Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub e NIH 1U01NS103516.

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Questo protocollo spiega le procedure passo-passo per l'impostazione dell'imaging 3P con un microscopio commerciale e una sorgente laser. Rispetto alle 14:00, le 15:00 hanno un vantaggio nelle applicazioni che richiedono l'accesso ottico nelle regioni più profonde come nell'ippocampo cerebrale del topo. Sebbene 3PM sia utilizzato principalmente nelle neuroscienze, 3PM può essere potenzialmente applicato in altri tessuti come linfonodi, ossa e tumori per l'osservazione dei tessuti profondi.
È importante verificare che il sistema di imaging funzioni vicino al limite di rumore di ripresa, il che garantisce che l'elettronica di rilevamento e acquisizione dati contribuisca con un rumore trascurabile all'immagine dopo i PMT. L'incertezza nel numero di fotoni rilevati è fondamentalmente limitata dal rumore di ripresa dei fotoni. Le prestazioni limitate del rumore di ripresa possono essere ottenute in un tipico microscopio multifotone utilizzando un fotorivelatore ad alto guadagno (ad esempio, un PMT). Il rumore di ripresa fotonica segue una distribuzione statistica di Poisson, in cui la deviazione standard della distribuzione è uguale alla radice quadrata della media della distribuzione. Per verificare le prestazioni limitate del rumore di tiro, seguire il passaggio 1.14 nella sezione protocollo.
Per evitare l'attenuazione della luce di H2O, è utile utilizzare D2O per l'immersione, in particolare per l'eccitazione di ~ 1.700 nm. Quando si utilizza D2O, è essenziale aggiornare D2O ogni ~ 10 minuti o utilizzare un grande volume di D2O per evitare lo scambio D2O / H2O durante l'imaging. Si può anche sigillare il D2O dall'ambiente della stanza3. Se per l'imaging viene utilizzato un obiettivo a lunga distanza di lavoro (WD) (ad esempio, WD a 4 mm o più), lo spessore del liquido di immersione può superare i 2-3 mm. L'aumento dello spessore rende l'assorbimento di H2O non trascurabile anche a ~1.300 nm21. Pertanto, D2O può essere necessario anche per 1.300 nm 3PM quando si utilizza un obiettivo WD lungo.
Poiché l'intensità di fluorescenza 3P dipende dal cubo dell'energia dell'impulso di eccitazione al fuoco (Eq. (1)), l'impostazione della potenza laser appropriata è particolarmente importante per ottenere adeguati segnali di fluorescenza 3P evitando danni termici e non lineari nei tessuti viventi. La potenza media del laser deve essere mantenuta al di sotto della soglia di danno termico. Nel cervello del topo, ad esempio, per evitare danni al tessuto termico, la potenza media sulla superficie cerebrale del topo deve essere mantenuta pari o inferiore a ~ 100 mW per un'eccitazione di ~ 1.300 nm a una profondità di 1 mm e con un campo visivo (FOV) di 230 μm x 230 μm21. Allo stesso modo, la potenza media a ~ 1.700 nm dovrebbe essere mantenuta pari o inferiore a ~ 50 mW a ~ 1 mm di profondità e un FOV di ~ 230 μm x 230 μm (dati non pubblicati). Inoltre, per evitare la saturazione dell'eccitazione e potenziali danni non lineari, l'energia dell'impulso di eccitazione deve essere mantenuta a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2 nJ e <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 nJ per ~ 1.300 nm e ~ 1.700 nm di eccitazione, rispettivamente30.
A causa dell'assorbimento della luce e della dispersione nei tessuti, l'energia dell'impulso a fuoco viene attenuata a 1/e (~ 37%) dopo la penetrazione dei tessuti da parte di 1 EAL. L'EAL varia nei diversi tessuti e con le lunghezze d'onda di eccitazione, ad esempio, nella neocorteccia del cervello del topo, l'EAL è ~ 300 μm e ~ 400 μm a ~ 1.300 nm e ~ 1.700 nm, rispettivamente 3,29 (Figura 5). Pertanto, per mantenere la stessa energia dell'impulso a fuoco (ad esempio, 1 nJ / impulso) a una profondità di n EAL, l'energia dell'impulso superficiale deve essere moltiplicata per 1 nJ × en. Per l'imaging rapido della dinamica strutturale e funzionale, è auspicabile un laser di eccitazione con un'elevata frequenza di ripetizione (a 1 MHz o superiore) per ottenere un frame rate elevato 5,6,7,10. Tuttavia, il requisito di energia dell'impulso e il limite medio di potenza del laser limitano la velocità di ripetizione applicabile.
