Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub e NIH 1U01NS103516.

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Os autores não declaram interesses concorrentes.

Este protocolo explica os procedimentos passo a passo para a configuração de imagens 3P com uma fonte comercial de microscópio e laser. Em comparação com as 14h, o 3PM tem uma vantagem em aplicações que requerem acesso óptico nas regiões mais profundas, como no hipocampo cerebral do camundongo. Embora o 3PM seja usado principalmente na neurociência, o 3PM pode ser potencialmente aplicado em outros tecidos, como linfonodos, ossos e tumores para observação de tecidos profundos.
É importante verificar se o sistema de imagem funciona próximo ao limite de ruído de tiro, o que garante que os eletrônicos de detecção e aquisição de dados contribuam com ruídos insignificantes para a imagem após os PMTs. A incerteza no número de fótons detectados é fundamentalmente limitada pelo ruído de tiro de fóton. O desempenho limitado com ruído de tiro pode ser alcançado em um microscópio multifotônio típico usando um fotodetetor de alto ganho (por exemplo, um PMT). O ruído do tiro de fóton segue uma distribuição estatística de Poisson, em que o desvio padrão da distribuição é igual à raiz quadrada da média da distribuição. Para verificar o desempenho limitado do ruído de tiro, siga o passo 1.14 na seção protocolo.
Para evitar atenuação leve por H2O, usar D2O para imersão é útil, particularmente para a excitação de ~1.700 nm. Quando D2O é usado, é essencial atualizar D2O a cada ~10 min ou usar um grande volume de D2O para evitar d2O/H2O troca durante a imagem. Pode-se também selar o D2O do ambiente da sala3. Se uma lente objetiva de longa distância de trabalho (WD) (por exemplo, WD a 4 mm ou mais) for usada para imagem, a espessura líquida de imersão pode exceder 2-3 mm. O aumento da espessura torna a absorção H2O não desprezível mesmo em ~1.300 nm21. Portanto, D2O pode ser necessário mesmo para 1.300 nm 3PM ao usar uma lente objetiva WD longa.
Como a intensidade da fluorescência 3P depende do cubo da energia do pulso de excitação no foco (Eq. (1)), definir a potência laser apropriada é particularmente importante para obter sinais adequados de fluorescência 3P, evitando danos térmicos e não lineares nos tecidos vivos. A potência média do laser deve ser mantida abaixo do limiar de dano térmico. No cérebro do camundongo, por exemplo, para evitar danos nos tecidos térmicos, a potência média na superfície cerebral do camundongo deve ser mantida em ou abaixo de ~100 mW para excitação de ~1.300 nm a uma profundidade de 1 mm e com um campo de visão (FOV) de 230 μm x 230 μm21. Da mesma forma, a potência média em ~1.700 nm deve ser mantida em ou abaixo de ~50 mW a ~1 mm de profundidade e um FOV de ~230 μm x 230 μm (dados inéditos). Além disso, para evitar a saturação da excitação e possíveis danos não lineares, a energia de pulso de excitação deve ser mantida em <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2 nJ e <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 nJ por ~1.300 nm e ~1.700 nm excitação, respectivamente30.
Devido à absorção de luz e dispersão nos tecidos, a energia do pulso em foco é atenuada a 1/e (~37%) após a penetração de tecidos por 1 EAL. O EAL varia em diferentes tecidos e com os comprimentos de onda de excitação, por exemplo, no neocórtex do cérebro do camundongo, o EAL é ~300 μm e ~400 μm a ~1.300 nm e ~1.700 nm, respectivamente 3,29 (Figura 5). Portanto, para manter a mesma energia de pulso em foco (por exemplo, 1 nJ/pulso) a uma profundidade de n EALs, a energia de pulso da superfície precisa ser multiplicada por 1 nJ × en. Para imagens rápidas de dinâmica estrutural e funcional, um laser de excitação com uma alta taxa de repetição (a 1 MHz ou superior) é desejável alcançar uma alta taxa dequadros 5,6,7,10. No entanto, a exigência de energia de pulso e o limite médio de energia do laser restringem a taxa de repetição aplicável.
