Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NSF DBI-1707312 קורנל NeuroNex Hub ו NIH 1U01NS103516.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li><li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain.">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li><li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li><li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+Ca2++imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy.">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li><li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy.">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177 (2019).</li><li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain.">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li><li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser.">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science &amp; Applications. 7, 12 (2018).</li><li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain.">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots.">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull.">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li><li>Xu, C., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+of+molecular+fluorophores+and+nonlinear+laser+microscopy.">Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy.</a> Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , 471-540 (2002).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).</li><li>&#321;ukasiewicz, K., Robacha, M., Bo&#380;ycki, &. #. 3. 2. 1. ;., Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex.">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).</li><li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity.">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).</li><li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms.">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging.">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li><li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1,700+nm.">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain.">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205 (2020).</li><li>Cheng, L. -. C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -. J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy.">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li><li>Huang, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish.">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche.">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li><li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain.">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li><li>Vogel, A., Noack, J., H&#252;ttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues.">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li><li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy.">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li><li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).</li><li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy.">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול זה מסביר נהלים שלב אחר שלב להגדרת הדמיית 3P עם מיקרוסקופ מסחרי ומקור לייזר. בהשוואה לשעה 14:00, לשעה 15:00 יש יתרון ביישומים הדורשים גישה אופטית באזורים העמוקים יותר כמו בהיפוקמפוס של מוח העכבר. למרות ש-15:00 משמשת בעיקר במדעי המוח, ניתן ליישם את השעה 15:00 ברקמות אחרות כגון בלוטות לימפה, עצמות וגידולים לתצפית על רקמות עמוקות.
חשוב לוודא שמערכת ההדמיה מתפקדת קרוב למגבלת רעשי הצילום, מה שמבטיח כי האלקטרוניקה לזיהוי ורכישת נתונים תורמת רעש זניח לתמונה לאחר ה-PMTs. חוסר הוודאות במספר הפוטונים שזוהו מוגבל ביסודו על ידי רעש צילום פוטונים. ביצועים מוגבלים של רעשי צילום ניתנים להשגה במיקרוסקופ מולטי-פוטון טיפוסי באמצעות פוטו-דטקטור בעל רווח גבוה (לדוגמה, PMT). רעש צילום פוטון עוקב אחר התפלגות סטטיסטית של פואסון, לפיה סטיית התקן של ההתפלגות שווה לשורש הריבועי של ממוצע ההתפלגות. כדי לאמת את הביצועים המוגבלים של רעש הצילום, בצע את שלב 1.14 במקטע הפרוטוקול.
כדי למנוע הנחתת אור על-ידי H2O, שימוש ב-D2O לטבילה מועיל, במיוחד עבור עירור של כ-1,700 ננומטר. כאשר נעשה שימוש ב- D2O, חיוני לרענן את D2O כל ~ 10 דקות או להשתמש בנפח גדול של D2O כדי למנוע חילופי D2O/ H 2O במהלך ההדמיה. ניתן גם לאטום את ה-D2O מסביבת החדר3. אם עדשת מטרה למרחק עבודה ארוך (WD) (למשל, WD ב-4 מ"מ ומעלה) משמשת להדמיה, עובי נוזל הטבילה יכול לעלות על 2-3 מ"מ. העובי המוגבר הופך את ספיגת H2O לבלתי זניחה אפילו ב-~1,300 ננומטר21. לכן, D2O עשוי להיות נחוץ אפילו עבור 1,300 ננומטר 3PM בעת שימוש בעדשה אובייקטיבית WD ארוכה.
מכיוון שעוצמת הפלואורסצנציה של 3P תלויה בקובייה של אנרגיית פולס העירור במוקד (Eq. (1)), הגדרת כוח הלייזר המתאים חשובה במיוחד להשגת אותות פלואורסצנטיים נאותים של 3P תוך הימנעות מנזק תרמי ולא ליניארי ברקמות חיות. הספק הלייזר הממוצע צריך להישמר מתחת לסף הנזק התרמי. במוח העכבר, לדוגמה, כדי למנוע נזק לרקמות תרמיות, יש לשמור את ההספק הממוצע על פני המוח של העכבר במהירות של כ-100 mW או מתחתיו לצורך עירור של כ-1,300 ננומטר בעומק של 1 מ"מ ועם שדה ראייה (FOV) של 230 μm x 230 μm21. באופן דומה, ההספק הממוצע של ~1,700 ננומטר צריך להישמר ב~ ~ 50 mW או מתחתיו בעומק של ~ 1 מ"מ ו- FOV של ~ 230 μm x 230 μm (נתונים שלא פורסמו). יתר על כן, כדי למנוע רוויית עירור ונזק לא ליניארי פוטנציאלי, יש לשמור על אנרגיית דופק העירור ב-2 nJ ו-3 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg"><img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">nJ עבור כ-1,300 ננומטר ו-~1,700 ננומטר, בהתאמה30.