Ad esempio, quando immaginiamo una regione moderatamente profonda a 4 EAL (cioè ~ 1,2 mm nella corteccia del topo con eccitazione di 1.300 nm), è necessario ~ 55 nJ / impulso sulla superficie per mantenere 1 nJ / impulso a fuoco. Quando il limite di potenza media è di 100 mW, possiamo applicare una frequenza di ripetizione laser di ~ 2 MHz. Tuttavia, per visualizzare immagini più profonde a una profondità di 7 EAL, sono necessari ~ 1.100 nJ / impulso in superficie per mantenere 1 nJ / impulso a fuoco. Supponendo che la potenza media massima sia di 100 mW per evitare danni termici, la frequenza di ripetizione del laser dovrebbe essere ridotta a 0,1 MHz per ottenere un impulso di 1.100 nJ / impulso in superficie. La Tabella 1 riassume le condizioni di imaging tipiche nella corteccia cerebrale del topo. Si noti che le profondità di imaging nella Tabella 1 presuppongono che l'EAL sia uniforme nell'intera corteccia del topo.
Inoltre, a causa della limitazione della potenza del laser nelle 3PM dei tessuti profondi, esiste un compromesso tra il frame rate e la dimensione dei pixel dell'immagine, che è particolarmente importante per l'imaging funzionale come l'imaging del calcio. La massima velocità di ripetizione laser disponibile viene decisa a ciascuna profondità in base all'energia dell'impulso richiesta alla messa a fuoco e alla potenza media del laser applicabile come discusso sopra, ad esempio, 2 MHz a una profondità equivalente a ~ 4 EAL con eccitazione di 1.300 nm. In generale, l'imaging richiede almeno un impulso per pixel. Di conseguenza, il tempo minimo di permanenza dei pixel disponibili è determinato dalla frequenza di ripetizione del laser, ad esempio 0,5 μs / pixel con eccitazione a 2 MHz.
Per mantenere l'alta risoluzione spaziale (~1 μm in laterale) nelle immagini 3P, è ideale impostare 1 pixel su un'area di ~1 μm2, ad esempio 256 x 256 pixel per un FOV di 250 x 250 μm2. Quindi, per eseguire immagini veloci con un FOV considerevolmente grande (ad esempio, 250 x 250 μm2 con 256 x 256 pixel), frequenze di ripetizione degli impulsi di 0,5 MHz, 1 MHz e 2 MHz forniscono frame rate massimi teorici di ~ 7,6, ~ 15 e ~ 30 fotogrammi / s, rispettivamente. Allo stesso modo, l'ottimizzazione della frequenza di ripetizione laser è essenziale, a seconda della profondità target, della velocità di scansione e del FOV, per applicare un'adeguata energia dell'impulso sotto la soglia del danno termico. Per aumentare la velocità di imaging, una sorgente di eccitazione adattiva può essere utilizzata per concentrare tutti gli impulsi di eccitazione sui neuroni (cioè le regioni di interesse) fornendo impulsi laser su richiesta ai neuroni31.
3PM è vantaggioso rispetto a 2PM nell'imaging profondo all'interno di tessuti viventi e attraverso mezzi altamente dispersivi come un cranio, ossa e lo strato di sostanza bianca (cioè la capsula esterna) del cervello del topo. L'EAL più lungo e l'eccitazione non lineare di ordine superiore di 3PE avvantaggiano l'imaging dei tessuti profondi. Ad esempio, per visualizzare GCaMP6 nella corteccia del topo, il segnale di fluorescenza 2P con eccitazione a 920 nm è superiore al segnale di fluorescenza 3P con eccitazione a 1.300 nm in regioni poco profonde a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">690 μm (cioè ~ 2,3 EAL a 1.300 nm)21. Tuttavia, a causa dell'EAL più lungo a 1.300 nm rispetto a 920 nm, 3PE dà una fluorescenza più forte dell'eccitazione 2P (2PE) a una profondità di ~ 690 μm epiù profonda 21. Questa profondità è definita come "profondità di crossover del segnale", alla quale le potenze del segnale di fluorescenza di 2PE e 3PE sono identiche con la stessa frequenza di ripetizione e le stesse potenze medie massime consentite21. La profondità di crossover del segnale dipende dalle lunghezze d'onda di eccitazione per 2PE e 3PE e dal fluoroforo.
In pratica, l'eccitazione a 920 nm consente una potenza laser media superiore all'eccitazione di 1.300 nm a causa del minore assorbimento d'acqua. Tuttavia, la maggiore potenza media di 2PE spingerebbe la profondità del crossover del segnale solo di 0,9 EAL4. Inoltre, quando il campione è densamente etichettato, 3PE ha l'ulteriore vantaggio di un SBR molto più elevato. Pertanto, anche prima di raggiungere la lunghezza di crossover del segnale, 3PM può essere migliore per l'imaging rispetto a 2PM. Ad esempio, quando si esegue l'imaging della vascolarizzazione cerebrale del topo, che ha una frazione di volume (cioè densità di etichettatura) di ~ 2%, 1.300 nm 3PM con potenza di eccitazione di 100 mW supera 920 nm 2PM con potenza di eccitazione di 200 mW a una profondità di ~ 700 μm per la fluoresceina.
