Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Эта работа была поддержана NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub и NIH 1U01NS103516.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li><li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain.">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li><li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li><li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+Ca2++imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy.">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li><li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy.">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177 (2019).</li><li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain.">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li><li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser.">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science &amp; Applications. 7, 12 (2018).</li><li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain.">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots.">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull.">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li><li>Xu, C., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+of+molecular+fluorophores+and+nonlinear+laser+microscopy.">Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy.</a> Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , 471-540 (2002).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).</li><li>&#321;ukasiewicz, K., Robacha, M., Bo&#380;ycki, &. #. 3. 2. 1. ;., Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex.">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).</li><li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity.">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).</li><li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms.">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging.">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li><li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1,700+nm.">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain.">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205 (2020).</li><li>Cheng, L. -. C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -. J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy.">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li><li>Huang, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish.">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche.">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li><li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain.">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li><li>Vogel, A., Noack, J., H&#252;ttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues.">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li><li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy.">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li><li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).</li><li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy.">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Этот протокол объясняет пошаговые процедуры настройки 3P-визуализации с коммерческим микроскопом и лазерным источником. По сравнению с 2PM, 3PM имеет преимущество в приложениях, требующих оптического доступа в более глубоких областях, таких как гиппокамп мозга мыши. Хотя 3PM в основном используется в неврологии, 3PM может быть потенциально применен в других тканях, таких как лимфатические узлы, кости и опухоли для глубокого наблюдения тканей.
Важно убедиться, что система визуализации работает близко к пределу шума выстрела, что гарантирует, что электроника обнаружения и сбора данных вносит незначительный шум в изображение после PMT. Неопределенность в количестве обнаруженных фотонов фундаментально ограничена шумом фотонного снимка. Ограниченная производительность по шуму выстрела может быть достигнута в типичном многофотонном микроскопе с использованием фотоприемника с высоким коэффициентом усиления (например, PMT). Фотонный шум следует статистическому распределению Пуассона, в котором стандартное отклонение распределения равно квадратному корню среднего распределения. Чтобы проверить производительность ограниченного шума выстрела, выполните шаг 1.14 в разделе протокола.
Чтобы избежать ослабления света на H2O, полезно использовать D2O для погружения, особенно для возбуждения ~ 1 700 нм. Прииспользовании D 2O важно обновлять D2O каждые ~ 10 минут или использовать большой объем D2O, чтобы избежать обмена D2O / H2O во время визуализации. Можно также герметизировать D2O из комнатной среды3. Если для визуализации используется объектив с большим рабочим расстоянием (WD) (например, WD при 4 мм или длиннее), толщина погружной жидкости может превышать 2-3 мм. Увеличенная толщина делает поглощениеH2Oнепренебрежимо малым даже при ~1 300 нм21. Поэтому D 2 O можетпонадобитьсядаже для 1 300 нм 3PM при использовании длинного объектива WD.
Поскольку интенсивность флуоресценции 3P зависит от куба энергии импульса возбуждения в фокусе (экв. (1)), установка соответствующей мощности лазера особенно важна для получения адекватных сигналов флуоресценции 3P, избегая теплового и нелинейного повреждения в живых тканях. Средняя мощность лазера должна быть ниже порога теплового повреждения. В мозге мыши, например, чтобы избежать повреждения термической ткани, средняя мощность на поверхности мозга мыши должна поддерживаться на уровне или ниже ~ 100 мВт для возбуждения ~ 1 300 нм на глубине 1 мм и с полем зрения (FOV) 230 мкм х 230 мкм21. Аналогичным образом, средняя мощность при ~1 700 нм должна поддерживаться на уровне или ниже ~50 мВт на глубине ~1 мм и FOV ~230 мкм x 230 мкм (неопубликованные данные). Кроме того, чтобы избежать насыщения возбуждения и потенциального нелинейного повреждения, энергию импульса возбуждения следует поддерживать на уровне <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2 нДж и <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 нДж для возбуждения ~1 300 нм и ~1 700 нм соответственно30.
