Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub y NIH 1U01NS103516.

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Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Este protocolo explica los procedimientos paso a paso para configurar imágenes 3P con un microscopio comercial y una fuente láser. En comparación con 2PM, 3PM tiene una ventaja en aplicaciones que requieren acceso óptico en las regiones más profundas, como en el hipocampo cerebral del ratón. Aunque 3PM se usa principalmente en neurociencia, 3PM se puede aplicar potencialmente en otros tejidos como ganglios linfáticos, huesos y tumores para la observación de tejidos profundos.
Es importante verificar que el sistema de imágenes funcione cerca del límite de ruido de disparo, lo que garantiza que la electrónica de detección y adquisición de datos contribuya con un ruido insignificante a la imagen después de los PMT. La incertidumbre en el número de fotones detectados está fundamentalmente limitada por el ruido de disparo de fotones. El rendimiento limitado del ruido de disparo se puede lograr en un microscopio multifotón típico utilizando un fotodetector de alta ganancia (por ejemplo, un PMT). El ruido del disparo de fotones sigue una distribución estadística de Poisson, en la que la desviación estándar de la distribución es igual a la raíz cuadrada de la media de la distribución. Para comprobar el rendimiento limitado del ruido de disparo, siga el paso 1.14 de la sección de protocolo.
Para evitar la atenuación de la luz por H2O, el uso de D2O para la inmersión es útil, particularmente para la excitación de ~ 1,700 nm. Cuando se utiliza D2O, es esencial actualizar D2O cada ~ 10 minutos o usar un gran volumen de D2O para evitar el intercambio de D2O / H2O durante la toma de imágenes. También se puede sellar el D2O del entorno de la habitación3. Si se utiliza una lente de objetivo de larga distancia de trabajo (WD) (por ejemplo, WD a 4 mm o más) para la obtención de imágenes, el espesor del líquido de inmersión puede exceder los 2-3 mm. El aumento del espesor hace que la absorción de H2O no sea despreciable incluso a ~ 1,300 nm21. Por lo tanto, D2O puede ser necesario incluso para 1.300 nm 3PM cuando se utiliza una lente de objetivo WD larga.
Como la intensidad de la fluorescencia 3P depende del cubo de la energía del pulso de excitación en el foco (Eq. (1)), establecer la potencia láser adecuada es particularmente importante para obtener señales de fluorescencia 3P adecuadas al tiempo que se evita el daño térmico y no lineal en los tejidos vivos. La potencia media del láser debe mantenerse por debajo del umbral de daño térmico. En el cerebro del ratón, por ejemplo, para evitar el daño térmico del tejido, la potencia media en la superficie del cerebro del ratón debe mantenerse en o por debajo de ~ 100 mW para ~ 1.300 nm de excitación a una profundidad de 1 mm y con un campo de visión (FOV) de 230 μm x 230 μm21. Del mismo modo, la potencia media a ~1.700 nm debe mantenerse en o por debajo de ~50 mW a ~1 mm de profundidad y un FOV de ~230 μm x 230 μm (datos no publicados). Además, para evitar la saturación de excitación y el daño potencial no lineal, la energía del pulso de excitación debe mantenerse en <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2 nJ y <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 nJ para ~ 1,300 nm y ~ 1,700 nm de excitación, respectivamente30.
Debido a la absorción de luz y la dispersión en los tejidos, la energía del pulso en el foco se atenúa a 1/e (~37%) después de la penetración de los tejidos por 1 EAL. El EAL varía en diferentes tejidos y con las longitudes de onda de excitación, por ejemplo, en la neocorteza del cerebro del ratón, el EAL es de ~300 μm y ~400 μm a ~1.300 nm y ~1.700 nm, respectivamente 3,29 (Figura 5). Por lo tanto, para mantener la misma energía de pulso en el foco (por ejemplo, 1 nJ / pulso) a una profundidad de n EEL, la energía del pulso de superficie debe multiplicarse por 1 nJ × en. Para obtener imágenes rápidas de dinámica estructural y funcional, un láser de excitación con una alta tasa de repetición (a 1 MHz o superior) es deseable para lograr una alta velocidad de fotogramas 5,6,7,10. Sin embargo, el requerimiento de energía de pulso y el límite de potencia promedio del láser restringen la tasa de repetición aplicable.