3PM ha anche un vantaggio quando si esegue l'imaging attraverso uno strato sottile ma altamente scattering che può distorcere la funzione di diffusione del punto del fascio di eccitazione e generare uno sfondo sfocato4. Ad esempio, attraverso il cranio intatto del cervello del topo, le immagini 2PM soffrono dello sfondo sfocato anche alla profondità ridotta di <100 μm dalla superficie cerebrale13. Uno sfondo di sfocatura simile è stato osservato nelle 14:00 con eccitazione di 1.280 nm attraverso la sostanza bianca nel cervello del topo32. Pertanto, quando i tessuti vengono ripresi attraverso strati torbidi, le 15:00 sono preferibili alle 14:00 per l'imaging ad alto contrasto, indipendentemente dalla densità di etichettatura.
Recentemente abbiamo riportato un'analisi teorica e fantasma di perline che mostra che il limite di profondità di imaging di 3PM è superiore a 8 EAL33; 8 EAL equivalgono a ~3 mm con eccitazione di ~1.700 nm nella corteccia del topo. Tuttavia, il laser attualmente disponibile non ha abbastanza energia di impulso per raggiungere 8 EAL nel cervello del topo. L'ulteriore sviluppo di laser più forti spingerà l'attuale limite di profondità di imaging di 3PM.

Nelle scienze della vita, le tecniche di microscopia multifotonica (MPM), come 2PM e 3PM, sono stati potenti strumenti per l'imaging in vivo profondo con alta risoluzione spaziotemporale e alto contrasto nei tessuti a dispersione. Inoltre, questi metodi causano meno fotosbiancamento rispetto alla microscopia confocale a un fotone 1,2,3,4. Il 3PM è vantaggioso per l'imaging dei tessuti più profondi rispetto al 2PM a causa di due caratteristiche principali: (i) l'impiego di eccitazione a lunghezza d'onda più lunga (~ 1.300 nm o ~ 1.700 nm) riduce la dispersione dei tessuti e (ii) il processo di eccitazione di ordine superiore (cioè, il segnale di fluorescenza dipende dal cubo del potere di eccitazione in 3PM invece del quadrato del potere di eccitazione in 2PM) che sopprime la fluorescenza di fondo indesiderata3 . Di conseguenza, 3PM consente l'imaging ad alto contrasto in regioni più profonde nei tessuti viventi come l'ippocampo in un cervello di topo adulto intatto 3,5,6,7,8,9,10,11 e l'intero proencefalo del pesce zebra adulto12, incluso Ca2+ registrazione dell'attività e osservazioni multicolore. Inoltre, immagini ad alto contrasto sono state ottenute con 3PM attraverso i crani intatti del topo e del pesce zebra adulto12,13.
Oggi, le sorgenti laser di eccitazione adatte per l'eccitazione 3P (3PE) a ~ 1.300 e ~ 1.700 nm sono disponibili in commercio. Poiché il sistema di scansione laser è essenzialmente lo stesso per le 14:00 e le 15:00, la conversione di una configurazione 2P esistente in una configurazione 3P è possibile nei laboratori di biologia con l'installazione di un laser disponibile in commercio per 3PE. Il segnale di fluorescenza 3P dipende dalla potenza del laser, dalla durata dell'impulso, dalla frequenza di ripetizione del laser e dall'apertura numerica (NA) della lente dell'obiettivo. Supponendo una messa a fuoco limitata alla diffrazione (cioè, l'apertura posteriore dell'obiettivo è sovraffollata dal fascio di eccitazione), Eq (1) descrive il flusso di fotoni di fluorescenza media nel tempo dal volume focale risultante da 3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Dove f è la velocità di ripetizione del laser, τ è la durata dell'impulso laser (larghezza intera a metà massimo), φ è l'efficienza di raccolta del sistema, η è l'efficienza quantistica della fluorescenza, σ3 è la sezione trasversale di assorbimento 3P, C è la concentrazione di fluoroforo, n0 è l'indice riflettente del mezzo campione (ad esempio, acqua), λ è la lunghezza d'onda di eccitazione nel vuoto, NA è l'apertura numerica della lente dell'obiettivo, un3 è la costante di integrazione spaziale del volume focale, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> è il flusso di fotoni di eccitazione media nel tempo (fotoni / s) sotto l'obiettivo obiettivo, z è la profondità dell'immagine e EAL è la lunghezza di attenuazione effettiva14. Qui abbiamo ipotizzato che l'EAL (tipicamente > 100 μm) sia molto maggiore della risoluzione assiale del microscopio (tipicamente < 10 μm). Sotto approssimazione paraassiale, un3 è uguale a 28,114. gp(3) è la coerenza temporale del 3° ordine della sorgente di eccitazione, e gp(3) è 0,41 e 0,51 rispettivamente per gli impulsi iperbolico-secante-quadrati e gli impulsi gaussiani. L'efficienza di raccolta φ può essere stimata considerando la raccolta di fluorescenza da parte della lente obiettivo, la trasmittanza della lente dell'obiettivo, la riflettività dello specchio dicroico, la trasmittanza dei filtri e l'efficienza di rilevamento del rivelatore (ad esempio, tubo fotomoltiplicatore o PMT). Poiché l'intensità di fluorescenza 3P dipende fortemente da vari parametri, è necessaria l'ottimizzazione della configurazione 3P per massimizzare i segnali di fluorescenza 3P.
