèles importants dans les sciences de la vie. La microscopie à trois photons à longue longueur d’onde permet l’imagerie in vivo à haute résolution spatiale de tissus ou d’organes intacts à des profondeurs inaccessibles par la microscopie à deux photons.Cette technique peut nous aider à comprendre les mécanismes sous-jacents des maladies neurologiques, telles que la maladie d’Alzheimer et l’autisme, où une compréhension complète de la façon dont la maladie affecte le cerveau fait défaut. Kibaek Choe, le chercheur postdoctoral de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure d’imagerie cérébrale du poisson-zèbre et la procédure d’imagerie cérébrale du poisson-zèbre sera Représentée par Kristine Kolkman, associée de recherche du laboratoire de recherche Fetcho. Pour commencer, allumez le laser et réglez la longueur d’onde centrale de la sortie de ralenti de l’amplificateur paramétrique optique non collinéaire à 1, 300 ou 1 700 nanomètres, puis placez des compresseurs d’impulsions sur le chemin de la lumière pour pré-gazouiller le laser femtoseconde et optimiser la durée de l’impulsion pour l’imagerie à trois photons.Réglez l’angle entre la plaque de silicium et le chemin laser à l’angle de Brewster pour maximiser la transmittance laser, puis faites pivoter la plaque de silicium pour atteindre l’angle de Brewster en minimisant la réflexion. Ensuite, placez des miroirs à nageoires pour basculer facilement entre les lignes de faisceau de 1 300 et 1 700 nanomètres. Placez une demi-plaque d’onde montée sur un étage de rotation et un séparateur de faisceau polarisant pour contrôler l’intensité du laser, puis placez un bloqueur de faisceau dans le chemin de réflexion du séparateur de faisceau.Préparez une boîte de Petri avec 0,5 centimètre de gélose à point de fusion élevé de 2%. Une fois que la gélose a refroidi et solidifié, coupez un trou rectangulaire dans la gélose plus long et légèrement plus large que le poisson. À l’aide de cire, fixez un tube mince à la boîte de Petri avec une extrémité dans le rectangle et un tube de plus grand diamètre au bord de la boîte de Pétri.Ensuite, anesthésiez le poisson en le plaçant dans une solution de tricaïne de 0,2 milligramme par millilitre, puis placez le poisson anesthésié sur le côté sur une éponge humide, puis à l’aide d’un microsyringe, injectez rétro-orbitalement 3 microlitres de bromure de pancuronium pour paralyser le poisson et placez-le brièvement dans la solution de Hank pour vous assurer qu’il est complètement paralysé. Ensuite, placez le poisson dorsal dans la boîte de Pétri avec la tête vers le tube, puis à l’aide d’une pince, ouvrez doucement la bouche du poisson et faites glisser le tube dans la bouche. Faites glisser doucement le poisson vers le tube afin que le tube soit à l’arrière de la bouche du poisson.Rapidement, mais doucement, séchez la gélose autour du poisson et retirez l’eau sur le dessus du poisson. Trempez un petit morceau de tissu de laboratoire dans de la colle de laboratoire et placez le tissu sur la gélose des deux côtés du poisson et sur le caudale arrière du poisson jusqu’aux branchies. Ensuite, anesthésiez la peau du poisson en plaçant une petite goutte de bupivacaïne directement sur la surface de la tête, puis apportez la boîte de Pétri avec le poisson au microscope.Remplissez le plat avec de l’eau de l’installation de pêche et connectez-le au tube à une pompe à eau pour pomper l’eau du système dans la bouche du poisson. Assurez-vous que l’eau est oxygénée avec un barboteur et chauffée à 30 degrés Celsius avec un chauffe-aquarium. Pour l’imagerie, placez un objectif à faible grossissement sur le microscope à trois photons, puis placez la boîte de Petri contenant le poisson et les tubes sous le microscope et utilisez une source de lumière LED pour éclairer la boîte de Pétri.