За счет поглощения и рассеяния света в тканях энергия импульса в фокусе ослабевает до 1/е (~37%) после проникновения в ткани 1 EAL. EAL варьируется в разных тканях и с длинами волн возбуждения, например, в неокортексе мозга мыши, EAL составляет ~ 300 мкм и ~ 400 мкм при ~ 1 300 нм и ~ 1 700 нм, соответственно 3,29 (рисунок 5). Поэтому, чтобы сохранить ту же энергию импульса в фокусе (например, 1 нДж/импульс) на глубине n EAL, энергию поверхностного импульса необходимо умножить на 1 нДж × en. Для быстрой визуализации структурной и функциональной динамики лазер возбуждения с высокой частотой повторения (на 1 МГц и выше) желателен для достижения высокой частоты кадров 5,6,7,10. Однако потребность в энергии импульса и средний предел мощности лазера ограничивают применяемую частоту повторения.
Например, когда мы визуализируем умеренно глубокую область при 4 EAL (то есть ~ 1,2 мм в коре мыши с возбуждением 1 300 нм), ~ 55 нДж / импульс на поверхности требуется для удержания 1 нДж / импульс в фокусе. Когда среднее ограничение мощности составляет 100 мВт, мы можем применить частоту лазерного повторения ~ 2 МГц. Однако для получения более глубокого изображения на глубине 7 EAL требуется ~ 1 100 нДж / импульс на поверхности для поддержания 1 нДж / импульс в фокусе. Предполагая, что максимальная средняя мощность составляет 100 мВт, чтобы избежать теплового повреждения, скорость повторения лазера должна быть уменьшена до 0,1 МГц для достижения 1 100 нДж / импульс на поверхности. В таблице 1 обобщены типичные условия визуализации в коре головного мозга мыши. Обратите внимание, что глубины визуализации в таблице 1 предполагают, что EAL является однородным во всей коре мыши.
Кроме того, из-за ограничения мощности лазера в глубоких тканях 3PM существует компромисс между частотой кадров и размером пикселя изображения, что особенно важно для функциональной визуализации, такой как кальциевая визуализация. Максимальная доступная частота повторения лазера определяется на каждой глубине на основе требуемой импульсной энергии в фокусе и применимой средней мощности лазера, как обсуждалось выше, например, 2 МГц на глубине, эквивалентной ~4 EAL с возбуждением 1 300 нм. Как правило, для визуализации требуется не менее одного импульса на пиксель. Соответственно, минимальное доступное время выдержки пикселя определяется частотой повторения лазера, например, 0,5 мкс/пиксель при возбуждении 2 МГц.
Чтобы сохранить высокое пространственное разрешение (~ 1 мкм в боковом виде) в изображениях 3P, идеально установить 1 пиксель на площадь ~ 1 мкм2, например, 256 x 256 пикселей для FOV 250 x 250 мкм2. Следовательно, для выполнения быстрой визуализации со значительно большим FOV (например, 250 x 250мкм2 с 256 x 256 пикселями), 0,5 МГц, 1 МГц и 2 МГц частоты повторения импульсов дают теоретическую максимальную частоту кадров ~ 7,6, ~ 15 и ~ 30 кадров / с соответственно. Аналогичным образом, оптимизация частоты повторения лазера имеет важное значение, в зависимости от глубины цели, скорости сканирования и FOV, для применения адекватной импульсной энергии при пороге теплового повреждения. Для увеличения скорости визуализации адаптивный источник возбуждения может быть использован для концентрации всех импульсов возбуждения на нейронах (т.е. областях, представляющих интерес) путем доставки лазерных импульсов по требованию к нейронам31.