Questo protocollo illustra il processo di ottimizzazione di una tipica configurazione 3P, che sarà utile in particolare per i laboratori di biologia che hanno una configurazione 2P e prevedono di espandere la sua capacità all'imaging 3P o di mantenere la loro configurazione 3P commerciale a prestazioni ottimali. Questo articolo video dimostra anche l'imaging 3P dei tessuti profondi nel cervello animale vivente. La prima sezione affronta l'ottimizzazione di una tipica configurazione 3P con una sorgente laser disponibile in commercio e un microscopio multifotone. La seconda e la terza sezione descrivono la preparazione del pesce zebra e del topo, rispettivamente, per le 15:00 delle strutture e delle attività neuronali. La chirurgia della craniotomia del topo è stata precedentemente riportata in documenti di protocollo e 15,16,17. La quarta sezione dimostra l'imaging 3P intravitale nel cervello di zebrafish e topo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

Le tecniche di microscopia multifotonica, come la microscopia a due fotoni (2PM) e la microscopia a tre fotoni (3PM), sono potenti strumenti per l'imaging in vivo dei tessuti profondi con risoluzione subcellulare. 3PM ha due principali vantaggi per l'imaging dei tessuti profondi rispetto alle 2PM che è stato ampiamente utilizzato nei laboratori di biologia: (i) lunghezza di attenuazione più lunga nei tessuti a dispersione impiegando ~ 1.300 nm o ~ 1.700 nm laser di eccitazione; (ii) minore generazione di fluorescenza di fondo a causa dell'eccitazione non lineare di ordine superiore. Di conseguenza, 3PM consente l'imaging strutturale e funzionale ad alto contrasto in profondità all'interno di tessuti sparsi come il cervello di topo intatto dagli strati corticali all'ippocampo e l'intero proencefalo del pesce zebra adulto.
Oggi, le sorgenti laser adatte per le 3PM sono disponibili in commercio, consentendo la conversione di un sistema di imaging a due fotoni (2P) esistente in un sistema a tre fotoni (3P). Inoltre, sono disponibili più microscopi 3P commerciali, il che rende questa tecnica prontamente disponibile per i laboratori di ricerca biologica. Questo documento mostra l'ottimizzazione di una tipica configurazione 3PM, in particolare rivolta ai gruppi di biologia che hanno già una configurazione 2P, e dimostra l'imaging 3D intravitale in cervelli di topi e pesci zebra adulti intatti. Questo protocollo copre l'intera procedura sperimentale di imaging 3P, incluso l'allineamento al microscopio, il prechirping di impulsi laser ~ 1.300 e ~ 1.700 nm, la preparazione animale e l'imaging intravitale a fluorescenza 3P in profondità nel cervello adulto di zebrafish e topo.

Il completamento con successo di questo protocollo si tradurrà in un microscopio correttamente allineato con parametri di luce ottimali (ad esempio, durata dell'impulso, NA) e preparazioni animali appropriate per le 15:00 in vivo . La configurazione 3P disponibile in commercio comprende specchi e lenti appropriati sia per ~ 1.300 nm che per ~ 1.700 nm; pertanto, non è necessario alcun cambiamento nell'ottica quando la lunghezza d'onda di eccitazione viene commutata tra 1.300 nm e 1.700 nm. Se le lenti in una configurazione 3P non hanno un rivestimento appropriato per 1.300 e 1.700 nm, queste devono essere sostituite con quelle appropriate per ridurre la perdita di potenza del laser. Con le 3PM ottimizzate e una corretta preparazione degli animali, è possibile raccogliere immagini in vivo di fluorescenza e THG ad alto contrasto in profondità all'interno del cervello.