À partir du logiciel d’acquisition d’images, ouvrez le mode Appareil photo, cliquez sur Live, choisissez le canal A sur le côté droit de l’écran et ajustez les paramètres de l’histogramme pour voir clairement l’image. Après avoir réglé le réglage du moteur sur le contrôleur du moteur sur la base, abaissez l’objectif jusqu’à ce que le poisson soit visible. Placez le centre de la tête du poisson au centre du champ de vision, puis déplacez l’objectif vers le haut et loin de la tête du poisson.Remplacez l’objectif à faible grossissement par l’objectif à haute ouverture numérique pour l’imagerie à trois photons, puis rapprochez-le de la tête du poisson. Définissez les valeurs d’axe de tous les moteurs sur zéro. Abaissez lentement la lentille de l’objectif, en veillant à ce que l’objectif n’entre pas en contact physique avec la tête.Dans le logiciel de la caméra CCD, arrêtez de déplacer l’objectif lorsque le haut de la tête est visible et réglez les emplacements X, Y et Z à zéro. Éteignez la source de lumière LED et fermez le rideau sombre autour du système, puis réglez le logiciel d’acquisition d’imagerie sur le mode multiphoton GG pour l’imagerie à trois photons et réglez la puissance sous l’objectif à moins d’un milliwatt. Cliquez sur le bouton Live dans le logiciel d’acquisition d’images.Ouvrez les canaux PMT et ajustez le gain PMT et le niveau d’arrière-plan selon vos besoins. Remontez lentement la lentille de l’objectif pour localiser la surface de la tête en surveillant le canal THG des gros vaisseaux sanguins et de la surface vitrée de la fenêtre. Après avoir déplacé la lentille de l’objectif près de la fenêtre, appliquez de l’eau entre l’objectif et la fenêtre crânienne, puis réglez les valeurs d’axe de tous les moteurs à zéro.Cliquez sur le bouton Live dans le logiciel d’acquisition d’images. Ouvrez les canaux PMT et ajustez le gain PMT et le niveau de fond au besoin, puis remontez lentement la lentille de l’objectif pour localiser la surface du glissement du couvercle en surveillant le canal THG des gros vaisseaux sanguins et de la surface vitrée. Ajustez l’orientation de la fenêtre si nécessaire, puis mettez à zéro les moteurs pour définir la surface du cerveau.Effectuez une imagerie et ajustez le niveau de puissance en fonction de la profondeur d’imagerie. L’imagerie à haute résolution, non invasive et profonde des neurones génétiquement marqués dans le cerveau du poisson-zèbre adulte est réalisée à l’aide de la microscopie à trois photons. La distribution des couches cellulaires dans le tectum optique et le cervelet peut également être observée.La fonction de caméra du microscope a été utilisée pour localiser le poisson. Le crâne est vu dans le canal THG, qui aide à naviguer dans le cerveau et à trouver la surface supérieure. Les neurones se distinguent par un rapport signal/arrière-plan élevé profondément dans le cerveau adulte.Des images multicolores à trois photons de neurones marqués GCaMP6s et de vaisseaux sanguins marqués Texas Red ainsi que des signaux THG dans le cerveau de souris adultes sont montrées ici. Grâce à l’optimisation de la configuration, des images à contraste élevé ont été obtenues avec succès jusqu’à 1,2 millimètre de la surface du cerveau dans la région de l’hippocampe CA1. Les traces d’activité calcique des neurones marqués GCaMP6s à une profondeur de 750 micromètres pour une session d’enregistrement de 10 minutes ont montré une haute fidélité d’enregistrement.Cette configuration peut aider à visualiser l’activité neuronale pour comprendre le fonctionnement du cerveau. Il peut également être utilisé pour suivre le mouvement des cellules dans les tissus biologiques afin de comprendre divers systèmes biologiques. De plus, la vitesse du flux sanguin peut également être mesurée pour surveiller la santé de l’animal.

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