עקב ספיגת אור ופיזור ברקמות, אנרגיית הדופק במוקד מוחלשת ל-1/e (~37%) לאחר חדירת רקמות ב-1 EAL. ה-EAL משתנה ברקמות שונות ועם אורכי הגל של העירור, למשל, בניאוקורטקס של מוח העכבר, ה-EAL הוא ~300 מיקרומטר ו~400 מיקרומטר ב~1,300 ננומטר ו~1,700 ננומטר, בהתאמה 3,29 (איור 5). לכן, כדי לשמור על אותה אנרגיית דופק בפוקוס (למשל, 1 nJ/pulse) בעומק של n EALs, יש להכפיל את אנרגיית הדופק על פני השטח ב-1 nJ × en. להדמיה מהירה של דינמיקה מבנית ותפקודית, לייזר עירור עם קצב חזרות גבוה (ב-1 מגה-הרץ ומעלה) רצוי כדי להשיג קצב פריימים גבוהשל 5,6,7,10. עם זאת, דרישת אנרגיית הדופק ומגבלת כוח הלייזר הממוצעת מגבילות את קצב החזרה הרלוונטי.
לדוגמה, כאשר אנו מדמיינים אזור עמוק למדי ב-4 EALs (כלומר, כ-1.2 מ"מ בקליפת המוח של העכבר עם עירור של 1,300 ננומטר), נדרש כ-55 nJ/pulse על פני השטח כדי לשמור על 1 nJ/pulse בפוקוס. כאשר מגבלת ההספק הממוצעת היא 100 mW, אנו יכולים להחיל קצב חזרת לייזר של ~2 MHz. עם זאת, כדי לצלם תמונה עמוקה יותר בעומק של 7 EALs, נדרש ~1,100 nJ/pulse במשטח כדי לשמור על 1 nJ/pulse בפוקוס. בהנחה שההספק הממוצע המרבי הוא 100 mW כדי למנוע נזק תרמי, יש להפחית את קצב חזרת הלייזר ל-0.1 MHz כדי להשיג 1,100 nJ/pulse על פני השטח. טבלה 1 מסכמת תנאי הדמיה אופייניים בקליפת המוח של העכבר. שים לב שמעמקי ההדמיה בטבלה 1 מניחים שה-EAL אחיד בקליפת המוח של העכבר כולו.
יתר על כן, בגלל מגבלת כוח הלייזר ברקמות עמוקות בשעה 15:00, קיימת פשרה בין קצב הפריימים לגודל פיקסל התמונה, החשובה במיוחד להדמיה פונקציונלית כגון הדמיית סידן. קצב חזרת הלייזר המרבי הזמין נקבע בכל עומק בהתבסס על אנרגיית הפולס הנדרשת במיקוד ועל הספק הלייזר הממוצע הרלוונטי כפי שפורט לעיל, למשל, 2 מגה-הרץ בעומק שווה ערך לכ-4 EALs עם עירור של 1,300 ננומטר. באופן כללי, הדמיה דורשת לפחות פעימה אחת לכל פיקסל. בהתאם לכך, זמן השהייה המינימלי הזמין של פיקסלים נקבע על ידי קצב החזרה בלייזר, למשל, 0.5 μs/pixel עם עירור של 2 מגה-הרץ.
כדי לשמור על הרזולוציה המרחבית הגבוהה (~1 μm לרוחב) בתמונות 3P, זה אידיאלי להגדיר פיקסל אחד לאזור של ~1 μm2, למשל, 256 x 256 פיקסלים עבור FOV של 250 x 250 μm2. לפיכך, כדי לבצע הדמיה מהירה עם FOV גדול במידה ניכרת (לדוגמה, 250 x 250 מיקרומטר2 עם 256 x 256 פיקסלים), 0.5 מגה-הרץ, 1 מגה-הרץ ו-2 מגה-הרץ קצבי חזרות דופק מספקים קצבי פריימים מרביים תיאורטיים של ~7.6, ~15 ו~30 פריימים לשנייה, בהתאמה. כמו כן, האופטימיזציה של קצב חזרת הלייזר היא חיונית, בהתאם לעומק המטרה, מהירות הסריקה וה- FOV, כדי ליישם אנרגיית פולס נאותה מתחת לסף הנזק התרמי. כדי להגביר את מהירות ההדמיה, ניתן להשתמש במקור עירור אדפטיבי כדי לרכז את כל פעימות העירור על הנוירונים (כלומר, אזורי עניין) על ידי העברת פולסים בלייזר לפי דרישה לנוירונים31.
15:00 הוא יתרון בהשוואה לשעה 14:00 בהדמיה עמוקה בתוך רקמות חיות ובאמצעות אמצעי פיזור גבוהים כגון גולגולת, עצמות ושכבת החומר הלבן (כלומר, הקפסולה החיצונית) של מוח העכבר. ה-EAL הארוך יותר והעירור הלא-ליניארי מסדר גבוה יותר של 3PE מועילים להדמיית רקמות עמוקות. לדוגמה, כדי לצלם GCaMP6 בקליפת המוח של העכבר, אות פלואורסצנטי 2P עם עירור של 920 ננומטר גבוה יותר מאות פלואורסצנטי 3P עם עירור של 1,300 ננומטר באזורים רדודים ב-690 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">מיקרומטר (כלומר, ~2.3 EALs ב-1,300 ננומטר)21. עם זאת, בשל ה-EAL הארוך יותר ב-1,300 ננומטר בהשוואה ל-920 ננומטר, 3PE נותן פלואורסצנציה חזקה יותר מאשר עירור 2P (2PE) בעומק של כ-690 מיקרומטר ועמוק יותר21. עומק זה מוגדר כ'עומק הצלבת אותות', שבו עוצמות האות הפלואורסצנטיות של 2PE ו-3PE זהות עם אותו קצב חזרה ואותם כוחות ממוצעים מרביים מותרים21. עומק ההצלבה של האות תלוי באורכי הגל של העירור עבור 2PE ו-3PE והפלואורופור.
