Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub og NIH 1U01NS103516.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li><li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain.">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li><li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li><li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+Ca2++imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy.">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li><li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy.">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177 (2019).</li><li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain.">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li><li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser.">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science &amp; Applications. 7, 12 (2018).</li><li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain.">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots.">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull.">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li><li>Xu, C., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+of+molecular+fluorophores+and+nonlinear+laser+microscopy.">Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy.</a> Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , 471-540 (2002).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).</li><li>&#321;ukasiewicz, K., Robacha, M., Bo&#380;ycki, &. #. 3. 2. 1. ;., Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex.">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).</li><li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity.">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).</li><li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms.">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging.">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li><li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1,700+nm.">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain.">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205 (2020).</li><li>Cheng, L. -. C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -. J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy.">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li><li>Huang, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish.">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche.">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li><li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain.">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li><li>Vogel, A., Noack, J., H&#252;ttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues.">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li><li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy.">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li><li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).</li><li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy.">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Denne protokollen forklarer trinnvise prosedyrer for å sette opp 3P-avbildning med et kommersielt mikroskop og laserkilde. Sammenlignet med 14:00, har 15:00 en fordel i applikasjoner som krever optisk tilgang i de dypere områdene som i musen hjernen hippocampus. Selv om 15:00 for det meste brukes i nevrovitenskap, kan 15:00 potensielt brukes i andre vev som lymfeknuter, bein og svulster for dypvevsobservasjon.
Det er viktig å kontrollere at bildesystemet fungerer nær skuddstøygrensen, noe som sikrer at deteksjons- og datainnsamlingselelektronikken bidrar med ubetydelig støy til bildet etter PMT-ene. Usikkerheten i antall fotoner som oppdages er fundamentalt begrenset av fotonskuddsstøy. Skuddstøybegrenset ytelse kan oppnås i et typisk multifotonmikroskop ved hjelp av en fotodetektor med høy forsterkning (f.eks. en PMT). Fotonskuddsstøy følger en Poisson statistisk fordeling, der standardavviket for fordelingen er lik kvadratroten av gjennomsnittet av fordelingen. Følg trinn 1.14 i protokolldelen for å kontrollere den begrensede ytelsen for skuddstøy.
For å unngå lysdemping ved H2O er det nyttig å bruke D2O til nedsenking, spesielt for ~ 1700 nm eksitasjon. Når D2O brukes, er det viktig å oppdatere D2O hver ~10 min eller bruke et stort volum D2O for å unngå D2O/ H2O utveksling under bildebehandling. Man kan også forsegle D2O fra rommiljøet3. Hvis en objektiv linse med lang arbeidsavstand (WD) (f.eks. WD ved 4 mm eller lenger) brukes til avbildning, kan nedsenkningsvæsketykkelsen overstige 2-3 mm. Den økte tykkelsen gjør H2O absorpsjon ikke ubetydelig selv ved ~ 1300 nm21. Derfor kan D2O være nødvendig selv for 1300 nm 3PM når du bruker en lang WD objektiv.
Ettersom 3P-fluorescensintensiteten avhenger av kuben til eksitasjonspulsenergien i fokus (Eq. (1)), er det spesielt viktig å stille inn riktig lasereffekt for å oppnå tilstrekkelige 3P fluorescenssignaler samtidig som termisk og ikke-lineær skade i levende vev unngås. Den gjennomsnittlige lasereffekten bør holdes under terskelen for termisk skade. I musehjernen, for eksempel for å unngå termisk vevsskade, bør den gjennomsnittlige kraften på musens hjerneoverflate holdes på eller under ~ 100 mW for ~ 1300 nm eksitasjon på en dybde på 1 mm og med et synsfelt (FOV) på 230 μm x 230 μm21. På samme måte bør gjennomsnittseffekten på ~ 1700 nm holdes på eller under ~ 50 mW ved ~ 1 mm dybde og en FOV på ~ 230 μm x 230 μm (upubliserte data). Videre, for å unngå eksitasjonsmetning og potensiell ikke-lineær skade, bør eksitasjonspulsenergien holdes på <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">henholdsvis 2 nJ og <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 nJ for ~ 1300 nm og ~ 1700 nm eksitasjon, henholdsvis30.