3PM выгоден по сравнению с 2PM в глубокой визуализации в живых тканях и через сильно рассеивающие среды, такие как череп, кости и слой белого вещества (то есть внешняя капсула) мозга мыши. Более длительный EAL и нелинейное возбуждение 3PE более высокого порядка приносит пользу глубокой тканевой визуализации. Например, для изображения GCaMP6 в коре головного мозга мыши сигнал флуоресценции 2P с возбуждением 920 нм выше, чем сигнал флуоресценции 3P с возбуждением 1 300 нм в неглубоких областях при <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">690 мкм (т.е. ~ 2,3 EAL при 1 300 нм)21. Однако из-за более длительного EAL при 1 300 нм по сравнению с 920 нм, 3PE дает более сильную флуоресценцию, чем возбуждение 2P (2PE) на глубине ~ 690 мкм и глубже21. Эта глубина определяется как «глубина пересечения сигнала», при которой силы флуоресцентного сигнала 2PE и 3PE идентичны с одинаковой частотой повторения и одинаковой максимально допустимой средней мощностью21. Глубина пересечения сигнала зависит от длин волн возбуждения для 2PE и 3PE и флуорофора.
На практике возбуждение 920 нм обеспечивает более высокую среднюю мощность лазера, чем возбуждение 1 300 нм за счет меньшего поглощения воды. Однако более высокая средняя мощность 2PE увеличит глубину пересечения сигнала только на 0,9 EALs4. Кроме того, когда образец плотно маркирован, 3PE имеет дополнительное преимущество в виде гораздо более высокого SBR. Поэтому, даже до достижения длины пересечения сигнала, 3PM может быть лучше для визуализации, чем 2PM. Например, при визуализации сосудистой системы мозга мыши, которая имеет объемную долю (т.е. плотность маркировки) ~2%, 1 300 нм 3ПМ при мощности возбуждения 100 мВт превосходит 920 нм 2ПМ при мощности возбуждения 200 мВт на глубине ~700 мкм для флуоресцеина.
3PM также имеет преимущество при визуализации через тонкий, но сильно рассеивающий слой, который может исказить функцию точечного распространения пучка возбуждения и генерировать фон расфокусировки4. Например, через неповрежденный череп мозга мыши изображения 2PM страдают от расфокусированного фона даже на небольшой глубине <100 мкм от поверхности мозга13. Аналогичный фон расфокусировки наблюдался в 2 часа дня с возбуждением 1,280 нм через белое вещество в мозге мыши32. Поэтому, когда ткани визуализируются через мутные слои, 3PM предпочтительнее 2PM для высококонтрастной визуализации независимо от плотности маркировки.
Недавно мы сообщили о фантомном и теоретическом анализе бусин, показывающем, что предел глубины изображения 3PM составляет более 8 EALs33; 8 EAL эквивалентны ~ 3 мм с возбуждением ~ 1 700 нм в коре мыши. Однако доступный в настоящее время лазер не имеет достаточной импульсной энергии для достижения 8 EAL в мозге мыши. Дальнейшее развитие более сильных лазеров подтолкнет текущий предел глубины изображения в 3PM.

В области наук о жизни методы многофотонной микроскопии (MPM), такие как 2PM и 3PM, были мощными инструментами для глубокой визуализации in vivo с высоким пространственно-временным разрешением и высокой контрастностью в рассеянных тканях. Кроме того, эти методы вызывают меньшее фотоотбеливание по сравнению с однофотонной конфокальной микроскопией 1,2,3,4. 3PM является преимуществом для визуализации более глубоких тканей по сравнению с 2PM из-за двух основных особенностей: (i) использование более длинноволнового возбуждения (~ 1 300 нм или ~ 1 700 нм) уменьшает рассеяние тканей и (ii) процесс возбуждения более высокого порядка (т. Е. Флуоресцентный сигнал зависит от куба мощности возбуждения в 3PM вместо квадрата мощности возбуждения в 2PM), который подавляет нежелательную фоновую флуоресценцию3 . Следовательно, 3PM обеспечивает высококонтрастную визуализацию в более глубоких областях живых тканей, таких как гиппокамп в неповрежденном мозге взрослой мыши 3,5,6,7,8,9,10,11 и во всем переднем мозге взрослой рыбки данио12, включая Ca2+ запись активности и многоцветные наблюдения. Кроме того, высококонтрастные изображения были получены с 3PM через неповрежденные черепа мышей и взрослых рыбок данио12,13.