Por ejemplo, cuando imaginamos una región moderadamente profunda a 4 EEL (es decir, ~ 1.2 mm en la corteza del mouse con excitación de 1,300 nm), se requiere ~ 55 nJ / pulso en la superficie para mantener 1 nJ / pulso enfocado. Cuando la limitación de potencia promedio es de 100 mW, podemos aplicar una tasa de repetición láser de ~ 2 MHz. Sin embargo, para obtener una imagen más profunda a una profundidad de 7 EAL, se requiere ~ 1,100 nJ / pulso en la superficie para mantener 1 nJ / pulso en el enfoque. Suponiendo que la potencia media máxima sea de 100 mW para evitar daños térmicos, la tasa de repetición láser debe reducirse a 0,1 MHz para lograr un pulso de 1.100 nJ/pulso en la superficie. La Tabla 1 resume las condiciones típicas de imagen en la corteza cerebral del ratón. Tenga en cuenta que las profundidades de imagen en la Tabla 1 asumen que el EAL es uniforme en toda la corteza del ratón.
Además, debido a la limitación de potencia del láser en el tejido profundo 3PM, existe una compensación entre la velocidad de fotogramas y el tamaño del píxel de la imagen, lo cual es particularmente importante para las imágenes funcionales, como las imágenes de calcio. La tasa máxima de repetición láser disponible se decide en cada profundidad en función de la energía de pulso requerida en el enfoque y la potencia láser promedio aplicable como se discutió anteriormente, por ejemplo, 2 MHz a una profundidad equivalente a ~ 4 EEL con excitación de 1,300 nm. En general, las imágenes requieren al menos un pulso por píxel. En consecuencia, el tiempo mínimo de permanencia de píxeles disponible está determinado por la tasa de repetición láser, por ejemplo, 0,5 μs / píxel con excitación de 2 MHz.
Para mantener la alta resolución espacial (~1 μm en lateral) en imágenes 3P, es ideal establecer 1 píxel en un área de ~1 μm2, por ejemplo, 256 x 256 píxeles para un FOV de 250 x 250 μm2. Por lo tanto, para realizar imágenes rápidas con un FOV considerablemente grande (por ejemplo, 250 x 250 μm2 con 256 x 256 píxeles), las tasas de repetición de pulsos de 0.5 MHz, 1 MHz y 2 MHz dan velocidades de fotogramas máximas teóricas de ~ 7.6, ~ 15 y ~ 30 cuadros / s, respectivamente. Del mismo modo, la optimización de la tasa de repetición del láser es esencial, dependiendo de la profundidad objetivo, la velocidad de escaneo y el FOV, para aplicar la energía de pulso adecuada por debajo del umbral de daño térmico. Para aumentar la velocidad de imagen, se puede utilizar una fuente de excitación adaptativa para concentrar todos los pulsos de excitación en las neuronas (es decir, regiones de interés) mediante la entrega de pulsos láser a petición a las neuronas31.
3PM es ventajoso en comparación con 2PM en imágenes profundas dentro de tejidos vivos y a través de medios altamente dispersos como un cráneo, huesos y la capa de materia blanca (es decir, la cápsula externa) del cerebro del ratón. La EAL más larga y la excitación no lineal de orden superior de 3PE benefician las imágenes de tejido profundo. Por ejemplo, para obtener imágenes de GCaMP6 en la corteza del ratón, la señal de fluorescencia 2P con excitación de 920 nm es superior a la señal de fluorescencia 3P con excitación de 1.300 nm en regiones poco profundas a <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">690 μm (es decir, ~ 2.3 EAL a 1.300 nm)21. Sin embargo, debido a la EAL más larga a 1.300 nm en comparación con 920 nm, 3PE da una fluorescencia más fuerte que la excitación 2P (2PE) a una profundidad de ~ 690 μm ymás profunda 21. Esta profundidad se define como "profundidad de cruce de señal", en la que las intensidades de señal de fluorescencia de 2PE y 3PE son idénticas con la misma tasa de repetición y las mismas potencias medias máximas permitidas21. La profundidad de cruce de la señal depende de las longitudes de onda de excitación para 2PE y 3PE y el fluoróforo.