På grunn av lysabsorpsjon og spredning i vev, dempes pulsenergien i fokus til 1/e (~ 37%) etter penetrasjon av vev med 1 EAL. EAL varierer i forskjellige vev og med eksitasjonsbølgelengdene, for eksempel i neocortex av musehjernen, er EAL ~ 300 μm og ~ 400 μm ved ~ 1300 nm og ~ 1700 nm, henholdsvis 3,29 (figur 5). For å holde den samme pulsenergien i fokus (f.eks. 1 nJ/puls) på en dybde på n EALer, må overflatepulsenergien multipliseres med 1 nJ × en. For rask bildebehandling av strukturell og funksjonell dynamikk er en eksitasjonslaser med høy repetisjonshastighet (ved 1 MHz eller høyere) ønskelig å oppnå en høy bildefrekvens 5,6,7,10. Pulsenergibehovet og den gjennomsnittlige laserkraftgrensen begrenser imidlertid gjeldende repetisjonshastighet.
For eksempel, når vi ser for oss en moderat dyp region ved 4 EALer (dvs. ~ 1,2 mm i musebarken med 1300 nm eksitasjon), kreves ~ 55 nJ / puls på overflaten for å holde 1 nJ / puls i fokus. Når den gjennomsnittlige strømbegrensningen er 100 mW, kan vi bruke en laserrepetisjonshastighet på ~ 2 MHz. Men for å se dypere på en dybde på 7 EALer, kreves ~1100 nJ/puls på overflaten for å opprettholde 1 nJ/puls i fokus. Forutsatt at maksimal gjennomsnittlig effekt er 100 mW for å unngå termisk skade, bør laserrepetisjonshastigheten reduseres til 0,1 MHz for å oppnå en 1100 nJ / puls på overflaten. Tabell 1 oppsummerer typiske bildeforhold i musens hjernebark. Legg merke til at bildedybden i tabell 1 forutsetter at EAL er ensartet i hele musebarken.
Videre, på grunn av laserkraftbegrensningen i dypvev 15:00, eksisterer en avveining mellom bildefrekvensen og bildepikselstørrelsen, noe som er spesielt viktig for funksjonell bildebehandling som kalsiumavbildning. Den maksimale tilgjengelige laserrepetisjonshastigheten bestemmes på hver dybde basert på den nødvendige pulsenergien i fokus og den gjeldende gjennomsnittlige lasereffekten som beskrevet ovenfor, for eksempel 2 MHz på en dybde som tilsvarer ~ 4 EALer med 1300 nm eksitasjon. Generelt krever bildebehandling minst én puls per piksel. Følgelig bestemmes minimum tilgjengelig pikselboetid av laserrepetisjonshastigheten, for eksempel 0,5 μs / piksel med 2 MHz eksitasjon.
For å holde den høye romlige oppløsningen (~ 1 μm i laterale) i 3P-bilder, er det ideelt å sette 1 piksel til et område på ~ 1 μm2, for eksempel 256 x 256 piksler for en FOV på 250 x 250 μm2. For å utføre rask bildebehandling med en betydelig stor FOV (f.eks. 250 x 250 μm2 med 256 x 256 piksler), gir henholdsvis 0,5 MHz, 1 MHz og 2 MHz pulsrepetisjonshastigheter teoretisk maksimal bildefrekvens på henholdsvis ~ 7,6, ~ 15 og ~ 30 bilder / s. På samme måte er optimaliseringen av laserrepetisjonshastigheten viktig, avhengig av måldybden, skannehastigheten og FOV, for å bruke tilstrekkelig pulsenergi under terskelen for termisk skade. For å øke bildehastigheten kan en adaptiv eksitasjonskilde brukes til å konsentrere alle eksitasjonspulsene på nevronene (dvs. interesseregioner) ved å levere laserpulser på forespørsel til nevronene31.
15:00 er fordelaktig sammenlignet med 14:00 i dyp avbildning i levende vev og gjennom svært spredningsmedier som hodeskalle, bein og det hvite materielaget (dvs. den eksterne kapselen) i musehjernen. Jo lengre EAL og den ikke-lineære eksitasjonen med høyere rekkefølge av 3PE fordeler dypvevsavbildning. For eksempel, til bilde GCaMP6 i musebarken, er 2P fluorescenssignal med 920 nm eksitasjon høyere enn 3P fluorescenssignal med 1300 nm eksitasjon i grunne områder ved <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">690 μm (dvs. ~ 2,3 EALer ved 1300 nm)21. På grunn av den lengre EAL på 1300 nm sammenlignet med 920 nm, gir 3PE imidlertid sterkere fluorescens enn 2P-eksitasjon (2PE) på en dybde på ~ 690 μm og dypere21. Denne dybden er definert som "signalovergangsdybde", der fluorescenssignalstyrkene til 2PE og 3PE er identiske med samme repetisjonshastighet og samme maksimale tillatte gjennomsnittlige krefter21. Signalovergangsdybden avhenger av eksitasjonsbølgelengdene for 2PE og 3PE og fluoroforen.