Сегодня коммерчески доступны лазерные источники возбуждения, подходящие для возбуждения 3P (3PE) при ~1,300 и ~1,700 нм. Поскольку система лазерного сканирования по существу одинакова для 2PM и 3PM, преобразование существующей установки 2P в установку 3P возможно в биологических лабораториях с установкой коммерчески доступного лазера для 3PE. Флуоресцентный сигнал 3P зависит от мощности лазера, длительности импульса, частоты повторения лазера и числовой апертуры (NA) объектива. Предполагая дифракционно-ограниченную фокусировку (т.е. задняя диафрагма объектива переполнена пучком возбуждения), Eq (1) описывает усредненный по времени поток флуоресцентных фотонов от фокального объема, полученный в результате 3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Где f - частота повторения лазера, τ - длительность лазерного импульса (полная ширина в половину максимума), φ - эффективность сбора системы, η - квантовая эффективность флуоресценции, σ3 - поперечное сечение поглощения 3P, C - концентрация флуорофора, n0 - отражающий индекс среды образца (например, воды), λ - длина волны возбуждения в вакууме, NA - числовая диафрагма объектива,3 - константа пространственного интегрирования фокального объема, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> - усредненный по времени поток фотонов возбуждения (фотоны / с) под объективом, z - глубина изображения, а EAL - эффективная длина затухания14. Здесь мы предположили, что EAL (обычно > 100 мкм) намного больше, чем осевое разрешение микроскопа (обычно < 10 мкм). При параксиальном приближении 3 равно 28,114. gp(3) — временная когерентность источника возбуждения3-го порядка, а gp(3) — 0,41 и 0,51 для гиперболически-секанс-квадратных импульсов и гауссовых импульсов соответственно. Эффективность сбора φ может быть оценена путем рассмотрения флуоресцентного сбора объективом, пропускания объектива, отражательной способности дихроичного зеркала, пропускания фильтров и эффективности обнаружения детектора (например, фотоумножителя или PMT). Поскольку интенсивность флуоресценции 3P сильно зависит от различных параметров, требуется оптимизация настройки 3P для максимизации флуоресцентных сигналов 3P.
Этот протокол иллюстрирует процесс оптимизации типичной установки 3P, который будет полезен, в частности, для биологических лабораторий, которые имеют настройку 2P и планируют расширить свои возможности до 3P-визуализации или поддерживать свою коммерческую настройку 3P на оптимальной производительности. Эта видеостатья также демонстрирует глубоководную визуализацию 3P в мозге живых животных. В первом разделе рассматривается оптимизация типичной установки 3P с коммерчески доступным лазерным источником и многофотонным микроскопом. Второй и третий разделы описывают подготовку рыбок данио и мышей, соответственно, к 3PM нейронных структур и деятельности. Операция по трепанации черепа мышей ранее была зарегистрирована в протокольных документах, а также 15,16,17. Четвертый раздел демонстрирует прижизненную визуализацию 3P в мозге рыбок данио и мышей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

Методы многофотонной микроскопии, такие как двухфотонная микроскопия (2PM) и трехфотонная микроскопия (3PM), являются мощными инструментами для глубокой визуализации тканей in vivo с субклеточным разрешением. 3PM имеет два основных преимущества для глубокой визуализации тканей в течение 2PM, которые широко используются в биологических лабораториях: (i) более длинная длина затухания в рассеивающих тканях за счет использования ~ 1 300 нм или ~ 1 700 нм лазера возбуждения; (ii) меньшая фоновая флуоресценция за счет нелинейного возбуждения более высокого порядка. В результате 3PM позволяет создавать высококонтрастную структурную и функциональную визуализацию глубоко внутри рассеивающих тканей, таких как неповрежденный мозг мыши от кортикальных слоев до гиппокампа и всего переднего мозга взрослых рыбок данио.