בפועל, עירור של 920 ננומטר מאפשר הספק לייזר ממוצע גבוה יותר מאשר עירור של 1,300 ננומטר עקב פחות ספיגת מים. עם זאת, ההספק הממוצע הגבוה יותר של 2PE ידחוף את עומק ההצלבה של האות רק ב-0.9 EALs4. בנוסף, כאשר הדגימה מסומנת בצפיפות, ל- 3PE יש את היתרון הנוסף של SBR גבוה בהרבה. לכן, עוד לפני שמגיעים לאורך ההצלבה של האות, 15:00 יכול להיות טוב יותר להדמיה מאשר 14:00. לדוגמה, כאשר מדמיינים את כלי הדם במוח העכבר, שיש להם שבר נפח (כלומר, צפיפות תיוג) של ~ 2%, 1,300 ננומטר 15:00 עם הספק עירור של 100 mW עולה על 920 ננומטר 14:00 עם הספק עירור של 200 mW בעומק של ~ 700 מיקרומטר עבור פלואורסציין.
ל-15:00 יש גם יתרון בעת הדמיה דרך שכבה דקה אך בעלת פיזור גבוה, שעלולה לעוות את פונקציית ההתפשטות הנקודתית של קרן העירור וליצור רקעמתפרק 4. לדוגמה, דרך הגולגולת השלמה של מוח העכבר, תמונות בשעה 14:00 סובלות מרקע ההדחה אפילו בעומק הרדוד של <100 מיקרומטר מפני השטח של המוח13. רקע דומה של דפוקוס נצפה בשעה 14:00 עם עירור של 1,280 ננומטר דרך החומר הלבן במוח העכבר32. לכן, כאשר רקמות מצולמות דרך שכבות עכורות, 15:00 עדיף על 14:00 להדמיה בניגודיות גבוהה ללא קשר לצפיפות הסימון.
לאחרונה דיווחנו על פנטום חרוזים וניתוח תיאורטי שהראה שמגבלת עומק ההדמיה של 15:00 היא מעל 8 EALs33; 8 EALs שקולים ל~3 מ"מ עם עירור של כ-1,700 ננומטר בקליפת המוח של העכבר. עם זאת, ללייזר הזמין כיום אין מספיק אנרגיית דופק כדי להשיג 8 EALs במוח העכבר. פיתוח נוסף של לייזרים חזקים יותר ידחוף את גבול עומק ההדמיה הנוכחי של 15:00.

במדעי החיים, טכניקות מיקרוסקופיית מולטי-פוטון (MPM), כגון 14:00 ו-15:00, היו כלים רבי עוצמה להדמיה עמוקה בתוך vivo עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה וניגודיות גבוהה ברקמות פיזור. בנוסף, שיטות אלה גורמות לפחות הלבנת תמונות בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית של פוטון אחד 1,2,3,4. 15:00 הוא יתרון להדמיית רקמות עמוקות יותר בהשוואה לשעה 14:00 בשל שתי תכונות עיקריות: (i) תעסוקה של עירור באורך גל ארוך יותר (~1,300 ננומטר או ~1,700 ננומטר) מפחיתה את פיזור הרקמות, ו-(ii) תהליך העירור מסדר גבוה יותר (כלומר, אות פלואורסצנטי תלוי בקוביית עוצמת העירור בשעה 15:00 במקום בריבוע של עוצמת העירור בשעה 14:00) המדכא את פלואורסצנס הרקע הלא רצוי3 . כתוצאה מכך, 15:00 מאפשר הדמיה עם ניגודיות גבוהה באזורים עמוקים יותר ברקמות חיות כגון ההיפוקמפוס במוח עכבר בוגר שלם 3,5,6,7,8,9,10,11 וכל המוח הקדמי של דגי זברה בוגרים12, כולל Ca 2+ הקלטת פעילות ותצפיות צבעוניות. יתר על כן, תמונות עם ניגודיות גבוהה התקבלו בשעה 15:00 באמצעות גולגולות שלמות של דגי עכבר וזברה בוגרים12,13.