Por exemplo, quando percebemos uma região moderadamente profunda em 4 EALs (ou seja, ~1,2 mm no córtex do mouse com excitação de 1.300 nm), ~55 nJ/pulso na superfície é necessário para manter 1 nJ/pulso em foco. Quando a limitação média de energia é de 100 mW, podemos aplicar uma taxa de repetição de laser de ~2 MHz. No entanto, para imagem mais profunda a uma profundidade de 7 EALs, ~1.100 nJ/pulse é necessário na superfície para manter 1 nJ/pulso em foco. Supondo que a potência média máxima seja de 100 mW para evitar danos térmicos, a taxa de repetição do laser deve ser reduzida para 0,1 MHz para alcançar um 1.100 nJ/pulso na superfície. A Tabela 1 resume as condições típicas de imagem no córtex cerebral do camundongo. Observe que as profundidades de imagem na Tabela 1 assumem que o EAL é uniforme em todo o córtex do mouse.
Além disso, devido à limitação de energia do laser no tecido profundo 3PM, existe uma troca entre a taxa de quadros e o tamanho do pixel de imagem, o que é particularmente importante para imagens funcionais, como a imagem de cálcio. A taxa máxima de repetição do laser disponível é decidida em cada profundidade com base na energia de pulso necessária em foco e na potência média de laser aplicável como discutido acima, por exemplo, 2 MHz a uma profundidade equivalente a ~4 EALs com excitação de 1.300 nm. Em geral, a imagem requer pelo menos um pulso por pixel. Assim, o tempo mínimo disponível para o pixel é determinado pela taxa de repetição do laser, por exemplo, 0,5 μs/pixel com excitação de 2 MHz.
Para manter a alta resolução espacial (~1 μm na lateral) em imagens 3P, é ideal definir 1 pixel para uma área de ~1 μm2, por exemplo, 256 x 256 pixels para um FOV de 250 x 250 μm2. Assim, para realizar imagens rápidas com um FOV consideravelmente grande (por exemplo, 250 x 250 μm2 com 256 x 256 pixels), taxas de repetição de pulso de 0,5 MHz, 1 MHz e 2 MHz dão taxas teóricas de quadros máximos de ~7,6, ~15 e ~30 quadros/s, respectivamente. Da mesma forma, a otimização da taxa de repetição do laser é essencial, dependendo da profundidade do alvo, velocidade de varredura e FOV, para aplicar energia de pulso adequada sob o limiar de dano térmico. Para aumentar a velocidade de imagem, uma fonte de excitação adaptativa pode ser usada para concentrar todos os pulsos de excitação nos neurônios (ou seja, regiões de interesse) fornecendo pulsos laser sob demanda para os neurônios31.
3PM é vantajoso quando comparado com 2PM em imagens profundas dentro de tecidos vivos e através de mídias altamente dispersas, como um crânio, ossos e a camada de matéria branca (ou seja, a cápsula externa) do cérebro do camundongo. O EAL mais longo e a excitação não linear de 3PE beneficia a imagem de tecido profundo. Por exemplo, para imagem GCaMP6 no córtex do mouse, o sinal de fluorescência 2P com excitação de 920 nm é maior que o sinal de fluorescência de 3P com excitação de 1.300 nm em regiões rasas a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">690 μm (ou seja, ~2,3 EALs a 1.300 nm)21. No entanto, devido ao EAL mais longo em 1.300 nm em comparação com 920 nm, 3PE dá fluorescência mais forte do que excitação 2P (2PE) a uma profundidade de ~690 μm emais profundo 21. Esta profundidade é definida como "profundidade de crossover de sinal", na qual os pontos fortes do sinal de fluorescência de 2PE e 3PE são idênticos com a mesma taxa de repetição e os mesmos poderes médios permitidosmáximos 21. A profundidade do cruzamento de sinal depende dos comprimentos de onda de excitação para 2PE e 3PE e o fluoróforo.
Na prática, a excitação de 920 nm permite maior potência média do laser do que 1.300 nm excitação devido à menor absorção de água. No entanto, a maior potência média de 2PE empurraria a profundidade do crossover de sinal apenas em 0,9 EALs4. Além disso, quando a amostra é densamente rotulada, o 3PE tem a vantagem adicional de SBR muito maior. Portanto, mesmo antes de atingir o comprimento do crossover do sinal, o 3PM pode ser melhor para imagens do que 14:00. Por exemplo, ao imaginar a vasculatura cerebral do camundongo, que tem uma fração de volume (ou seja, densidade de rotulagem) de ~2%, 1.300 nm 3PM com poder de excitação de 100 mW supera 920 nm 2PM com 200 mW de poder de excitação a uma profundidade de ~700 μm para fluoresceína.