En la práctica, la excitación de 920 nm permite una potencia láser promedio más alta que la excitación de 1.300 nm debido a una menor absorción de agua. Sin embargo, la mayor potencia promedio de 2PE empujaría la profundidad de cruce de la señal solo en 0.9 EALs4. Además, cuando la muestra está densamente etiquetada, 3PE tiene la ventaja adicional de un SBR mucho más alto. Por lo tanto, incluso antes de alcanzar la longitud de cruce de la señal, 3PM puede ser mejor para la imagen que 2PM. Por ejemplo, cuando se toman imágenes de la vasculatura cerebral del ratón, que tiene una fracción de volumen (es decir, densidad de etiquetado) de ~ 2%, 1,300 nm 3PM con una potencia de excitación de 100 mW supera los 920 nm 2PM con una potencia de excitación de 200 mW a una profundidad de ~ 700 μm para la fluoresceína.
3PM también tiene una ventaja cuando se obtienen imágenes a través de una capa delgada pero altamente dispersa que puede distorsionar la función de dispersión de puntos del haz de excitación y generar un fondo de desenfoque4. Por ejemplo, a través del cráneo intacto del cerebro del ratón, las imágenes 2PM sufren del fondo de desenfoque incluso a poca profundidad de <100 μm de la superficie del cerebro13. Se observó un fondo de desenfoque similar en 2PM con excitación de 1.280 nm a través de la materia blanca en el cerebro del ratón32. Por lo tanto, cuando los tejidos se visualizan a través de capas turbias, 3PM es preferible a 2PM para imágenes de alto contraste, independientemente de la densidad de etiquetado.
Recientemente informamos un análisis fantasma y teórico de cuentas que muestra que el límite de profundidad de imagen de 3PM es superior a 8 EAL33; 8 EEL equivalen a ~3 mm con ~1.700 nm de excitación en la corteza del ratón. Sin embargo, el láser actualmente disponible no tiene suficiente energía de pulso para lograr 8 EAL en el cerebro del ratón. Un mayor desarrollo de láseres más fuertes empujará el límite de profundidad de imagen actual de 3PM.

En ciencias de la vida, las técnicas de microscopía multifotónica (MPM), como 2PM y 3PM, han sido herramientas poderosas para imágenes profundas in vivo con alta resolución espaciotemporal y alto contraste en tejidos dispersos. Además, estos métodos causan menos fotoblanqueo en comparación con la microscopía confocal de un fotón 1,2,3,4. 3PM es ventajoso para las imágenes de tejidos más profundos en comparación con 2PM debido a dos características principales: (i) el empleo de excitación de longitud de onda más larga (~ 1,300 nm o ~ 1,700 nm) reduce la dispersión del tejido, y (ii) el proceso de excitación de orden superior (es decir, la señal de fluorescencia depende del cubo de la potencia de excitación en 3PM en lugar del cuadrado de la potencia de excitación en 2PM) que suprime la fluorescencia de fondo no deseada3 . En consecuencia, 3PM permite imágenes de alto contraste en regiones más profundas de tejidos vivos como el hipocampo en un cerebro de ratón adulto intacto 3,5,6,7,8,9,10,11 y todo el cerebro anterior del pez cebra adulto12, incluido Ca2+ registro de actividades y observaciones multicolores. Además, se han obtenido imágenes de alto contraste con 3PM a través de los cráneos intactos de ratón y pez cebra adulto12,13.