I praksis tillater 920 nm eksitasjon høyere gjennomsnittlig lasereffekt enn 1300 nm eksitasjon på grunn av mindre vannabsorpsjon. Den høyere gjennomsnittlige effekten til 2PE vil imidlertid bare presse signalets crossover-dybde med 0,9 EALer4. I tillegg, når prøven er tett merket, har 3PE den ekstra fordelen med mye høyere SBR. Derfor, selv før du når signalovergangslengden, kan 15:00 være bedre for bildebehandling enn 14:00. For eksempel, når du forestiller deg musen hjernen vaskulaturen, som har en volumfraksjon (dvs. merkingstetthet) på ~ 2%, 1300 nm 3PM med 100 mW eksitasjonskraft overgår 920 nm 2PM med 200 mW eksitasjonskraft i en dybde på ~ 700 μm for fluorescein.
15:00 har også en fordel når du ser gjennom et tynt, men svært spredningslag som kan forvrenge punktspredningsfunksjonen til eksitasjonsstrålen og generere en defokusbakgrunn4. For eksempel, gjennom den intakte skallen i musehjernen, lider 2PM-bilder av defokusbakgrunnen selv på den grunne dybden av <100 μm fra hjerneoverflaten13. En lignende defokusbakgrunn ble observert i 14:00 med 1280 nm eksitasjon gjennom det hvite stoffet i musehjernen32. Derfor, når vev er avbildet gjennom uklare lag, er 3PM å foretrekke fremfor 14:00 for høykontrastbilder uavhengig av merketettheten.
Vi rapporterte nylig en perle fantom og teoretisk analyse som viser at bildedybdegrensen på 15:00 er over 8 EALs33; 8 EALer tilsvarer ~3 mm med ~1700 nm eksitasjon i musebarken. Den tilgjengelige laseren har imidlertid ikke nok pulsenergi til å oppnå 8 EALer i musehjernen. Videreutvikling av sterkere lasere vil presse den nåværende bildedybdegrensen på 15:00.

I life science har multifotonmikroskopiteknikker (MPM), som 14:00 og 15:00, vært kraftige verktøy for dyp in vivo-avbildning med høy romlig oppløsning og høy kontrast i spredningsvev. I tillegg forårsaker disse metodene mindre fotobleaching sammenlignet med en-foton konfikal mikroskopi 1,2,3,4. 15:00 er fordelaktig for dypere vevsavbildning sammenlignet med 14:00 på grunn av to hovedtrekk: (i) ansettelse av lengre bølgelengdeeksitasjon (~ 1300 nm eller ~ 1700 nm) reduserer vevsspredning, og (ii) eksitasjonsprosessen med høyere rekkefølge (dvs. fluorescenssignalet avhenger av kuben til eksitasjonskraften i 15:00 i stedet for kvadratet av eksitasjonskraften i 14:00) som undertrykker uønsket bakgrunnsfluorescens3 . Følgelig muliggjør 3PM høykontrastavbildning i dypere områder i levende vev som hippocampus i en intakt voksen musehjerne 3,5,6,7,8,9,10,11 og hele forebrain av voksen sebrafisk12, inkludert Ca 2+ aktivitetsregistrering og flerfargede observasjoner. Videre har høykontrastbilder blitt oppnådd med 15:00 gjennom de intakte hodeskallene av mus og voksen sebrafisk12,13.