3PM também tem uma vantagem ao fotografar através de uma camada fina, mas altamente dispersa que pode distorcer a função de propagação de pontos do feixe de excitação e gerar um fundo de desfocal4. Por exemplo, através do crânio intacto do cérebro do camundongo, as imagens das 2PM sofrem do fundo de desfoco mesmo na profundidade rasa de <100 μm da superfície cerebral13. Um fundo de desfoco semelhante foi observado em 2PM com excitação de 1.280 nm através da matéria branca no cérebro do camundongo32. Portanto, quando os tecidos são imagens através de camadas turvas, 3PM é preferível às 14:00 para imagens de alto contraste, independentemente da densidade de rotulagem.
Recentemente, relatamos uma análise fantasma e teórica de contas mostrando que o limite de profundidade de imagem de 3PM é superior a 8 EALs33; 8 EALs são equivalentes a ~3 mm com ~1.700 nm de excitação no córtex do mouse. No entanto, o laser atualmente disponível não tem energia de pulso suficiente para alcançar 8 EALs no cérebro do camundongo. O desenvolvimento adicional de lasers mais fortes empurrará o limite atual de profundidade de imagem de 3PM.

Na ciência da vida, técnicas de microscopia multifotual (MPM), como 14h e 15h, têm sido ferramentas poderosas para imagens profundas in vivo com alta resolução espacial e alto contraste em tecidos de dispersão. Além disso, esses métodos causam menos fotobleaching quando comparados à microscopia confocal de um fóton 1,2,3,4. 3PM é vantajoso para imagens de tecido mais profundo quando comparado com 2PM devido a duas características principais: (i) o emprego de excitação de comprimento de onda mais longo (~1.300 nm ou ~1.700 nm) reduz a dispersão tecidual, e (ii) o processo de excitação de ordem superior (ou seja, o sinal de fluorescência depende do cubo do poder de excitação em 3PM em vez do quadrado do poder de excitação em 2PM) que suprime a fluorescência de fundo indesejada3 . Consequentemente, o 3PM permite imagens de alto contraste em regiões mais profundas em tecidos vivos, como o hipocampo em um cérebro de camundongo adulto intacto 3,5,6,7,8,9,10,11 e todo o cérebro de zebrafish adulto12, incluindo Ca2+ registro de atividades e observações multicoloridas. Além disso, imagens de alto contraste foram obtidas com 3PM através dos crânios intactos de camundongos e zebrafishadultos 12,13.
Hoje, fontes de laser de excitação adequadas para excitação 3P (3PE) a ~1.300 e ~1.700 nm estão disponíveis comercialmente. Como o sistema de varredura a laser é essencialmente o mesmo para 14:00 e 15:00, a conversão de uma configuração 2P existente em uma configuração 3P é possível em laboratórios de biologia com a instalação de um laser comercialmente disponível para 3PE. O sinal de fluorescência 3P depende da potência do laser, duração do pulso, taxa de repetição do laser e abertura numérica (NA) da lente objetiva. Assumindo um foco limitado de difração (ou seja, a abertura traseira da lente objetiva é superabastecida pelo feixe de excitação), Eq (1) descreve o fluxo de fótons de fluorescência mediana do volume focal resultante do 3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Quando f é a taxa de repetição do laser, τ é a duração do pulso do laser (largura total à metade do máximo), φ é a eficiência de coleta do sistema, η é a eficiência quântica da fluorescência, σ3 é a seção transversal de absorção 3P, C é a concentração fluorhoreop, n0 é o índice reflexivo do meio amostral (por exemplo, água), λ é a onda de excitação no vácuo, Na é a abertura numérica da lente objetiva, um3 é a constante de integração espacial do volume focal, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> é o fluxo de fóton de excitação (fótons/s) com média de tempo sob a lente objetiva, z é a profundidade imagem, e EAL é o comprimento de atenuação eficaz14. Aqui assumimos que o EAL (tipicamente > 100 μm) é muito maior do que a resolução axial do microscópio (tipicamente < 10 μm). Sob aproximação paraxial, um3 é igual a 28.114. g(3) é a coerência temporal de3ª ordem da fonte de excitação, e gp(3) é 0,41 e 0,51 para pulsos hiperbólicos-secant-quadrados e pulsos gaussianos, respectivamente. A eficiência da coleta φ pode ser estimada considerando a coleta de fluorescência pela lente objetiva, transmissão da lente objetiva, a refletividade do espelhodicróico, a transmissão dos filtros e a eficiência de detecção do detector (por exemplo, tubo fotomultiplier ou PMT). Como a intensidade de fluorescência 3P é altamente dependente de vários parâmetros, a otimização da configuração 3P é necessária para maximizar os sinais de fluorescência 3P.