Hoy en día, las fuentes láser de excitación adecuadas para la excitación 3P (3PE) a ~ 1,300 y ~ 1,700 nm están disponibles comercialmente. Como el sistema de escaneo láser es esencialmente el mismo para 2PM y 3PM, la conversión de una configuración 2P existente en una configuración 3P es posible en los laboratorios de biología con la instalación de un láser disponible comercialmente para 3PE. La señal de fluorescencia 3P depende de la potencia del láser, la duración del pulso, la tasa de repetición del láser y la apertura numérica (NA) de la lente del objetivo. Suponiendo un enfoque limitado por difracción (es decir, la apertura posterior de la lente del objetivo está sobrellenada por el haz de excitación), Eq (1) describe el flujo de fotones de fluorescencia promediado en el tiempo del volumen focal resultante de 3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Donde f es la tasa de repetición del láser, τ es la duración del pulso del láser (ancho completo a la mitad del máximo), φ es la eficiencia de recolección del sistema, η es la eficiencia cuántica de fluorescencia, σ3 es la sección transversal de absorción 3P, C es la concentración de fluoróforos, n0 es el índice reflectante del medio de muestra (por ejemplo, agua), λ es la longitud de onda de excitación en el vacío, NA es la apertura numérica de la lente del objetivo, un3 es la constante de integración espacial del volumen focal, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> es el flujo de fotones de excitación promediado en el tiempo (fotones / s) debajo de la lente del objetivo, z es la profundidad de la imagen y EAL es la longitud de atenuación efectiva14. Aquí hemos asumido que el EAL (típicamente > 100 μm) es mucho mayor que la resolución axial del microscopio (típicamente < 10 μm). Bajo aproximación paraxial, un3 es igual a 28.114. gp(3) es la coherencia temporal de3er orden de la fuente de excitación, y gp(3) es 0,41 y 0,51 para pulsos hiperbólicos-secantes-cuadrados y pulsos gaussianos, respectivamente. La eficiencia de recolección φ se puede estimar considerando la recolección de fluorescencia por la lente objetivo, la transmitancia de la lente objetivo, la reflectividad del espejo dicroico, la transmitancia de los filtros y la eficiencia de detección del detector (por ejemplo, tubo fotomultiplicador o PMT). Como la intensidad de la fluorescencia 3P depende en gran medida de varios parámetros, se requiere la optimización de la configuración 3P para maximizar las señales de fluorescencia 3P.
Este protocolo ilustra el proceso de optimización de una configuración 3P típica, que será útil particularmente para los laboratorios de biología que tienen una configuración 2P y planean expandir su capacidad a imágenes 3P o mantener su configuración 3P comercial con un rendimiento óptimo. Este artículo de video también demuestra imágenes 3P de tejido profundo en cerebros de animales vivos. La primera sección aborda la optimización de una configuración 3P típica con una fuente láser disponible comercialmente y un microscopio multifotónico. Las secciones segunda y tercera describen la preparación del pez cebra y el ratón, respectivamente, para 3PM de estructuras y actividades neuronales. La cirugía de craneotomía de ratón también se ha informado previamente en documentos de protocolo 15,16,17. La cuarta sección muestra imágenes intravitales 3P en cerebros de pez cebra y ratón.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

Las técnicas de microscopía multifotónica, como la microscopía de dos fotones (2PM) y la microscopía de tres fotones (3PM), son herramientas poderosas para la obtención de imágenes in vivo de tejidos profundos con resolución subcelular. 3PM tiene dos ventajas principales para las imágenes de tejidos profundos sobre 2PM que se han utilizado ampliamente en los laboratorios de biología: (i) una mayor longitud de atenuación en los tejidos de dispersión mediante el empleo de ~ 1,300 nm o ~ 1,700 nm de láser de excitación; (ii) menos generación de fluorescencia de fondo debido a la excitación no lineal de orden superior. Como resultado, 3PM permite imágenes estructurales y funcionales de alto contraste en lo profundo de los tejidos dispersos, como el cerebro intacto del ratón desde las capas corticales hasta el hipocampo y todo el cerebro anterior del pez cebra adulto.