כיום, מקורות לייזר עירור המתאימים לעירור 3P (3PE) ב~1,300 וכ-1,700 ננומטר זמינים באופן מסחרי. מכיוון שמערכת סריקת הלייזר זהה במהותה עבור 14:00 ו-15:00, המרת מערך 2P קיים למערך 3P אפשרית במעבדות ביולוגיה עם התקנת לייזר זמין מסחרית עבור 3PE. אות הפלואורסצנציה 3P תלוי בכוח הלייזר, משך הפולס, קצב החזרה בלייזר ומפתח הצמצם המספרי (NA) של העדשה האובייקטיבית. בהנחה שמיקוד מוגבל עקיפה (כלומר, הצמצם האחורי של העדשה האובייקטיבית מתמלא יתר על המידה על ידי קרן העירור), Eq (1) מתאר את שטף הפוטונים הפלואורסצנטי הממוצע בזמן מנפח המוקד הנובע מ-3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
כאשר f הוא קצב החזרה בלייזר, τ הוא משך פולס הלייזר (רוחב מלא בחצי מקסימום), φ הוא יעילות איסוף המערכת, η היא היעילות הקוונטית הפלואורסצנטית, σ3 הוא חתך הקליטה של 3P, C הוא ריכוז הפלואורופור, n0 הוא המדד הרפלקטיבי של מדיום הדגימה (למשל, מים), λ הוא אורך הגל של העירור בריק, NA הוא הצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית, 3 הוא קבוע האינטגרציה המרחבית של נפח המוקד, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> הוא שטף פוטון העירור הממוצע בזמן (פוטונים/ים) תחת העדשה האובייקטיבית, z הוא עומק התמונה, ו- EAL הוא אורך ההנחתה האפקטיבי14. כאן הנחנו כי ה- EAL (בדרך כלל > 100 מיקרומטר) גדול בהרבה מהרזולוציה הצירית של המיקרוסקופ (בדרך כלל < 10 מיקרומטר). תחת קירוב פראקסיאלי,3 שווה ל- 28.114. gp(3) הוא הקוהרנטיות הטמפורליתמסדר 3 של מקור העירור, ו-g p(3) הוא 0.41 ו-0.51 עבור פולסים היפרבוליים-סקאנט-בריבוע ופולסים של גאוס, בהתאמה. ניתן להעריך את יעילות האיסוף φ על ידי התחשבות באיסוף הפלואורסצנטי על ידי העדשה האובייקטיבית, העברת העדשה האובייקטיבית, הרפלקטיביות של המראה הדיכרואית, העברת המסננים ויעילות הגילוי של הגלאי (למשל, שפופרת פוטומולטיפלייר, או PMT). מכיוון שעוצמת הפלואורסצנציה של 3P תלויה מאוד בפרמטרים שונים, נדרשת אופטימיזציה של הגדרת 3P כדי למקסם את אותות הפלואורסצנציה של 3P.
פרוטוקול זה ממחיש את תהליך האופטימיזציה של מערך 3P טיפוסי, שיהיה שימושי במיוחד עבור מעבדות ביולוגיה שיש להן הגדרת 2P ומתכננות להרחיב את יכולתן להדמיית 3P או לשמור על מערך ה-3P המסחרי שלהן בביצועים אופטימליים. מאמר וידאו זה מדגים גם הדמיית 3P של רקמות עמוקות במוחות של בעלי חיים חיים. החלק הראשון עוסק באופטימיזציה של הגדרת 3P טיפוסית עם מקור לייזר זמין מסחרית ומיקרוסקופ מולטיפוטונים. החלק השני והשלישי מתארים את הכנת דגי הזברה והעכבר, בהתאמה, לשעה 15:00 של מבנים ופעילויות עצביות. ניתוח הגולגולת של העכבר דווח בעבר גם בניירות פרוטוקול15,16,17. החלק הרביעי מדגים הדמיה תוך-ורידית של 3P במוחות של דגי זברה ועכברים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

טכניקות מיקרוסקופיית מולטי-פוטון, כגון מיקרוסקופיית שני פוטונים (14:00) ומיקרוסקופיית שלושה פוטונים (15:00), הן כלים רבי עוצמה להדמיית in vivo של רקמות עמוקות ברזולוציה תת-תאית. לשעה 15:00 יש שני יתרונות עיקריים להדמיית רקמות עמוקות במהלך 14:00 שנמצאת בשימוש נרחב במעבדות ביולוגיה: (i) אורך הנחתה ארוך יותר ברקמות פיזור על ידי שימוש בלייזר עירור של כ-1,300 ננומטר או ~1,700 ננומטר; (ii) פחות יצירת פלואורסצנציה ברקע עקב עירור לא ליניארי מסדר גבוה יותר. כתוצאה מכך, השעה 15:00 מאפשרת הדמיה מבנית ותפקודית בעלת ניגודיות גבוהה בעומק רקמות מתפזרות כגון מוח עכבר שלם משכבות קליפת המוח ועד להיפוקמפוס וכל המוח הקדמי של דגי זברה בוגרים.
כיום, מקורות לייזר המתאימים לשעה 15:00 זמינים באופן מסחרי, ומאפשרים המרה של מערכת הדמיה קיימת של שני פוטונים (2P) למערכת תלת-פוטונים (3P). בנוסף, קיימים מספר מיקרוסקופים מסחריים של 3P, מה שהופך את הטכניקה הזו לזמינה למעבדות מחקר ביולוגיות. מאמר זה מראה את האופטימיזציה של הגדרה טיפוסית של 15:00, במיוחד התמקדות בקבוצות ביולוגיה שכבר יש להן הגדרת 2P, ומדגים הדמיה תלת-ממדית תוך-ורידית במוחות של עכברים ושל דגי זברה בוגרים שלמים. פרוטוקול זה מכסה את ההליך הניסיוני המלא של הדמיית 3P, כולל יישור מיקרוסקופ, בדיקה מוקדמת של כ-1,300 ו-1,700 ננומטר פולסים של לייזר, הכנת בעלי חיים והדמיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של 3P עמוק במוחות של דגי זברה ועכברים בוגרים.