Este protocolo ilustra o processo de otimização de uma configuração típica de 3P, que será útil especialmente para laboratórios de biologia que têm uma configuração 2P e planejam expandir sua capacidade para imagens 3P ou manter sua configuração comercial 3P em ótimo desempenho. Este artigo de vídeo também demonstra imagens 3P de tecido profundo em cérebros animais vivos. A primeira seção aborda a otimização de uma configuração típica de 3P com uma fonte laser comercialmente disponível e microscópio multifotônio. A segunda e terceira seções descrevem a preparação de zebrafish e camundongos, respectivamente, para 3PM de estruturas e atividades neuronais. A cirurgia de craniotomia do camundongo foi previamente relatada em documentos de protocolo, bem como 15,16,17. A quarta seção demonstra imagens intravital 3P em zebrafish e cérebros de camundongos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

As técnicas de microscopia multifotúr, como microscopia de dois fótons (2PM) e microscopia de três fótons (3PM), são ferramentas poderosas para imagens in vivo de tecido profundo com resolução subcelular. 3PM tem duas grandes vantagens para a imagem de tecido profundo acima de 2PM que tem sido amplamente utilizado em laboratórios de biologia: (i) maior comprimento de atenuação em tecidos de dispersão, empregando ~1.300 nm ou ~1.700 nm laser de excitação; (ii) menor geração de fluorescência de fundo devido à excitação não linear de alta ordem. Como resultado, o 3PM permite imagens estruturais e funcionais de alto contraste profundamente dentro de tecidos de dispersão, como cérebro de rato intacto das camadas corticais para o hipocampo e todo o cérebro de zebrafish adulto.
Hoje, fontes de laser adequadas para 3PM estão disponíveis comercialmente, permitindo a conversão de um sistema de imagem de dois fótons (2P) existente para um sistema de três fótons (3P). Além disso, vários microscópios comerciais 3P estão disponíveis, o que torna essa técnica prontamente disponível para laboratórios de pesquisa em biologia. Este artigo mostra a otimização de uma configuração típica de 3PM, particularmente visando grupos de biologia que já possuem uma configuração 2P, e demonstra imagens 3D intravital em cérebros de camundongos intactos e zebrafish adultos. Este protocolo abrange o procedimento experimental completo de imagens 3P, incluindo alinhamento de microscópio, pré-chir de ~1.300 e ~1.700 nm de pulsos laser, preparação animal e imagens de fluorescência intravital 3P profundas em zebrafish adultos e cérebros de camundongos.

A conclusão bem sucedida deste protocolo resultará em um microscópio devidamente alinhado com parâmetros de luz ideais (por exemplo, duração do pulso, NA) e preparações animais apropriadas para in vivo 3PM. A configuração 3P comercialmente disponível compreende espelhos e lentes apropriados para ~1.300 nm e ~1.700 nm; portanto, nenhuma alteração na óptica é necessária quando o comprimento de onda de excitação é alternado entre 1.300 nm e 1.700 nm. Se as lentes em uma configuração 3P não tiverem um revestimento adequado para 1.300 e 1.700 nm, estas precisam ser substituídas por as apropriadas para reduzir a perda de energia a laser. Com o otimizado 3PM e a preparação adequada dos animais, imagens de fluorescência in vivo e THG com alto contraste podem ser coletadas profundamente dentro do cérebro.