Сегодня лазерные источники, подходящие для 3PM, коммерчески доступны, что позволяет преобразовать существующую двухфотонную (2P) систему визуализации в трехфотонную (3P) систему. Кроме того, доступно несколько коммерческих микроскопов 3P, что делает этот метод легко доступным для биологических исследовательских лабораторий. В этой статье показана оптимизация типичной установки 3PM, особенно ориентированной на биологические группы, которые уже имеют настройку 2P, и демонстрируется прижизненная 3D-визуализация в интактном мозге мышей и взрослых рыбок данио. Этот протокол охватывает полную экспериментальную процедуру визуализации 3P, включая выравнивание микроскопом, предварительное щипцирование ~ 1 300 и ~ 1 700 нм лазерных импульсов, подготовку животных и прижизненную флуоресцентную визуализацию 3P глубоко в мозге взрослых рыбок данио и мышей.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Трехфотонная микроскопия позволяет получать высококонтрастную флуоресцентную визуализацию глубоко в живых биологических тканях, таких как мозг мышей и рыбок данио, с высоким пространственно-временным разрешением.

Глубокотканная трехфотонная флуоресцентная микроскопия в интактном мозге мышей и рыбок данио

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Протокол иллюстрирует, как выполнять in vivo глубоководную трехфотонную микроскопию в мозге мыши и взрослых рыбок данио. Две важные модельные системы в науках о жизни. Длинноволновая трехфотонная микроскопия позволяет in vivo получать изображения неповрежденных тканей или органов на глубинах, недоступных для двухфотонной микроскопии.Этот метод может помочь нам понять основные механизмы неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и аутизм, где отсутствует полное понимание того, как болезнь влияет на мозг. Демонстрацию процедуры визуализации мозга мышей будет Кибек Чо, постдокторант-исследователь из нашей лаборатории, а демонстрацией процедуры визуализации мозга рыбок данио будет Кристин Колкман, научный сотрудник из Исследовательской лаборатории Фетчо. Для начала включите лазер и установите центральную длину волны холостого хода неколлинеарного оптического параметрического усилителя на 1, 300 или 1 700 нанометров, затем поместите импульсные компрессоры на световой путь, чтобы предварительно чирикать фемтосекундный лазер и оптимизировать продолжительность импульса для трехфотонной визуализации.Установите угол между кремниевой пластиной и траекторией лазера под углом Брюстера, чтобы максимизировать коэффициент пропускания лазера, а затем поверните кремниевую пластину, чтобы достичь угла Брюстера, минимизируя отражение. Затем поместите зеркала-флипперы, чтобы удобно переключаться между линиями луча 1 300 и 1 700 нанометров. Поместите полуволновую пластину, установленную на ступени вращения, и поляризационный разветвитель пучка для управления интенсивностью лазера, затем поместите блокиратор луча в траекторию отражения сплиттера луча.Приготовьте чашку Петри с 0,5 сантиметрами 2% агара с высокой температурой плавления. Как только агар остынет и затвердеет, вырежьте прямоугольное отверстие в агаре длиннее и немного шире, чем рыба. Используя воск, прикрепите тонкую трубку к чашке Петри с одним концом в прямоугольнике и трубкой большего диаметра к краю чашки Петри.Затем обезболивайте рыбу, помещая ее в 0,2 миллиграмма на миллилитр раствора трицина, затем поместите анестезированную рыбу на бок на влажную губку, затем, используя микрошприц, ретро-орбитально введите 3 микролитра бромида панкурония, чтобы парализовать рыбу и ненадолго поместите ее в раствор Хэнка, чтобы убедиться, что она полностью парализована. Затем поместите рыбу спинной стороной вверх в чашку Петри головкой к трубке, затем, используя щипцы, осторожно откройте рот рыбы и сдвиньте трубку в рот. Осторожно сдвиньте рыбу к трубке так, чтобы трубка была в задней части рта рыбы.Быстро, но осторожно высушите агар вокруг рыбы и удалите воду сверху. Окуните небольшой кусочек лабораторной ткани в лабораторный клей и нанесите ткань на агар с обеих сторон рыбы и на спину рыбы хвост к жабрам. Затем обезболивайте кожу рыбы, помещая небольшую каплю бупивакаина непосредственно на поверхность головы, затем поднесите чашку Петри с рыбой к микроскопу.Наполните блюдо водой для рыбы и подключите трубку к водяному насосу, чтобы закачать системную воду в рот рыбы. Убедитесь, что вода насыщается кислородом с помощью барботера и нагревается до 30 градусов по Цельсию с помощью аквариумного нагревателя. Для получения изображения поместите объектив с низким увеличением на трехфотонный микроскоп, затем поместите чашку Петри, содержащую рыбу и трубки, под микроскоп и используйте светодиодный источник света для освещения чашки Петри.