La Figura 3 mostra immagini rappresentative 3P di pesci zebra adulti intatti. L'imaging ad alta risoluzione, non invasivo e profondo dei neuroni geneticamente marcati nel cervello del pesce zebra adulto viene ottenuto utilizzando 3PM. Sebbene l'imaging nella regione del telencefalo sia stato riportato nel cervello del pesce zebra adulto utilizzando 2PM 24,25,26,27, 3PM consente l'accesso all'intero telencefalo e alle regioni che sono più difficili o impossibili da osservare usando altre tecniche. La distribuzione degli strati cellulari nel tectum ottico e nel cervelletto può essere osservata nella Figura 3C. In una sessione di imaging di successo, l'osso è visibile nel canale THG e i neuroni visibili nel canale di fluorescenza. Per l'imaging del pesce zebra adulto, la funzione della fotocamera del microscopio è stata utilizzata per localizzare il pesce (Figura 3A). Questo passaggio non è necessario per l'imaging cerebrale del topo in quanto la finestra di vetro è abbastanza grande da rendere il cervello facilmente accessibile. Immagini strutturali ad alta risoluzione del cervello di zebrafish adulto sono state ottenute utilizzando il sistema descritto nelle sezioni precedenti. Il cranio è visto nel canale THG (Figura 3B), che aiuta a navigare nel cervello e trovare la superficie superiore. Come osservato nella Figura 3C, i neuroni sono distinguibili con un elevato rapporto segnale-sfondo (SBR) in profondità nel cervello adulto. Il tessuto sopra il cervello è visibile nel canale di fluorescenza a causa dell'autofluorescenza.
La Figura 4 mostra immagini 3P multicolore di neuroni marcati GCaMP6s (verde) e vasi sanguigni marcati in rosso del Texas (rosso) insieme a segnali THG (blu) nel cervello del topo adulto con eccitazione 1.340 nm10. Le immagini sono riprodotte dal lavoro precedente10. Nella Figura 4, l'energia dell'impulso a fuoco è stata mantenuta a ~ 1,5 nJ nell'intera profondità per ottenere sufficienti segnali di fluorescenza e THG, e la potenza media massima del laser era di ~ 70 mW. La durata dell'impulso è stata regolata a ~ 60 fs e il NA effettivo è stato di ~ 0,8. Con l'ottimizzazione della configurazione 3PM, le immagini ad alto contrasto sono state ottenute con successo fino a 1,2 mm dalla superficie del cervello, nella regione dell'ippocampo CA1 (Figura 4A, B). La Figura 4C,D mostra tracce di attività Ca2+ di neuroni marcati con GCaMP6s a una profondità di 750 μm per una sessione di registrazione di 10 minuti, mostrando un'alta fedeltà di registrazione.
Se il laser di eccitazione è disallineato, si può osservare la non uniformità nella luminosità del segnale in tutto il campo visivo. Inoltre, se i parametri laser, come la durata dell'impulso, l'energia dell'impulso di eccitazione a fuoco e l'efficace NA, non sono ottimizzati, l'immagine THG dal cranio del pesce o dalla finestra craniotomia del cervello del topo non sarà visibile e / o richiede un'elevata energia dell'impulso di eccitazione (ad esempio, >2 nJ / impulso a fuoco). Quindi, i segnali THG sulla superficie del cervello possono essere utilizzati come indicatore per una configurazione ottimizzata delle 15:00 prima di iniziare l'imaging dei tessuti profondi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> Figura 1: Illustrazione schematica di una configurazione a 3 PM. La lunghezza d'onda del laser di eccitazione è impostata su ~ 1.300 nm o ~ 1.700 nm, in uscita dalla porta folle del NOPA. Il compressore a coppia di prismi e il compressore a piastra Si vengono utilizzati rispettivamente per il laser ~ 1.300 nm e ~ 1.700 nm per prechirp l'impulso laser di eccitazione. I raggi laser ~ 1.300 nm e ~ 1.700 nm possono essere commutati con specchi flipper. La porta del segnale del NOPA viene utilizzata per ottenere il segnale di attivazione. Una mezza piastra d'onda e un PBS vengono utilizzati per controllare la potenza di eccitazione. La fluorescenza e il THG vengono rilevati dai PMT GaAsP. Combinazioni appropriate di specchi dicroici e filtri passa-banda vengono utilizzate per separare i segnali di fluorescenza e THG. Abbreviazioni: 3PM = microscopia a tre fotoni; NOPA = amplificatore parametrico ottico non collinoso; PBS = spaccatelo polarizzante; THG = generazione di terza armonica; DAQ = acquisizione dati; PMT = tubo fotomoltiplicatore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> Figura 2: Schermate rappresentative per l'imaging intravitale nei pesci (sezione protocollo 4.1). (A) Visualizzazione in modalità fotocamera del software di acquisizione delle immagini con obiettivo 4x in posizione. Le caratteristiche principali del software sono delineate e numerate come segue: 1. Modalità di imaging del software di acquisizione delle immagini. Le opzioni di modalità sono Fotocamera, Multifotone e Multifotone GG. Per l'imaging a luce bianca con fotocamera CCD, viene scelta la modalità Fotocamera . 2. Facendo clic sul pulsante Live si accende la fotocamera (o PMT se in opzioni multifotone) e si può osservare una visione in tempo reale del microscopio. 