A Figura 3 mostra imagens representativas 3P de zebrafish adultos intactos. Imagens de alta resolução, não invasivas e profundas de neurônios geneticamente rotulados no cérebro adulto de zebrafish são alcançadas usando 3PM. Embora a imagem na região do telencephalon tenha sido relatada no cérebro adulto de zebrafish usando2PM 24,25,26,27, o 3PM permite o acesso a toda a teleencefalia e regiões mais desafiadoras ou impossíveis de observar usando outras técnicas. A distribuição de camadas celulares no tectum óptico e no cerebelo pode ser observada na Figura 3C. Em uma sessão de imagem bem sucedida, o osso é visível no canal THG e neurônios visíveis no canal de fluorescência. Para imagens de zebrafish adultos, a característica da câmera do microscópio foi usada para localizar o peixe (Figura 3A). Este passo não é necessário para a imagem cerebral do rato, pois a janela de vidro é grande o suficiente para tornar o cérebro facilmente acessível. Imagens estruturais de alta resolução do cérebro de zebrafish adulto foram obtidas utilizando-se o sistema descrito nas seções anteriores. O crânio é visto no canal THG (Figura 3B), que ajuda a navegar pelo cérebro e encontrar a superfície superior. Como observado na Figura 3C, os neurônios são distinguíveis com uma alta relação sinal-fundo (SBR) profundamente no cérebro adulto. O tecido acima do cérebro é visível no canal de fluorescência devido à autofluorescência.
A Figura 4 mostra imagens multicoloridas 3P de neurônios rotulados por GCaMP6s (verde) e vasos sanguíneos rotulados por vermelho do Texas (vermelho) juntamente com sinais THG (azul) no cérebro de camundongo adulto com excitação de 1.340 nm10. As imagens são reproduzidas a partir de trabalhos anteriores10. Na Figura 4, a energia de pulso em foco foi mantida em ~1,5 nJ em toda a profundidade para obter fluorescência suficiente e sinais de THG, e a potência média máxima do laser foi de ~70 mW. A duração do pulso foi ajustada para ~60 fs, e o NA efetivo foi ~0,8. Com a otimização da configuração 3PM, imagens de alto contraste foram obtidas com sucesso até 1,2 mm da superfície cerebral, na região do hipocampo CA1 (Figura 4A,B). Figura 4C,D mostra traços de atividade Ca2+ de neurônios rotulados por GCaMP6s a uma profundidade de 750 μm para uma sessão de gravação de 10 minutos, mostrando alta fidelidade de gravação.
Se o laser de excitação estiver desalinhado, pode-se observar a não-uniformidade no brilho do sinal em todo o campo de visão. Além disso, se os parâmetros do laser, como a duração do pulso, a energia do pulso de excitação em foco e o NA eficaz, não forem otimizados, a imagem thg do crânio do peixe ou da janela de craniotomia do cérebro do camundongo não será visível e/ou requer alta energia de pulso de excitação (por exemplo, >2 nJ/pulso em foco). Assim, os sinais de THG na superfície cerebral podem ser usados como um indicador para uma configuração otimizada de 3PM antes de iniciar a imagem de tecido profundo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> Figura 1: Ilustração esquemática de uma configuração de 3 PM. O comprimento de onda do laser de excitação é definido em ~1.300 nm ou ~1.700 nm, saída da porta ocler do NOPA. O compressor de par de prisma e o compressor de placa Si são usados para o laser de ~1.300 nm e ~1.700 nm, respectivamente, para prechirp do pulso laser de excitação. Os raios laser de ~1.300 nm e ~1.700 nm podem ser trocados com espelhos de nadadeiras. A porta de sinal do NOPA é usada para obter o sinal de acionamento. Uma placa de meia onda e um PBS são usados para controlar o poder de excitação. A fluorescência e o THG são detectados pelos PMTs GaAsP. Combinações apropriadas de espelhosdicróicos e filtros de bandpass são usadas para separar a fluorescência e os sinais de THG. Abreviaturas: 3PM = microscopia de três fótons; NOPA = amplificador óptico não collinear paramétrico; PBS = divisor de feixe polarizador; THG = terceira geração harmônica; DAQ = aquisição de dados; PMT = tubo fotomultiplier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> Figura 2: Capturas de tela representativas para imagens intravitais em peixes (seção de protocolo 4.1). (A) Visão do modo de câmera do software de aquisição de imagens com lente objetiva 4x no lugar. As principais características do software são delineadas e numeradas da seguinte forma: 1. Modo de imagem do software de aquisição de imagens. As opções de modo são Camera, Multiphoton e Multiphoton GG. Para imagens de luz branca com câmera CCD, o modo Câmera é escolhido. 