ההשלמה המוצלחת של פרוטוקול זה תביא למיקרוסקופ מיושר כראוי עם פרמטרי אור אופטימליים (למשל, משך פולס, NA) ותכשירים לבעלי חיים המתאימים ל-in vivo 15:00. מערך ה-3P הזמין מסחרית כולל מראות ועדשות מתאימות הן עבור ~ 1,300 ננומטר והן עבור ~ 1,700 ננומטר; לכן, אין צורך בשינוי באופטיקה כאשר אורך הגל של העירור משתנה בין 1,300 ננומטר ל-1,700 ננומטר. אם לעדשות במערך 3P אין ציפוי מתאים ל-1,300 ו-1,700 ננומטר, יש להחליף אותן באלה המתאימות כדי להפחית את אובדן כוח הלייזר. עם 15:00 הממוטב והכנת בעלי חיים נכונה, ניתן לאסוף תמונות פלואורסצנטיות ו-THG in vivo עם ניגודיות גבוהה עמוק בתוך המוח.
איור 3 מציג תמונות מייצגות של 3P של דגי זברה בוגרים שלמים. הדמיה ברזולוציה גבוהה, לא פולשנית ועמוקה של נוירונים המסומנים גנטית במוח דגי הזברה הבוגרים מושגת באמצעות 15:00. למרות שהדמיה באזור הטלנספלון דווחה במוח דגי הזברה הבוגרים באמצעות14:00 24,25,26,27, 15:00 מאפשרת גישה לכל הטלנספלון ולאזורים מאתגרים יותר או בלתי אפשריים לצפייה באמצעות טכניקות אחרות. ניתן לראות את התפלגות שכבות התאים בטקטום האופטי ובמוח הקטן באיור 3C. בסשן הדמיה מוצלח, העצם נראית בתעלת ה-THG ובנוירונים הנראים בתעלת הפלואורסצנציה. להדמיית דגי זברה בוגרים, תכונת המצלמה של המיקרוסקופ שימשה לאיתור הדגים (איור 3A). שלב זה אינו הכרחי להדמיית מוח של עכברים מכיוון שחלון הזכוכית גדול מספיק כדי להפוך את המוח לנגיש בקלות. תמונות מבניות ברזולוציה גבוהה של מוח דגי זברה בוגרים התקבלו באמצעות המערכת שתוארה בסעיפים הקודמים. הגולגולת נראית בתעלת ה-THG (איור 3B), שעוזרת לנווט במוח ולמצוא את המשטח העליון. כפי שנצפה באיור 3C, תאי עצב ניתנים להבחנה עם יחס אות-לרקע גבוה (SBR) עמוק במוח הבוגר. הרקמה שמעל המוח נראית בתעלת הפלואורסצנציה עקב אוטופלואורסצנציה.
איור 4 מראה תמונות צבעוניות של 3P של תאי עצב המסומנים ב-GCaMP6s (ירוק) וכלי דם המסומנים באדום טקסס (אדום) יחד עם אותות THG (כחול) במוח העכבר הבוגר עם עירור של 1,340 ננומטר10. התמונות משוחזרות מעבודות קודמות10. באיור 4, אנרגיית הפולס במוקד נשמרה על ~1.5 nJ בכל העומק כדי לקבל מספיק אותות פלואורסצנטיים ו-THG, והספק הלייזר הממוצע המרבי היה ~70 mW. משך הדופק הותאם ל~60 fs, וה-NA האפקטיבי היה ~0.8. עם אופטימיזציה של ההתקנה של 15:00, תמונות עם ניגודיות גבוהה התקבלו בהצלחה עד 1.2 מ"מ מפני השטח של המוח, באזור ההיפוקמפוס CA1 (איור 4A,B). איור 4C,D מראה עקבות פעילות Ca2+ של נוירונים המסומנים ב-GCaMP6s בעומק של 750 מיקרומטר למשך 10 דקות של הפעלת הקלטה, מה שמראה נאמנות הקלטה גבוהה.