3. Nella scheda Capture Setup , vengono impostati i parametri di imaging desiderati (potenza, posizione, profondità). 4. Nella scheda Acquisizione , viene assegnata una posizione della cartella per le immagini da salvare. L'imaging può essere avviato in questa scheda. 5. L'impostazione Z Control controlla la profondità dell'imaging spostando il motore dello stadio z. 6. Immagine rappresentativa di una testa di zebrafish. Il lato rostrale della testa è a sinistra. (B) Vista rappresentativa della modalità Fotocamera con obiettivo 25x. (C) Vista rappresentativa della modalità GG multifotone contenente l'immagine THG dell'immagine vista in (B). Abbreviazioni: CCD = dispositivo ad accoppiamento di carica; PMT = tubo fotomoltiplicatore; THG = terza generazione armonica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> Figura 3: Immagini rappresentative del cervello adulto di zebrafish acquisite con il software di acquisizione delle immagini. (A) Immagine in modalità fotocamera della testa di zebrafish adulto acquisita con un obiettivo 4x. La parte superiore dell'immagine è la direzione rostrale. I lobi OT e CB sono delineati. (B) Immagine rappresentativa acquisita in modalità Multiphoton GG con un obiettivo 25x contenente l'immagine THG di (A). (C) Immagini di fluorescenza del cervello adulto del pesce zebra all'intersezione del cervelletto e del tectum ottico in cui la GFP è espressa nel citoplasma dei neuroni in varie profondità. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: OT = optic tectam; CB = cervelletto; THG = generazione di terza armonica; GFP = proteina fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> Figura 4: Multicolor 3PM di neuroni GCaMP6marcati s (verde), vasi sanguigni marcati in rosso del Texas (rosso) e terza generazione armonica (blu) su eccitazione di 1.340 nm nel cervello del topo. (A) Immagini Z-stack fino a 1.200 μm dalla superficie cerebrale con un campo visivo di 270 x 270 μm (512 x 512 pixel per fotogramma). La potenza del laser è stata variata in base alla profondità di imaging per mantenere ~ 1,5 nJ di energia dell'impulso al fuoco. La potenza media massima sotto l'obiettivo era di 70 mW. (B) Immagini 2D selezionate a varie profondità di imaging. (C) Sito di registrazione dell'attività a 750 μm sotto la dura con un campo visivo di 270 x 270 μm (256 x 256 pixel). (D) Tracce spontanee di attività cerebrale registrate in un topo sveglio dai neuroni marcati indicati in (C). Il frame rate era di 8,3 Hz, con un tempo di permanenza in pixel di 0,51 μs. La frequenza di ripetizione laser era di 2 MHz e la potenza media sotto l'obiettivo era di 56 mW. Ogni traccia è stata normalizzata alla sua linea di base e filtrata passa-basso utilizzando una finestra di hamming di 0,72 s costante di tempo. Barre di scala = 50 μm. Questa figura e la legenda della figura sono riprodotte da 10. Abbreviazione: 3PM = microscopia a tre fotoni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> Figura 5: Lunghezza di attenuazione effettiva nella neocorteccia del cervello del topo. L'EAL (linea magenta) viene calcolato dallo scattering tissutale (linea rossa) e dall'assorbimento d'acqua nel tessuto (linea blu), assumendo una composizione acquosa del 75%. Le stelle nere indicano i dati sperimentali riportati di EAL nella neocorteccia del cervello del topo 3,21,28,29. Si noti che EAL varia in diversi tessuti. Abbreviazione: EAL = lunghezza di attenuazione effettiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lunghezza d'onda di eccitazione nm)</td>
			<td>Acqua per immersione</td>
			<td>Potenza laser massima (mW)</td>
			<td>Massima energia dell'impulso alla messa a fuoco* (nJ)</td>
			<td>EAL tipico nella corteccia del topo (μm)</td>
			<td>Profondità di imaging nella corteccia del topo** (mm)</td>
			<td>Energia pulsata nell'ambito dell'obiettivo*** (nJ)</td>
			<td>Tasso massimo di ripetizione laser**** (MHz)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O o D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190 ·</td>
			<td>~0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Condizioni tipiche di eccitazione 3 P per l'imaging della corteccia del topo. *Con un obiettivo NA elevato (~1.0), larghezza di impulso di ~50 fs e fluorofori tipici come le proteine fluorescenti (ad esempio, GFP e RFP). ** Con l'ipotesi che l'EAL sia uniforme in tutta la corteccia. Per ottenere ~ 1 nJ / impulso a fuoco, calcolato dall'EAL e dalla profondità di imaging. Calcolato dall'energia dell'impulso sotto l'obiettivo e dalla massima potenza laser permissiva. Abbreviazioni: 3P = tre fotoni; NA = apertura numerica; GFP = proteina fluorescente verde; RFP = proteina fluorescente rossa; EAL = lunghezza di attenuazione effettiva.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

La microscopia a tre fotoni consente l'imaging a fluorescenza ad alto contrasto in profondità nei tessuti biologici viventi, come il cervello di topo e zebrafish, con un'elevata risoluzione spaziotemporale.