2. Clicar no botão Live liga a câmera (ou PMTs se em opções multifotonsas) e uma visão em tempo real do microscópio pode ser observada. 3. Na guia Capture Setup , os parâmetros de imagem desejados (potência, localização, profundidade) são definidos. 4. Na guia Capturar , um local de pasta é atribuído para que as imagens sejam salvas. A imagem pode ser iniciada nesta aba. A configuração Z Control controla a profundidade da imagem movendo o motor do estágio Z. 6. Imagem representativa de uma cabeça de zebrafish. O lado rostral da cabeça está à esquerda. (B) Visão representativa do modo câmera com lente objetiva de 25x. (C) Visão representativa do modo Multiphoton GG contendo a imagem THG da imagem vista em (B). Abreviaturas: CCD = dispositivo acoplado a carga; PMT = tubo fotomultiplier; THG = terceira geração harmônica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> Figura 3: Imagens representativas do cérebro de zebrafish adulto adquirido com o software de aquisição de imagens. (A) Imagem do modo câmera da cabeça de zebrafish adulto adquirida com uma lente objetiva de 4x. O topo da imagem é a direção rostral. Os lóbulos OT e CB estão descritos. (B) Imagem representativa adquirida no modo Multiphoton GG com uma lente objetiva de 25x contendo a imagem THG de (A). (C) Imagens de fluorescência do cérebro de zebrafish adulto na intersecção do cerebelo e do tectum óptico onde o GFP é expresso em citoplasma de neurônios em várias profundidades. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: OT = tectam óptico; CB = cerebelo; THG = terceira geração harmônica; GFP = proteína fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> Figura 4: Multicolor 3PM deneurônios rotulados GCaMP 6 (verde), vasos sanguíneos rotulados por vermelho texas (vermelho) e terceira geração harmônica (azul) sobre excitação de 1.340 nm no cérebro do camundongo. (A) Imagens de pilha de Z até 1.200 μm da superfície cerebral com um campo de visão de 270 x 270 μm (512 x 512 pixels por quadro). A potência do laser foi variada de acordo com a profundidade de imagem para manter ~1,5 nJ de energia de pulso no foco. A potência média máxima sob o objetivo foi de 70 mW. (B) Imagens 2D selecionadas em várias profundidades de imagem. (C) Local de gravação de atividade a 750 μm abaixo da dura dura com um campo de visão de 270 x 270 μm (256 x 256 pixels). (D) Traços de atividade cerebral espontânea registrados em um camundongo acordado a partir dos neurônios rotulados indicados em (C). A taxa de quadros foi de 8,3 Hz, com um tempo de 0,51 μs de pixel. A taxa de repetição do laser foi de 2 MHz, e a potência média sob a lente objetiva foi de 56 mW. Cada traço foi normalizado até sua linha de base e filtrado por baixo passe usando uma janela de 0,72 s tempo constante. Barras de escala = 50 μm. Esta figura e a lenda da figura são reproduzidas a partir de 10. Abreviação: 3PM = microscopia de três fótons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> Figura 5: Comprimento de atenuação eficaz no neocórtex do cérebro do camundongo. O EAL (linha magenta) é calculado a partir da dispersão tecidual (linha vermelha) e da absorção de água no tecido (linha azul), assumindo 75% de composição de água. As estrelas negras indicam dados experimentais relatados de EAL no neocórtex do cérebro do camundongo 3,21,28,29. Observe que o EAL varia em diferentes tecidos. Abreviação: EAL = comprimento de atenuação eficaz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Comprimento de onda de excitação (nm)</td>
			<td>Água de imersão</td>
			<td>Potência máxima do laser (mW)</td>
			<td>Energia máxima de pulso em foco* (nJ)</td>
			<td>EAL típico no córtex do mouse (μm)</td>
			<td>Profundidade de imagem no córtex do rato** (mm)</td>
			<td>Energia de pulso sob o objetivo*** (nJ)</td>
			<td>Taxa máxima de repetição de laser**** (MHz)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O ou D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Condições típicas de excitação 3P para imagens do córtex do rato. *Com um objetivo de NA (~1.0) alto, largura de pulso de ~50 fs, e fluoroforos típicos, como proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP e RFP). ** Com a suposição de que o EAL é uniforme em todo o córtex. Para alcançar ~1 nJ/pulso em foco, calculado a partir do EAL e da profundidade de imagem. Calculado a partir da energia de pulso sob o objetivo e a potência laser permissiva máxima. Abreviaturas: 3P = três fótons; NA = abertura numérica; GFP = proteína fluorescente verde; RFP = proteína fluorescente vermelha; EAL = comprimento de atenuação eficaz.