Hoy en día, las fuentes láser adecuadas para 3PM están disponibles comercialmente, lo que permite la conversión de un sistema de imágenes de dos fotones (2P) existente en un sistema de tres fotones (3P). Además, hay disponibles múltiples microscopios 3P comerciales, lo que hace que esta técnica esté fácilmente disponible para los laboratorios de investigación biológica. Este artículo muestra la optimización de una configuración típica de 3PM, particularmente dirigida a grupos de biología que ya tienen una configuración 2P, y demuestra imágenes 3D intravitales en cerebros intactos de ratones y peces cebra adultos. Este protocolo cubre el procedimiento experimental completo de imágenes 3P, incluida la alineación del microscopio, el prepicado de pulsos láser de ~ 1,300 y ~ 1,700 nm, la preparación animal y las imágenes de fluorescencia 3P intravital en profundidades en cerebros adultos de pez cebra y ratón.

La finalización exitosa de este protocolo dará como resultado un microscopio correctamente alineado con parámetros de luz óptimos (por ejemplo, duración del pulso, NA) y preparaciones animales apropiadas para 3PM in vivo . La configuración 3P disponible comercialmente comprende espejos y lentes apropiados para ~ 1,300 nm y ~ 1,700 nm; por lo tanto, no se requiere ningún cambio en la óptica cuando la longitud de onda de excitación se cambia entre 1.300 nm y 1.700 nm. Si las lentes en una configuración 3P no tienen un recubrimiento apropiado para 1,300 y 1,700 nm, estas deben reemplazarse por otras apropiadas para reducir la pérdida de potencia del láser. Con las 3PM optimizadas y la preparación animal adecuada, la fluorescencia in vivo y las imágenes THG con alto contraste se pueden recolectar en lo profundo del cerebro.
La Figura 3 muestra imágenes representativas 3P de peces cebra adultos intactos. Las imágenes de alta resolución, no invasivas y profundas de neuronas genéticamente marcadas en el cerebro adulto del pez cebra se logran utilizando 3PM. Aunque se han reportado imágenes en la región del telencéfalo en el cerebro adulto del pez cebra utilizando 2PM 24,25,26,27, 3PM permite el acceso a todo el telencéfalo y regiones que son más desafiantes o imposibles de observar utilizando otras técnicas. La distribución de las capas celulares en el tectum óptico y el cerebelo se puede observar en la Figura 3C. En una sesión de imágenes exitosa, el hueso es visible en el canal THG y las neuronas visibles en el canal de fluorescencia. Para las imágenes de peces cebra adultos, se utilizó la función de cámara del microscopio para localizar a los peces (Figura 3A). Este paso no es necesario para las imágenes cerebrales del ratón, ya que la ventana de vidrio es lo suficientemente grande como para que el cerebro sea fácilmente accesible. Se obtuvieron imágenes estructurales de alta resolución del cerebro adulto del pez cebra utilizando el sistema descrito en las secciones anteriores. El cráneo se ve en el canal THG (Figura 3B), que ayuda a navegar por el cerebro y encontrar la superficie superior. Como se observa en la Figura 3C, las neuronas son distinguibles con una alta relación señal-fondo (SBR) en lo profundo del cerebro adulto. El tejido sobre el cerebro es visible en el canal de fluorescencia debido a la autofluorescencia.
La Figura 4 muestra imágenes 3P multicolores de neuronas marcadas con GCaMP6s (verde) y vasos sanguíneos marcados con Texas Red (rojo) junto con señales THG (azul) en el cerebro de ratón adulto con excitación de 1,340 nm10. Las imágenes se reproducen a partir de trabajos anteriores10. En la Figura 4, la energía del pulso en el foco se mantuvo en ~ 1.5 nJ en toda la profundidad para obtener suficientes señales de fluorescencia y THG, y la potencia láser promedio máxima fue de ~ 70 mW. La duración del pulso se ajustó a ~ 60 fs, y el NA efectivo fue de ~ 0.8. Con la optimización de la configuración de 3PM, se obtuvieron con éxito imágenes de alto contraste de hasta 1,2 mm de la superficie del cerebro, en la región del hipocampo CA1 (Figura 4A, B). La Figura 4C,D muestra rastros de actividad Ca2+ de neuronas marcadas con GCaMP6s a una profundidad de 750 μm durante una sesión de grabación de 10 minutos, mostrando una alta fidelidad de grabación.