Microscopia a fluorescenza a tre fotoni nei tessuti profondi nel cervello intatto di topo e zebrafish

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Il protocollo illustra come eseguire in vivo la microscopia a tre fotoni dei tessuti profondi nel cervello di topo e nel pesce zebra adulto. Due importanti sistemi modello nelle scienze della vita. La microscopia a tre fotoni a lunghezza d'onda lunga consente l'imaging in vivo ad alta risoluzione spaziale di tessuti o organi intatti a profondità inaccessibili dalla microscopia a due fotoni.Questa tecnica può aiutarci a capire i meccanismi alla base delle malattie neurologiche, come l'Alzheimer e l'autismo, dove manca una comprensione completa di come la malattia colpisce il cervello. A dimostrare la procedura di imaging cerebrale del topo sarà Kibaek Choe, il ricercatore post-dottorato del nostro laboratorio e a dimostrare la procedura di imaging cerebrale del pesce zebra sarà Kristine Kolkman, ricercatrice associata del Fetcho Research Laboratory. Per iniziare, accendere il laser e impostare la lunghezza d'onda centrale dell'uscita inattiva dell'amplificatore parametrico ottico non collinoso a 1, 300 o 1.700 nanometri, quindi posizionare i compressori a impulsi sul percorso della luce per pre-cinguettiare il laser a femtosecondi e ottimizzare la durata dell'impulso per l'imaging a tre fotoni.Impostare l'angolo tra la piastra di silicio e il percorso laser all'angolo di Brewster per massimizzare la trasmissione laser, quindi ruotare la piastra di silicio per ottenere l'angolo di Brewster riducendo al minimo la riflessione. Quindi, posiziona gli specchi flipper per passare comodamente tra le linee del fascio da 1, 300 e 1. 700 nanometri. Posizionare una mezza piastra d'onda montata su uno stadio di rotazione e uno splitter a fascio polarizzatore per controllare l'intensità del laser, quindi posizionare un bloccave nel percorso di riflessione dello splitter del fascio.Preparare una capsula di Petri con 0,5 centimetri di agar ad alto punto di fusione al 2%. Una volta che l'agar si è raffreddato e solidificato, tagliare un foro rettangolare nell'agar più lungo e leggermente più largo del pesce. Usando la cera, attaccare tubi sottili alla piastra di Petri con un'estremità nel rettangolo e un tubo di diametro maggiore sul bordo della capsula di Petri.Successivamente, anestetizzare il pesce mettendolo in una soluzione di tricaina da 0,2 milligrammi per millilitro, quindi posizionare il pesce anestetizzato su un lato su una spugna bagnata, quindi utilizzare una microsiringa, iniettare retro-orbitalmente 3 microlitri di bromuro di pancuronio per paralizzare il pesce e posizionarlo brevemente nella soluzione di Hank per assicurarsi che sia completamente paralizzato. Quindi, posizionare il pesce dorsale nella capsula di Petri con la testa verso il tubo, quindi usando una pinza, aprire delicatamente la bocca del pesce e far scorrere il tubo in bocca. Far scorrere delicatamente il pesce verso il tubo in modo che il tubo sia nella parte posteriore della bocca del pesce.Rapidamente, ma delicatamente, asciugare l'agar intorno al pesce e rimuovere l'acqua sopra il pesce. Immergere un piccolo pezzo di tessuto di laboratorio nella colla da laboratorio e mettere il tessuto sull'agar su entrambi i lati del pesce e sopra la schiena del pesce caudale alle branchie. Successivamente, anestetizzare la pelle del pesce posizionando una piccola goccia di bupivacaina direttamente sulla superficie della testa, quindi portare la capsula di Petri con il pesce al microscopio.Riempire il piatto con acqua di impianto per pesci e collegare il tubo a una pompa dell'acqua per pompare l'acqua del sistema nella bocca del pesce. Assicurarsi che l'acqua sia ossigenata con un gorgogliatore e riscaldata a 30 gradi Celsius con un riscaldatore per acquari. Per l'imaging, posizionare un obiettivo a basso ingrandimento sul microscopio a tre fotoni, quindi posizionare la capsula di Petri contenente il pesce e i tubi sotto il microscopio e utilizzare una sorgente