אם לייזר העירור אינו מיושר כהלכה, ניתן להבחין באי-אחידות בבהירות האות על פני שדה הראייה. בנוסף, אם הפרמטרים של הלייזר, כגון משך הדופק, אנרגיית דופק העירור במיקוד וה-NA היעיל, אינם ממוטבים, תמונת ה-THG מגולגולת הדג או מחלון הקרניוטומיה של מוח העכבר לא תהיה גלויה ו/או תדרוש אנרגיית דופק עירור גבוהה (למשל, >2 nJ/pulse במוקד). לפיכך, אותות ה-THG על פני השטח של המוח יכולים לשמש כאינדיקטור להגדרה אופטימלית של 15:00 לפני תחילת הדמיית רקמות עמוקות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> איור 1: איור סכמטי של התקנה של 15:00. אורך הגל של לייזר העירור מוגדר על ~1,300 ננומטר או ~1,700 ננומטר, פלט מיציאת האידלר של ה- NOPA. מדחס זוג המנסרות ומדחס לוחית Si משמשים ללייזר של ~ 1,300 ננומטר ו ~ 1,700 ננומטר, בהתאמה, כדי ליצור מראש את פולס הלייזר של העירור. ניתן להחליף את קרני הלייזר של ~ 1,300 ננומטר ו ~ 1,700 ננומטר עם מראות סנפיר. יציאת האות של ה- NOPA משמשת להשגת האות המפעיל. חצי לוחית גל ו- PBS משמשים לשליטה בכוח העירור. הפלואורסצנציה וה-THG מזוהים על ידי PMTs של GaAsP. שילובים מתאימים של מראות דיכרואיות ומסנני פס פס משמשים להפרדת אותות הפלואורסצנציה וה-THG. קיצורים: 15:00 = מיקרוסקופיית שלושה פוטונים; NOPA = מגבר פרמטרי אופטי לא-קולינארי; PBS = מפצל קרן מקטב; THG = דור הרמוני שלישי; DAQ = רכישת נתונים; PMT = שפופרת פוטומולטיפלייר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> איור 2: צילומי מסך מייצגים להדמיה תוך-ורידית בדגים (סעיף פרוטוקול 4.1). (A) תצוגת מצב מצלמה של תוכנת רכישת התמונה עם עדשה אובייקטיבית 4x במקום. התכונות העיקריות של התוכנה מתוארות וממוספרות באופן הבא: 1. מצב הדמיה של תוכנת רכישת התמונה. אפשרויות המצב הן מצלמה, מולטיפוטון ומולטיפוטון GG. להדמיית אור לבן עם מצלמת CCD, נבחר מצב המצלמה . 2. לחיצה על כפתור Live מפעילה את המצלמה (או PMTs אם באפשרויות מרובות פוטון), וניתן לצפות בתצוגה בזמן אמת של המיקרוסקופ. 3. בכרטיסייה 'הגדרת לכידה ', מוגדרים פרמטרי ההדמיה הרצויים (הספק, מיקום, עומק). 4. בכרטיסייה 'לכידה ', מוקצה מיקום תיקיה לשמירת התמונות. ניתן להתחיל את ההדמיה בכרטיסייה זו. הגדרת בקרת Z שולטת בעומק ההדמיה על ידי הזזת מנוע שלב z. 6. תמונה מייצגת של ראש דג זברה. הצד הרוסטרלי של הראש נמצא בצד שמאל. (B) תצוגה מייצגת של מצב מצלמה עם עדשה אובייקטיבית פי 25. (C) תצוגה מייצגת של מצב Multiphoton GG המכיל את תמונת ה- THG של התמונה הנראית ב- (B). קיצורים: CCD = התקן מצומד לחיוב; PMT = שפופרת פוטומולטיפלייר; THG = דור הרמוני שלישי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> איור 3: תמונות מייצגות של מוח דגי הזברה הבוגרים שנרכשו באמצעות תוכנת רכישת התמונה. (A) תמונת מצב מצלמה של ראש דגי זברה בוגרים שנרכשה עם עדשה אובייקטיבית פי 4. החלק העליון של התמונה הוא הכיוון הרוסטרלי. אונות ה-OT וה-CB מתוארות. (B) תמונה מייצגת שנרכשה במצב Multiphoton GG עם עדשה אובייקטיבית של 25x המכילה את תמונת ה-THG של (A). (C) תמונות פלואורסצנטיות של מוח דגי זברה בוגרים בצומת של המוח הקטן והטקטום האופטי שבו GFP מתבטא בציטופלסמה של נוירונים בעומקים שונים. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: OT = טקטום אופטי; CB = המוח הקטן; THG = דור הרמוני שלישי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> איור 4: 3 PM צבעוניים של תאי עצב המסומנים ב-GCaMP 6 s (ירוק), כלי דם המסומנים באדום טקסס (אדום) ודור שלישי הרמוני (כחול) על עירור של 1,340 ננומטר במוח העכבר. עוצמת הלייזר הייתה מגוונת בהתאם לעומק ההדמיה כדי לשמור על אנרגיית פולס של כ-1.5 nJ במוקד. ההספק הממוצע המרבי תחת היעד היה 70 mW. (B) תמונות דו-ממדיות נבחרות בעומקי הדמיה שונים. (C) אתר הקלטת פעילות במהירות של 750 מיקרומטר מתחת לדורה עם שדה ראייה של 270 x 270 מיקרומטר (256 x 256 פיקסלים). (D) עקבות פעילות מוחית ספונטנית שנרשמו בעכבר ער מהנוירונים המסומנים ב-(C). קצב הפריימים היה 8.3 הרץ, עם זמן השהייה של פיקסלים של 0.51 מיקרון. קצב החזרה בלייזר היה 2 מגה-הרץ, וההספק הממוצע תחת העדשה האובייקטיבית היה 56 mW. כל עקבה נורמלה לקו הבסיס שלה וסוננה במעבר נמוך באמצעות חלון המינג של קבוע זמן של 0.72 שניות. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. דמות זו ומקרא הדמות משוחזרים מ-10. קיצור: 15:00 = מיקרוסקופיה של שלושה פוטונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> איור 5: אורך הנחתה יעיל בניאוקורטקס של מוח העכבר. EAL (קו מג'נטה) מחושב מפיזור הרקמה (קו אדום) וספיגת המים ברקמה (קו כחול), בהנחה של 75% הרכב מים. הכוכבים השחורים מצביעים על נתונים ניסיוניים מדווחים של EAL בניאוקורטקס של מוח העכבר 3,21,28,29. שים לב כי EAL משתנה ברקמות שונות. קיצור: EAL = אורך הנחתה יעיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>אורך גל של עירור (נד)</td>