I dag er eksitasjonslaserkilder egnet for 3P-eksitasjon (3PE) ved ~ 1300 og ~ 1700 nm kommersielt tilgjengelige. Siden laserskanningssystemet i hovedsak er det samme for 14:00 og 15:00, er det mulig å konvertere et eksisterende 2P-oppsett til et 3P-oppsett i biologilaboratorier med installasjon av en kommersielt tilgjengelig laser for 3PE. 3P-fluorescenssignalet er avhengig av lasereffekten, pulsvarigheten, laserrepetisjonshastigheten og den numeriske blenderåpningen (NA) til objektivlinsen. Forutsatt at et diffraksjonsbegrenset fokus (dvs. den bakre blenderåpningen til objektivlinsen er overfylt av eksitasjonsstrålen), beskriver Eq (1) den tidsgjennomsnittte fluorescensfotonfluksen fra brennvidden som følge av 3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Der f er laserrepetisjonshastigheten, er τ laserpulsvarigheten (full bredde ved halv maksimum), φ er systemets oppsamlingseffektivitet, η er fluorescens kvanteeffektiviteten, σ3 er absorpsjonskrysssnittet, C er fluoroforonsentrasjonen, n0 er den reflekterende indeksen til prøvemediet (f.eks. vann), λ er eksitasjonsbølgelengden i vakuum, vakuum , NA er den numeriske blenderåpningen til objektivet, en3 er den romlige integrasjonskonstanten til brennviddet, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> er den tidsgjennomsnittte eksitasjonsfotonfluksen (fotoner/ s) under objektivet, z er bildedybden, og EAL er den effektive dempingslengden14. Her har vi antatt at EAL (vanligvis > 100 μm) er mye større enn mikroskopets aksiale oppløsning (vanligvis < 10 μm). Under paraksial tilnærming er en3 lik 28,114. gp(3) er 3rd-order temporal sammenheng av eksitasjonskilden, og gp(3) er henholdsvis 0,41 og 0,51 for hyperbolsk-sekant-kvadred pulser og gaussiske pulser. Innsamlingseffektiviteten φ kan estimeres ved å vurdere fluorescenssamlingen ved objektivet, overføringen av objektivlinsen, reflektiviteten til det dikroiske speilet, overføringen av filtrene og detektorens deteksjonseffektivitet (f.eks. fotomultiplikatorrør eller PMT). Siden 3P-fluorescensintensiteten er svært avhengig av ulike parametere, kreves optimalisering av 3P-oppsettet for å maksimere 3P-fluorescenssignalene.
Denne protokollen illustrerer optimaliseringsprosessen til et typisk 3P-oppsett, som vil være nyttig spesielt for biologilaboratorier som har et 2P-oppsett og planlegger å utvide sin evne til 3P-avbildning eller opprettholde sitt kommersielle 3P-oppsett med optimal ytelse. Denne videoartikkelen demonstrerer også dypvevs 3P-avbildning i levende dyrehjerner. Den første delen tar for seg optimalisering av et typisk 3P-oppsett med en kommersielt tilgjengelig laserkilde og multifotonmikroskop. Den andre og tredje delen beskriver sebrafisk og muspreparat, henholdsvis for 3PM av nevronale strukturer og aktiviteter. Musekraniotomioperasjonen har tidligere blitt rapportert i protokollpapirer samt 15,16,17. Den fjerde delen demonstrerer intravital 3P-avbildning i sebrafisk og musehjerner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

Multifotonmikroskopiteknikker, for eksempel tofotonmikroskopi (14:00) og trefotonmikroskopi (15:00), er kraftige verktøy for dypvevs in vivo-avbildning med subcellulær oppløsning. 15:00 har to store fordeler for dypvevsavbildning over 14:00 som har blitt mye brukt i biologilaboratorier: (i) lengre dempingslengde i spredningsvev ved å bruke ~ 1300 nm eller ~ 1700 nm eksitasjonslaser; (ii) mindre bakgrunnsfluorescensgenerering på grunn av høyere ordens ikke-lineær eksitasjon. Som et resultat tillater 15:00 strukturell og funksjonell avbildning med høy kontrast dypt inne i spredningsvev som intakt musehjerne fra kortikale lag til hippocampus og hele forebrain av voksen sebrafisk.
I dag er laserkilder som er egnet for 15:00 kommersielt tilgjengelige, noe som muliggjør konvertering av et eksisterende to-foton (2P) bildebehandlingssystem til et tre-foton (3P) system. I tillegg er flere kommersielle 3P-mikroskoper tilgjengelige, noe som gjør denne teknikken lett tilgjengelig for biologiforskningslaboratorier. Dette dokumentet viser optimaliseringen av et typisk 3PM-oppsett, spesielt rettet mot biologigrupper som allerede har et 2P-oppsett, og demonstrerer intravital 3D-avbildning i intakt mus og voksne sebrafiskhjerner. Denne protokollen dekker den fullstendige eksperimentelle prosedyren for 3P-avbildning, inkludert mikroskopjustering, prechirping av ~ 1300 og ~ 1700 nm laserpulser, dyreforberedelse og intravital 3P fluorescensavbildning dypt i voksne sebrafisk og musehjerner.