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Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

A microscopia de três fótons permite imagens de fluorescência de alto contraste profundamente em tecidos biológicos vivos, como cérebros de camundongos e zebrafish, com alta resolução espacial.

Microscopia de fluorescência de três fótons profundos em rato intacto e cérebro de zebrafish

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

O protocolo ilustra como realizar microscopia de três fótons in vivo no cérebro do camundongo e zebrafish adulto. Dois sistemas de modelos importantes em ciências da vida. Microscopia de três fótons de comprimento de onda longa permite imagens in vivo de alta resolução espacial de tecidos ou órgãos intactos em profundidades inacessíveis por microscopia de dois fótons.Essa técnica pode nos ajudar a entender os mecanismos subjacentes de doenças neurológicas, como Alzheimer e autismo, onde falta uma compreensão completa de como a doença afeta o cérebro. Demonstrando o procedimento de imagem cerebral do camundongo estará Kibaek Choe, o pesquisador de pós-doutorado do nosso laboratório e demonstrando o procedimento de imagem cerebral de zebrafish será Kristine Kolkman, uma pesquisadora associada do Laboratório de Pesquisa Fetcho. Para começar, ligue o laser e coloque o comprimento de onda central da saída oclíctica do amplificador óptico não collinear paramétrico em 1, 300 ou 1.700 nanômetros, em seguida, coloque compressores de pulso no caminho da luz para pré-chirp o laser femtosegundo e otimize a duração do pulso para imagens de três fótons.Defina o ângulo entre a placa de silício e o caminho laser no ângulo de Brewster para maximizar a transmissão a laser e gire a placa de silício para alcançar o ângulo de Brewster minimizando o reflexo. Em seguida, coloque espelhos de nadadeira para alternar convenientemente entre as linhas de feixe de 1.300 e 1.700 nanômetros. Coloque uma meia onda montada em um estágio de rotação e um divisor de feixe polarizador para controlar a intensidade do laser, em seguida, coloque um bloqueador de feixe no caminho de reflexão do divisor de feixes.Prepare uma placa de Petri com 0,5 centímetros de ágar de ponto de fusão de 2%. Uma vez que o ágar tenha esfriado e solidificado, corte um orifício retangular no ágar mais longo e ligeiramente mais largo que o peixe. Usando cera, conecte tubos finos à placa de Petri com uma extremidade no retângulo e uma tubulação de maior diâmetro à borda da placa de Petri.Em seguida, anestesiar o peixe colocando-o em uma solução de tricaine de 0,2 mililiter, em seguida, coloque o peixe anestesiado de lado em uma esponja molhada, em seguida, usando uma microsinga, retro-orbitalmente injetar 3 microliters de brometo de pancurônio para paralisar o peixe e colocá-lo brevemente na solução de Hank para garantir que ele está totalmente paralisado. Em seguida, coloque o peixe dorsal-side na placa de Petri com a cabeça em direção ao tubo, em seguida, usando fórceps, abra suavemente a boca do peixe e deslize o tubo para a boca. Deslize suavemente o peixe em direção à tubulação para que a tubulação fique na parte de trás da boca do peixe.Rápido, mas suavemente, seque o ágar ao redor do peixe e remova a água em cima do peixe. Mergulhe um pequeno pedaço de tecido de laboratório em cola de laboratório e coloque o tecido no ágar em ambos os lados do peixe e sobre as costas do peixe caudal para as brânquias. Em seguida, anestesiar a pele do peixe colocando uma pequena gota de bupivacaína diretamente na superfície da cabeça, em seguida, leve a placa de Petri com o peixe para o microscópio.Encha o prato com água da instalação de peixes e conecte-se à tubulação a uma bomba de água para bombear água do sistema na boca do peixe. Certifique-se de que a água é oxigenada com um borbulhante e aquecida a 30 graus Celsius com um aquecedor de aquário. Para a imagem, coloque um objetivo de baixa ampliação no microscópio de três fótons, em