			<td>מי טבילה</td>
			<td>הספק לייזר מרבי (מ"ו)</td>
			<td>אנרגיית דופק מקסימלית במיקוד* (אנ')</td>
			<td>EAL טיפוסי בקליפת המוח של העכבר (מיקרומטר)</td>
			<td>עומק הדמיה בקליפת המוח של העכבר** (מ"מ)</td>
			<td>אנרגיית דופק תחת המטרה*** (אנ')</td>
			<td>שיעור חזרות לייזר מרבי**** (מגה-הרץ)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O או D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">כ-300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">ד2א</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">כ-400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: תנאי עירור אופייניים של 3 P להדמיית קליפת המוח של העכבר. *עם מטרה גבוהה של NA (~1.0), רוחב פולס של כ-50 fs, ופלואורופורים טיפוסיים כגון חלבונים פלואורסצנטיים (למשל, GFP ו-RFP). ** מתוך הנחה שה-EAL אחיד בכל קליפת המוח. כדי להשיג ~ 1 nJ / דופק במוקד, מחושב מתוך ה- EAL ועומק ההדמיה. מחושב מאנרגיית הדופק תחת המטרה ועוצמת הלייזר המתיר המרבית. קיצורים: 3P = שלושה פוטונים; NA = מפתח צמצם מספרי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; EAL = אורך הנחתה יעיל.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

מיקרוסקופיה של שלושה פוטונים מאפשרת הדמיה פלואורסצנטית בעלת ניגודיות גבוהה בעומק רקמות ביולוגיות חיות, כגון מוחות של עכברים ודגי זברה, ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תלת-פוטונית של שלושה פוטונים ברקמות עמוקות במוח של עכברים ושל דגי זברה שלמים

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

הפרוטוקול ממחיש כיצד לבצע מיקרוסקופיה של שלושה פוטונים במוחם של עכברים ובדגי זברה בוגרים. שתי מערכות מודל חשובות במדעי החיים. מיקרוסקופיה תלת-פוטונית באורך גל ארוך מאפשרת הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה של רקמות או איברים שלמים בעומקים שאינם נגישים על ידי מיקרוסקופיה דו-פוטונית.טכניקה זו יכולה לעזור לנו להבין את המנגנונים הבסיסיים של מחלות נוירולוגיות, כגון אלצהיימר ואוטיזם, שם חסרה הבנה מלאה של האופן שבו המחלה משפיעה על המוח. המדגימה את הליך הדמיית המוח של העכבר תהיה קבאק צ'ו, חוקרת הפוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו והדגימה את הליך ההדמיה במוח של דגי הזברה תהיה קריסטין קולקמן, עמיתת מחקר ממעבדת המחקר של פטצ'ו. כדי להתחיל, הפעל את הלייזר והגדר את אורך הגל המרכזי של פלט האידלר של המגבר הפרמטרי האופטי הלא-קולינארי ב- 1, 300 או 1, 700 ננומטר, ולאחר מכן מקם מדחסי דופק על נתיב האור כדי לצייץ מראש את לייזר הפמטו-שניות ולמטב את משך הפולס להדמיה של שלושה פוטונים.הגדר את הזווית בין לוח הסיליקון לנתיב הלייזר בזווית של ברוסטר כדי למקסם את העברת הלייזר, ולאחר מכן סובב את לוח הסיליקון כדי להשיג את הזווית של ברוסטר על ידי מזעור ההשתקפות. לאחר מכן, הניחו מראות סנפיר כדי לעבור בנוחות בין קווי הקרן של 1, 300 ו-1, 700 ננומטר. מניחים חצי לוחית גל המותקנת על שלב סיבוב ומפצל קרן מקטב כדי לשלוט בעוצמת הלייזר, ואז מניחים חוסם קרן בנתיב ההשתקפות של מפצל הקרן.מכינים צלחת פטרי עם 0.5 ס"מ של 2% אגר נקודת התכה גבוהה. לאחר שהאגר התקרר והתמצק, חתכו חור מלבני באגר ארוך יותר ומעט רחב יותר מהדגים. באמצעות שעווה, הצמידו צינורות דקים לצלחת הפטרי עם קצה אחד במלבן וצינור בקוטר גדול יותר לקצה צלחת הפטרי.