Vellykket fullføring av denne protokollen vil resultere i et riktig justert mikroskop med optimale lysparametere (f.eks. pulsvarighet, NA) og dyrepreparater som passer for in vivo 15:00. Det kommersielt tilgjengelige 3P-oppsettet består av passende speil og linser for både ~ 1300 nm og ~ 1700 nm; Derfor er det ikke nødvendig med noen endring i optikk når eksitasjonsbølgelengden byttes mellom 1300 nm og 1700 nm. Hvis linsene i et 3P-oppsett ikke har et passende belegg på 1300 og 1700 nm, må disse byttes ut med passende for å redusere lasereffekttapet. Med optimalisert 15:00 og riktig dyreforberedelse kan in vivo fluorescens og THG-bilder med høy kontrast samles dypt inne i hjernen.
Figur 3 viser representative 3P-bilder av intakt voksen sebrafisk. Høyoppløselig, ikke-invasiv og dyp avbildning av genetisk merkede nevroner i den voksne sebrafiskhjernen oppnås ved hjelp av 15:00. Selv om avbildning i telencephalon-regionen har blitt rapportert i den voksne sebrafiskhjernen ved hjelp av2PM 24,25,26,27, 3PM gir tilgang til hele telencephalon og regioner som er mer utfordrende eller umulige å observere ved hjelp av andre teknikker. Fordelingen av cellelag i det optiske tectum og cerebellum kan observeres i figur 3C. I en vellykket bildebehandlingsøkt er beinet synlig i THG-kanalen og nevroner synlige i fluorescenskanalen. For voksen sebrafiskavbildning ble kamerafunksjonen til mikroskopet brukt til å finne fisken (figur 3A). Dette trinnet er ikke nødvendig for musehjerneavbildning, da glassvinduet er stort nok til å gjøre hjernen lett tilgjengelig. Høyoppløselige strukturelle bilder av voksen sebrafiskhjerne ble oppnådd ved hjelp av systemet som er beskrevet i de forrige avsnittene. Skallen ses i THG-kanalen (figur 3B), som hjelper til med å navigere i hjernen og finne den øverste overflaten. Som observert i figur 3C, kan nevroner skille seg ut med et høyt signal-til-bakgrunn-forhold (SBR) dypt i den voksne hjernen. Vevet over hjernen er synlig i fluorescenskanalen på grunn av autofluorescens.
Figur 4 viser flerfargede 3P-bilder av GCaMP6s-merkede nevroner (grønn) og Texas Rødmerkede blodårer (rød) sammen med THG (blå) signaler i den voksne musehjernen med 1340 nm eksitasjon10. Bildene er gjengitt fra tidligere arbeid10. I figur 4 ble pulsenergien i fokus opprettholdt ved ~ 1,5 nJ i hele dybden for å oppnå tilstrekkelig fluorescens og THG-signaler, og maksimal gjennomsnittlig lasereffekt var ~ 70 mW. Pulsvarigheten ble justert til ~ 60 fs, og den effektive NA var ~ 0,8. Med optimalisering av 3PM-oppsettet ble bilder med høy kontrast oppnådd ned til 1,2 mm fra hjerneoverflaten, i CA1 hippocampus-regionen (figur 4A, B). Figur 4C,D viser Ca2+ aktivitetsspor av GCaMP6s-merkede nevroner på en dybde på 750 μm for en 10 min opptaksøkt, som viser høy opptaksgjengivelse.
Hvis eksitasjonslaseren er feiljustert, kan avvik i signallysstyrken over synsfeltet observeres. I tillegg, hvis laserparametrene, for eksempel pulsvarigheten, eksitasjonspulsenergien i fokus og den effektive NA, ikke er optimalisert, vil THG-bildet fra fiskeskallen eller kraniotomivinduet i musehjernen ikke være synlig og / eller krever høy eksitasjonspulsenergi (f.eks. >2 nJ / puls i fokus). Derfor kan THG-signalene på hjerneoverflaten brukes som en indikator for et optimalisert 3PM-oppsett før du starter dypvevsavbildning.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> Figur 1: Skjematisk illustrasjon av et oppsett kl. 15.00. Bølgelengden til eksitasjonslaseren er satt til ~ 1300 nm eller ~ 1700 nm, utgang fra idlerporten til NOPA. Prismeparkompressoren og Si-platekompressoren brukes til henholdsvis ~ 1300 nm og ~ 1700 nm laser for å prechirp eksitasjonslaserpulsen. Laserstrålene ~1300 nm og ~1700 nm kan byttes med flipperspeil. Signalporten til NOPA brukes til å innhente utløsersignalet. En halv bølgeplate og en PBS brukes til å kontrollere eksitasjonskraften. Fluorescens og THG oppdages av GaAsP PMTs. Passende kombinasjoner av dikroiske speil og bandpassfiltre brukes til å skille fluorescens- og THG-signalene. Forkortelser: 15:00 = tre-foton mikroskopi; NOPA = ikke-kollineær optisk parametrisk forsterker; PBS = polariserende strålesplitter; THG = tredje harmonisk generasjon; DAQ = datainnsamling; PMT = fotomultiplikatorrør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> Figur 2: Representative skjermbilder for intravital avbildning i fisk (protokolldel 4.1). (A) Kameramodusvisning av bildeanskaffelsesprogramvaren med 4x objektiv på plass. Viktige funksjoner i programvaren er skissert og nummerert som følger: 1. Bildemodus for bildeinnhentingsprogramvaren. Modusalternativene er Kamera, Multifoton og Multiphoton GG. For hvitt lysbilde med CCD-kamera er kameramodus valgt. 