luminosa a LED per illuminare la capsula di Petri.Dal software di acquisizione delle immagini, apri la modalità Fotocamera, fai clic su Live, scegli il canale A sul lato destro dello schermo e regola le impostazioni dell'istogramma per vedere chiaramente l'immagine. Dopo aver impostato l'impostazione del motore sul controller del motore alla base, abbassare l'obiettivo fino a quando il pesce non è visibile. Posiziona il centro della testa del pesce al centro del campo visivo, quindi sposta l'obiettivo verso l'alto e lontano dalla testa del pesce.Sostituire l'obiettivo a basso ingrandimento con l'obiettivo ad alta apertura numerica per l'imaging a tre fotoni, quindi avvicinarlo alla testa del pesce. Impostate i valori degli assi di tutti i motori su zero. Abbassare lentamente la lente dell'obiettivo, assicurandosi che l'obiettivo non contatti fisicamente la testa.Nel software della telecamera CCD, interrompere lo spostamento dell'obiettivo quando la parte superiore della testa è visibile e impostare le posizioni X, Y e Z su zero. Spegnere la sorgente luminosa a LED e chiudere la tenda scura attorno al sistema, quindi impostare il software di acquisizione dell'imaging sulla modalità GG multifotone per l'imaging a tre fotoni e impostare la potenza sotto l'obiettivo su meno di un milliwatt. Fare clic sul pulsante Live nel software di acquisizione delle immagini.Apri i canali PMT e regola il guadagno PMT e il livello di sfondo in base alle esigenze. Spostare lentamente verso l'alto la lente dell'obiettivo per individuare la superficie della testa monitorando il canale THG dai grandi vasi sanguigni e dalla superficie del vetro della finestra. Dopo aver spostato la lente dell'obiettivo vicino alla finestra, applicare acqua tra l'obiettivo e la finestra cranica, quindi impostare i valori degli assi di tutti i motori su zero.Fare clic sul pulsante Live nel software di acquisizione delle immagini. Aprire i canali PMT e regolare il guadagno PMT e il livello di fondo secondo necessità, quindi spostare lentamente verso l'alto l'obiettivo per individuare la superficie dello slittamento del coperchio monitorando il canale THG dai grandi vasi sanguigni e dalla superficie del vetro della finestra. Regola l'orientamento della finestra se necessario, quindi azzera i motori per definire la superficie del cervello.Eseguire l'imaging e regolare il livello di potenza in base alla profondità di imaging. L'imaging ad alta risoluzione, non invasivo e profondo di neuroni geneticamente marcati nel cervello del pesce zebra adulto è ottenuto utilizzando la microscopia a tre fotoni. Si può anche osservare la distribuzione degli strati cellulari nel tectum ottico e nel cervelletto.La funzione della fotocamera del microscopio è stata utilizzata per localizzare il pesce. Il cranio è visto nel canale THG, che aiuta a navigare nel cervello e trovare la superficie superiore. I neuroni sono distinguibili con un alto rapporto segnale-sfondo in profondità nel cervello adulto.Qui vengono mostrate immagini multicolore a tre fotoni di neuroni marcati con GCaMP6s e vasi sanguigni marcati in rosso del Texas insieme ai segnali THG nel cervello del topo adulto. Con l'ottimizzazione della configurazione, le immagini ad alto contrasto sono state ottenute con successo fino a 1,2 millimetri dalla superficie del cervello nella regione dell'ippocampo CA1. Le tracce di attività calcistica dei neuroni marcati con GCaMP6s a una profondità di 750 micrometri per una sessione di registrazione di 10 minuti hanno mostrato un'alta fedeltà di registrazione.Questa configurazione può aiutare a visualizzare l'attività neuronale per comprendere la funzione cerebrale. Può anche essere usato per tracciare il movimento cellulare all'interno del tessuto biologico per comprendere vari sistemi biologici. Inoltre, la velocità del flusso sanguigno può anche essere misurata per monitorare la salute dell'animale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Ricerca

Neuroscienze

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