В программном обеспечении для получения изображения откройте режим камеры, нажмите «В реальном времени», выберите канал A в правой части экрана и настройте настройки гистограммы, чтобы четко видеть изображение. После установки настройки двигателя на контроллере двигателя на базу, опустите объектив до тех пор, пока рыба не будет видна. Поместите центр головы рыбы в центр поля зрения, затем переместите цель вверх и в сторону от головы рыбы.Замените объектив с низким увеличением объективом с высокой числовой диафрагмой для трехфотонной визуализации, а затем переместите его близко к голове рыбы. Установите значения осей всех двигателей равными нулю. Медленно опустите объектив, следя за тем, чтобы объектив не контактировал с головой физически.В программном обеспечении ПЗС-камеры прекратите перемещение объектива, когда видна верхняя часть головы, и установите местоположения X, Y и Z равными нулю. Выключите светодиодный источник света и закройте темную завесу вокруг системы, затем переведите программное обеспечение для сбора изображений в многофотонный режим GG для трехфотонной визуализации и установите мощность под объективом менее одного милливатта. Нажмите кнопку Live в программном обеспечении для получения изображений.Откройте каналы PMT и при необходимости отрегулируйте коэффициент усиления PMT и уровень фона. Медленно перемещайтесь вверх по объективу, чтобы найти поверхность головы, контролируя канал THG от крупных кровеносных сосудов и поверхности оконного стекла. После перемещения объектива близко к окну нанесите воду между объективом и краниальным окном, затем установите значения осей всех двигателей равными нулю.Нажмите кнопку Live в программном обеспечении для получения изображений. Откройте каналы PMT и отрегулируйте коэффициент усиления PMT и уровень фона по мере необходимости, затем медленно перемещайтесь вверх по объективу, чтобы найти поверхность скольжения крышки, контролируя канал THG от крупных кровеносных сосудов и поверхности оконного стекла. Отрегулируйте ориентацию окна, если это необходимо, затем обнулите двигатели, чтобы определить поверхность мозга.Выполняйте визуализацию и регулируйте уровень мощности в соответствии с глубиной изображения. Высокое разрешение, неинвазивная и глубокая визуализация генетически меченых нейронов в мозге взрослых рыбок данио достигается с помощью трехфотонной микроскопии. Также может наблюдаться распределение клеточных слоев в зрительном тектуме и мозжечке.Функция камеры микроскопа была использована для обнаружения рыбы. Череп виден в канале THG, который помогает ориентироваться в мозге и находить верхнюю поверхность. Нейроны различимы с высоким соотношением сигнал/фон глубоко в мозге взрослого человека.Здесь показаны многоцветные трехфотонные изображения нейронов, меченных GCaMP6s, и кровеносных сосудов, меченных texas Red, вместе с сигналами THG в мозге взрослой мыши. При оптимизации установки были успешно получены высококонтрастные изображения на расстоянии до 1,2 миллиметра от поверхности мозга в области гиппокампа CA1. Следы активности кальция нейронов, меченных GCaMP6s, на глубине 750 микрометров для 10-минутного сеанса записи показали высокую точность записи.Эта установка может помочь визуализировать активность нейронов, чтобы понять функцию мозга. Он также может быть использован для отслеживания движения клеток в биологической ткани для понимания различных биологических систем. Кроме того, скорость кровотока также может быть измерена для мониторинга здоровья животного.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Подготовка ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Сосредоточены ионного пучка фрезерные и сканирующей электронной микроскопии ткани мозга

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Многофотонной микроскопии Сбрасывается мозга мыши выражая YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Электрофизиологические записи в мозгу неповрежденном взрослых данио рерио

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; По изучению нейронных Морфология и миграция

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Обонятельная система как модель для изучения характера роста аксонов и морфология<em&gt; В Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Очистка сосудов головного мозга мыши

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

В Vivo Изображение цереброспинальной жидкости транспорт через Череп мыши Intact с помощью флуоресценции Макроскопия

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...