2. Ved å klikke på Live-knappen slås kameraet (eller PMTs hvis i multifoton alternativer), og en sanntidsvisning av mikroskopet kan observeres. 3. I kategorien Opptaksoppsett er de ønskede bildebehandlingsparametrene (strøm, plassering, dybde) angitt. 4. I Capture-fanen tilordnes en mappeplassering for bildene som skal lagres. Bildet kan startes i denne kategorien. Z Control-innstillingen styrer bildedybden ved å flytte z-trinnmotoren. 6. Representativt bilde av et sebrafiskhode. Rostralsiden av hodet er til venstre. (B) Representativ visning av kameramodus med 25x objektiv. (C) Representativ visning av Multiphoton GG-modus som inneholder THG-bildet av bildet sett i (B). Forkortelser: CCD = lade-koblet enhet; PMT = fotomultiplier rør; THG = tredje harmonisk generasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> Figur 3: Representative bilder av den voksne sebrafiskhjernen som er anskaffet med bildeinnhentingsprogramvaren. (A) Kameramodusbilde av voksen sebrafiskhode ervervet med en 4x objektiv linse. Toppen av bildet er rostralretningen. OT-lobene og CB er skissert. (B) Representativt bilde ervervet i Multiphoton GG-modus med et 25x objektiv som inneholder THG-bildet av (A). (C) Fluorescensbilder av voksen sebrafiskhjerne i skjæringspunktet mellom cerebellum og det optiske tectum der GFP uttrykkes i cytoplasma av nevroner i ulike dybder. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: OT = optisk tectam; CB = cerebellum; THG = tredje harmonisk generasjon; GFP = grønt fluorescerende protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> Figur 4: Flerfarget 15:00 av GCaMP6s-merkede nevroner (grønn), Texas Rødmerkede blodårer (rød) og tredje harmonisk generasjon (blå) ved 1340 nm eksitasjon i musehjernen. (A) Z-stack-bilder ned til 1200 μm fra hjerneoverflaten med et synsfelt på 270 x 270 μm (512 x 512 piksler per ramme). Lasereffekten ble variert i henhold til bildedybden for å opprettholde ~ 1,5 nJ pulsenergi i fokus. Maksimal gjennomsnittlig effekt under målet var 70 mW. (B) Valgte 2D-bilder på ulike bildedybder. (C) Aktivitetsregistreringssted på 750 μm under dura med et synsfelt på 270 x 270 μm (256 x 256 piksler). (D) Spontane hjerneaktivitetsspor registrert i en våken mus fra de merkede nevronene som er angitt i (C). Bildefrekvensen var 8,3 Hz, med en pikselboetid på 0,51 μs. Laserrepetisjonshastigheten var 2 MHz, og den gjennomsnittlige effekten under objektivet var 56 mW. Hvert spor ble normalisert til grunnlinjen og lavpass filtrert ved hjelp av et hammingvindu på 0,72s tidskonstant. Skalastenger = 50 μm. Denne figuren og figurlegenden er gjengitt fra 10. Forkortelse: 15:00 = tre-foton mikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> Figur 5: Effektiv dempingslengde i neocortex i musehjernen. EAL (magenta linje) beregnes fra vevspredning (rød linje) og vannabsorpsjon i vevet (blå linje), forutsatt 75% vannsammensetning. De svarte stjernene indikerer rapporterte eksperimentelle data fra EAL i neocortex av musehjernen 3,21,28,29. Vær oppmerksom på at EAL varierer i forskjellige vev. Forkortelse: EAL = effektiv dempingslengde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Eksitasjon bølgelengde (nm)</td>
			<td>Nedsenking vann</td>
			<td>Maksimal lasereffekt (mW)</td>
			<td>Maksimal pulsenergi i fokus* (nJ)</td>
			<td>Typisk EAL i musebarken (μm)</td>
			<td>Bildedybde i musebarken** (mm)</td>
			<td>Pulsenergi under målet*** (nJ)</td>
			<td>Maksimal laserrepetisjonshastighet**** (MHz)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O eller D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Typiske 3P eksitasjonsforhold for musebarkavbildning. *Med et høyt NA-mål (~1.0), pulsbredde på ~50 fs og typiske fluoroforer som fluorescerende proteiner (f.eks. GFP og RFP). ** Med antagelsen om at EAL er ensartet i hele cortex. For å oppnå ~1 nJ/puls i fokus, beregnet fra EAL og bildedybden. Beregnet ut fra pulsenergien under målet og maksimal tillatt lasereffekt. Forkortelser: 3P = tre-foton; IT = numerisk blenderåpning. GFP = grønt fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; EAL = effektiv dempingslengde.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Tre-foton mikroskopi muliggjør fluorescensavbildning med høy kontrast dypt i levende biologisk vev, som mus- og sebrafiskhjerner, med høy romlig oppløsning.