seguida, coloque a placa de Petri contendo o peixe e os tubos sob o microscópio e use uma fonte de luz LED para iluminar a placa de Petri.A partir do software de aquisição de imagens, abra o modo Câmera, clique em Live, escolha o canal A no lado direito da tela e ajuste as configurações do histograma para ver a imagem claramente. Depois de definir a configuração do motor no controlador do motor para basear, abaixe o objetivo até que o peixe esteja visível. Coloque o centro da cabeça de peixe no centro do campo de visão, em seguida, mova o objetivo para cima e para longe da cabeça do peixe.Substitua a lente objetiva de baixa ampliação pela lente objetiva de abertura numérica alta para imagens de três fótons e, em seguida, mova-a para perto da cabeça do peixe. Defina os valores do eixo de todos os motores a zero. Abaixe lentamente a lente objetiva, garantindo que o objetivo não entre em contato fisicamente com a cabeça.No software da câmera CCD, pare de mover o objetivo quando a parte superior da cabeça estiver visível e definir os locais X, Y e Z como zero. Desligue a fonte de luz LED e feche a cortina escura ao redor do sistema, em seguida, defina o software de aquisição de imagens para o modo GG multifotol para imagens de três fótons e defina a energia sob a lente objetiva para menos de um miliwatt. Clique no botão Viver no software de aquisição de imagens.Abra os canais PMT e ajuste o ganho pmt e o nível de fundo conforme necessário. Mova-se lentamente para cima da lente objetiva para localizar a superfície da cabeça monitorando o canal THG a partir dos grandes vasos sanguíneos e da superfície de vidro da janela. Depois de mover a lente objetiva perto da janela, aplique água entre o objetivo e a janela craniana, em seguida, defina os valores do eixo de todos os motores a zero.Clique no botão Viver no software de aquisição de imagens. Abra os canais PMT e ajuste o ganho pmt e o nível de fundo conforme necessário, em seguida, mova-se lentamente para cima da lente objetiva para localizar a superfície do deslizamento de cobertura monitorando o canal THG a partir dos vasos sanguíneos grandes e da superfície de vidro da janela. Ajuste a orientação da janela se necessário, depois zero os motores para definir a superfície do cérebro.Realize imagens e ajuste o nível de potência de acordo com a profundidade de imagem. Imagens de alta resolução, não invasivas e profundas de neurônios geneticamente rotulados no cérebro adulto de zebrafish são alcançadas usando microscopia de três fótons. Também é observada a distribuição de camadas celulares no tectum óptico e no cerebelo.A câmera do microscópio foi usada para localizar o peixe. O crânio é visto no canal THG, que ajuda a navegar pelo cérebro e encontrar a superfície superior. Os neurônios são distinguíveis com uma alta relação sinal-fundo no cérebro adulto.Imagens multicoloridas de três fótons de neurônios rotulados por GCaMP6s e vasos sanguíneos rotulados pelo Texas Red, juntamente com sinais de THG no cérebro de camundongos adultos são mostrados aqui. Com a otimização da configuração, imagens de alto contraste foram obtidas com sucesso até 1,2 milímetros da superfície cerebral na região do hipocampo ca1. Traços de atividade de cálcio de neurônios rotulados por GCaMP6s a uma profundidade de 750 micrômetros para uma sessão de gravação de 10 minutos mostraram alta fidelidade de gravação.Essa configuração pode ajudar a visualizar a atividade neuronal para entender a função cerebral. Também pode ser usado para rastrear o movimento celular dentro do tecido biológico para entender vários sistemas biológicos. Além disso, a velocidade do fluxo sanguíneo também pode ser medida para monitorar a saúde do animal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Neurociência

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Ion Beam centrada Fresagem e Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido Cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...