לאחר מכן, מרדימים את הדג על ידי הנחתו בתמיסת טריקאין של 0.2 מיליגרם למיליליטר, ואז מניחים את הדג המרדים על צדו על ספוג רטוב, ולאחר מכן משתמשים במיקרו-מזרק, מזריקים באופן רטרו-מסלולי 3 מיקרוליטרים של פנקורוניום ברומיד כדי לשתק את הדג ומניחים אותו לזמן קצר בתמיסה של האנק כדי להבטיח שהוא משותק לחלוטין. לאחר מכן, מניחים את הדגים בצד הגב למעלה בצלחת הפטרי עם הראש לכיוון הצינורות, ואז משתמשים במלקחיים, פותחים בעדינות את פיו של הדג ומחליקים את הצינורות לתוך הפה. החליקו בעדינות את הדגים לכיוון הצינורות כך שהצינורות יהיו בחלק האחורי של פיו של הדג.במהירות, אך בעדינות, מייבשים את האגר סביב הדגים ומסירים את המים על גבי הדגים. טובלים חתיכה קטנה של רקמת מעבדה בדבק מעבדה ומניחים את הרקמה על האגר משני צידי הדג ועל גבו של הדג אל הזימים. לאחר מכן, מרדימים את עורו של הדג על ידי הנחת טיפה קטנה של בופיוואקאין ישירות על פני השטח של הראש, ואז מביאים את צלחת הפטרי עם הדג למיקרוסקופ.מלאו את המנה במי מתקן דגים והתחברו לצינורות למשאבת מים כדי לשאוב מי מערכת לתוך פיו של הדג. יש לוודא שהמים מחומצנים עם מבעבע ומתחממים ל-30 מעלות צלזיוס עם מחמם אקווריום. לצורך ההדמיה, הניחו מטרת הגדלה נמוכה על המיקרוסקופ בעל שלושת הפוטונים, ואז הניחו את צלחת הפטרי המכילה את הדגים והצינורות מתחת למיקרוסקופ והשתמשו במקור אור LED כדי להאיר את צלחת הפטרי.מתוך תוכנת רכישת התמונה, פתח את מצב המצלמה, לחץ על Live, בחר ערוץ A בצד ימין של המסך והתאם את הגדרות ההיסטוגרמה כדי לראות את התמונה בבירור. לאחר הגדרת המנוע על בקר המנוע לבסיס, הנמיך את המטרה עד שהדג נראה לעין. הניחו את מרכז ראש הדג במרכז שדה הראייה, ואז הזיזו את המטרה למעלה והרחקו מראשו של הדג.החלף את העדשה האובייקטיבית בהגדלה נמוכה בעדשה האובייקטיבית בעלת הצמצם המספרי הגבוה להדמיית שלושה פוטונים, ולאחר מכן הזז אותה קרוב לעבר ראשו של הדג. הגדר את ערכי הציר של כל המנועים לאפס. לאט לאט להוריד את העדשה האובייקטיבית, להבטיח כי המטרה לא מגע עם הראש פיזית.בתוכנת מצלמת CCD, הפסק להזיז את המטרה כאשר החלק העליון של הראש גלוי והגדר את מיקומי X, Y ו- Z לאפס. כבה את מקור אור ה-LED וסגור את הווילון הכהה סביב המערכת, ולאחר מכן הגדר את תוכנת רכישת ההדמיה למצב GG מרובה-פוטון להדמיית שלושה פוטונים והגדר את העוצמה מתחת לעדשה האובייקטיבית לפחות ממילי-וואט אחד. לחץ על כפתור Live בתוכנת רכישת התמונות.פתח ערוצי PMT והתאם את רווח ה- PMT ואת רמת הרקע לפי הצורך. התקדמו באיטיות במעלה העדשה האובייקטיבית כדי לאתר את פני השטח של הראש על ידי ניטור תעלת ה-THG מכלי הדם הגדולים ומשטח הזכוכית של החלון. לאחר הזזת העדשה האובייקטיבית קרוב לחלון, החל מים בין המטרה לחלון הגולגולת, ולאחר מכן הגדר את ערכי הציר של כל המנועים לאפס.לחץ על כפתור Live בתוכנת רכישת התמונות. פתח ערוצי PMT והתאם את רווח ה- PMT ואת רמת הרקע לפי הצורך, ואז התקדם באיטיות במעלה העדשה האובייקטיבית כדי לאתר את פני השטח של החלקת הכיסוי על ידי ניטור תעלת ה- THG מכלי הדם הגדולים ומשטח זכוכית החלון. התאם את כיוון החלון במידת הצורך, ואז אפס את המנועים כדי להגדיר את פני השטח של המוח.בצע הדמיה והתאם את רמת ההספק בהתאם לעומק ההדמיה. הדמיה ברזולוציה גבוהה, לא פולשנית ועמוקה של תאי עצב בעלי תווית גנטית במוח של דגי זברה בוגרים מושגת באמצעות מיקרוסקופיה של שלושה פוטונים. ניתן לראות גם את התפלגות שכבות התאים בטקטום האופטי ובמוח הקטן.תכונת המצלמה של המיקרוסקופ שימשה לאיתור הדגים. הגולגולת נראית בתעלת THG, המסייעת לנווט במוח ולמצוא את המשטח העליון. ניתן להבחין בין תאי עצב עם יחס אות לרקע גבוה בעומק המוח הבוגר.תמונות צבעוניות של שלושה פוטונים של נוירונים המסומנים ב-GCaMP6s וכלי דם המסומנים באדום טקסס יחד עם אותות THG במוח העכבר הבוגר מוצגים כאן. עם אופטימיזציה של ההתקנה, תמונות עם ניגודיות גבוהה התקבלו בהצלחה עד 1.2 מילימטרים מפני השטח של המוח באזור ההיפוקמפוס CA1. עקבות פעילות סידן של נוירונים המסומנים על-ידי GCaMP6s בעומק של 750 מיקרומטרים לצורך סשן הקלטה של 10 דקות הראו נאמנות הקלטה גבוהה.הגדרה זו יכולה לעזור לדמיין את הפעילות העצבית כדי להבין את תפקוד המוח. ניתן להשתמש בו גם כדי לעקוב אחר תנועת התאים בתוך הרקמה הביולוגית כדי להבין מערכות ביולוגיות שונות. בנוסף, ניתן למדוד את מהירות זרימת הדם גם כדי לעקוב אחר בריאות החיה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

ב Vivo הדמיה של התחבורה נוזל שדרתי דרך הגולגולת העכבר ללא שינוי באמצעות זריחה מאקרוסקופיה

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...