Dypvev tre-foton fluorescens mikroskopi i intakt mus og sebrafisk hjerne

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Protokollen illustrerer hvordan man utfører in vivo dypvev tre-foton mikroskopi i musehjerne og voksen sebrafisk. To viktige modellsystemer innen biovitenskap. Trefotonmikroskopi med lang bølgelengde muliggjør in vivo høy romlig oppløsningsavbildning av intakt vev eller organer på dybder som er utilgjengelige ved to-fotonmikroskopi.Denne teknikken kan hjelpe oss med å forstå de underliggende mekanismene for nevrologiske sykdommer, som Alzheimers og autisme, hvor en fullstendig forståelse av hvordan sykdommen påvirker hjernen mangler. Å demonstrere musens hjerneavbildningsprosedyre vil være Kibaek Choe, postdoktoren fra laboratoriet vårt og demonstrere sebrafiskhjernens avbildningsprosedyre vil være Kristine Kolkman, en forskningsmedarbeider fra Fetcho Research Laboratory. Til å begynne med, slå på laseren og still inn senterbølgelengden til tomgangsutgangen til den ikke-collineære optiske parametriske forsterkeren ved 1, 300 eller 1700 nanometer, og plasser deretter pulskompressorer på lysbanen for å pre-chirp femtosecond laseren og optimalisere pulsvarigheten for tre-foton bildebehandling.Still inn vinkelen mellom silisiumplaten og laserbanen i Brewsters vinkel for å maksimere laseroverføringen, og roter deretter silisiumplaten for å oppnå Brewsters vinkel ved å minimere refleksjonen. Deretter plasserer du flipperspeil for å enkelt bytte mellom 1,300 og 1700-nanometer bjelkelinjer. Plasser en halv bølgeplate montert på et rotasjonsstadium og en polariserende strålesplitter for å kontrollere laserens intensitet, og plasser deretter en stråleblokkering i refleksjonsbanen til strålesplitteren.Forbered en Petri-tallerken med 0,5 centimeter 2% høysmeltende punktagar. Når agaren er avkjølt og størknet, kutt et rektangulært hull i agaren lenger og litt bredere enn fisken. Bruk voks, fest tynne slanger til Petri-parabolen med den ene enden i rektangelet og en rør med større diameter til kanten av Petri-parabolen.Deretter bedøver du fisken ved å plassere den i en 0,2 milligram per milliliter trikainoppløsning, legg deretter den bedøvede fisken på siden på en våt svamp, og bruk deretter en mikrosyringe, retro-orbitally injisere 3 mikroliter pancuroniumbromid for å lamme fisken og kort plassere den i Hanks løsning for å sikre at den er helt lammet. Deretter legger du fiskedrsalsiden opp i Petri-parabolen med hodet mot slangen, deretter bruker tang, åpner fiskens munn forsiktig og skyver slangen inn i munnen. Skyv fisken forsiktig mot slangen slik at slangen vil være på baksiden av fiskens munn.Tørk agaren raskt, men forsiktig rundt fisken og fjern vannet på toppen av fisken. Dypp et lite stykke laboratorievev i laboratorielim og legg vevet på agaren på begge sider av fisken og over fiskens rygg caudal til gjellene. Deretter bedøver du fiskens hud ved å plassere en liten dråpe bupivacaine direkte på overflaten av hodet, og ta deretter Petri-parabolen med fisken til mikroskopet.Fyll fatet med fiskeanleggsvann og koble til slangen til en vannpumpe for å pumpe systemvann inn i fiskens munn. Forsikre deg om at vannet er oksygenert med en bobler og oppvarmet til 30 grader Celsius med en akvariumvarmer. For avbildning, plasser et lavt forstørrelsesmål på tre-fotonmikroskopet, plasser deretter Petri-parabolen som inneholder fisken og rørene under mikroskopet og bruk en LED-lyskilde for å belyse Petri-parabolen.Åpne kameramodus fra programvaren for bildeanskaffelse, klikk Live, velg kanal A på høyre side av skjermen og juster histograminnstillingene for å se bildet tydelig. Når du har satt motorinnstillingen på motorstyringen til base, senker du målet til fisken er synlig. Plasser midten av fiskehodet i midten av synsfeltet, og flytt deretter målet opp og bort fra fiskens hode.Bytt ut objektivlinsen med lav forstørrelse med objektivet med høy numerisk blenderåpning for tre-foton bildebehandling, og flytt den deretter nær fiskens hode. Sett akseverdiene for alle motorer til null. Senk objektivet langsomt, og sørg for at målet ikke kommer fysisk i kontakt med hodet.I CCD-kameraprogramvaren slutter du å flytte målet når toppen av hodet er synlig og setter X-, Y- og Z-plasseringene til null. Slå av LED-lyskilden og lukk den mørke gardinen rundt systemet, sett deretter bildeinnsamlingsprogramvaren til multifoton GG-modus for tre-foton bildebehandling og sett strømmen under objektivet til mindre enn en milliwatt. Klikk på Live-knappen i bildeanskaffelsesprogramvaren.Åpne AVDRAG-kanaler og juster AVDRAG-forsterkning og bakgrunnsnivå etter behov. Beveg deg sakte opp den objektive linsen for å finne overflaten av hodet ved å overvåke THG-kanalen fra de store blodkarene og vindusglassoverflaten. Etter å ha flyttet objektivlinsen nær vinduet, bruk vann mellom målet og kranialvinduet, og sett deretter akseverdiene til alle motorer til null.Klikk på Live-knappen i bildeanskaffelsesprogramvaren. Åpne PMT-kanaler og juster PMT-forsterkningen og bakgrunnsnivået etter behov, og beveg deretter sakte opp objektivet for å finne overflaten på dekselslippet ved å overvåke THG-kanalen fra de store blodkarene og vindusglassoverflaten. Juster vindusretningen om nødvendig, og nullstill deretter motorene for å definere overflaten av hjernen.Utfør bildebehandling og juster effektnivået i henhold til bildedybden. Høyoppløselig, ikke-invasiv og dyp avbildning av genetisk merkede nevroner i den voksne sebrafiskhjernen oppnås ved hjelp av tre-fotonmikroskopi. Fordelingen av cellelag i det optiske tectum og cerebellum kan også observeres.Kamerafunksjonen til mikroskopet ble brukt til å finne fisken. Skallen er sett i THG-kanalen, som hjelper til med å navigere i hjernen og finne toppoverflaten. Nevroner skiller seg ut med et høyt signal-til-bakgrunn-forhold dypt i den voksne hjernen.Flerfargede trefotonbilder av GCaMP6s-merkede nevroner og Texas Red-merkede blodkar sammen med THG-signaler i den voksne musehjernen vises her. Med oppsettoptimalisering ble bilder med høy kontrast oppnådd ned til 1,2 millimeter fra hjerneoverflaten i CA1 hippocampus-regionen. Kalsiumaktivitetsspor av GCaMP6s-merkede nevroner på en dybde på 750 mikrometer for en 10-minutters opptaksøkt viste høy opptaksgjengivelse.Dette oppsettet kan bidra til å visualisere nevronaktivitet for å forstå hjernefunksjonen. Det kan også brukes til å spore cellebevegelser i biologisk vev for å forstå ulike biologiske systemer. I tillegg kan blodstrømshastigheten også måles for å overvåke dyrets helse.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton Mikroskopi av Slettet Mouse Brain Uttrykke YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektro opptak i hjernen til Intakt Adult Sebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em&gt; Å studere nevrale morfologi og migrasjon

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell for å studere aksonal vekst mønstre og morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rensing av musehjerne Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

I vivo Imaging av spinal Fluid transport gjennom intakt Mouse Skull bruker fluorescens Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Helhjerne enkeltcelleavbildning og analyse av intakte neonatale musehjerner ved bruk av MR, vevsrydding og lysarkmikroskopi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...