Si el láser de excitación está desalineado, se puede observar no uniformidad en el brillo de la señal en todo el campo de visión. Además, si los parámetros del láser, como la duración del pulso, la energía del pulso de excitación en el foco y el NA efectivo, no están optimizados, la imagen THG del cráneo del pez o la ventana de craneotomía del cerebro del ratón no será visible y / o requerirá una alta energía del pulso de excitación (por ejemplo, >2 nJ / pulso en el enfoque). Por lo tanto, las señales THG en la superficie del cerebro se pueden utilizar como un indicador para una configuración optimizada de 3PM antes de comenzar las imágenes de tejido profundo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> Figura 1: Ilustración esquemática de una configuración de 3PM. La longitud de onda del láser de excitación se establece en ~ 1,300 nm o ~ 1,700 nm, salida del puerto inactivo del NOPA. El compresor de par de prisma y el compresor de placa Si se utilizan para el láser de ~1.300 nm y ~1.700 nm, respectivamente, para prehiltar el pulso láser de excitación. Los rayos láser de ~1.300 nm y ~1.700 nm se pueden conmutar con espejos flipper. El puerto de señal del NOPA se utiliza para obtener la señal de activación. Una media placa de onda y un PBS se utilizan para controlar la potencia de excitación. La fluorescencia y el THG son detectados por los PMT de GaAsP. Se utilizan combinaciones apropiadas de espejos dicroicos y filtros de paso de banda para separar las señales de fluorescencia y THG. Abreviaturas: 3PM = microscopía de tres fotones; NOPA = amplificador paramétrico óptico no colineal; PBS = divisor de haz polarizador; THG = tercera generación armónica; DAQ = adquisición de datos; PMT = tubo fotomultiplicador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> Figura 2: Capturas de pantalla representativas para imágenes intravitales en peces (sección 4.1 del protocolo). (A) Vista en modo de cámara del software de adquisición de imágenes con lente objetivo 4x en su lugar. Las características clave del software se describen y numeran de la siguiente manera: 1. Modo de imagen del software de adquisición de imágenes. Las opciones de modo son Cámara, Multifotón y Multifotón GG. Para obtener imágenes de luz blanca con cámara CCD, se elige el modo Cámara. 2. Al hacer clic en el botón Live se enciende la cámara (o PMT si está en opciones multifotón), y se puede observar una vista en tiempo real del microscopio. 3. En la pestaña Configuración de captura, se establecen los parámetros de imagen deseados (potencia, ubicación, profundidad). 4. En la pestaña Capturar, se asigna una ubicación de carpeta para guardar las imágenes. Las imágenes se pueden iniciar en esta pestaña. 5. El ajuste Z Control controla la profundidad de las imágenes moviendo el motor de la etapa z. 6. Imagen representativa de una cabeza de pez cebra. El lado rostral de la cabeza está a la izquierda. (B) Vista representativa del modo cámara con lente objetivo 25x. (C) Vista representativa del modo Multiphoton GG que contiene la imagen THG de la imagen vista en (B). Abreviaturas: CCD = dispositivo de carga acoplada; PMT = tubo fotomultiplicador; THG = tercera generación armónica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> Figura 3: Imágenes representativas del cerebro adulto del pez cebra adquiridas con el software de adquisición de imágenes. (A) Imagen en modo cámara de la cabeza adulta del pez cebra adquirida con una lente de objetivo 4x. La parte superior de la imagen es la dirección rostral. Se delinean los lóbulos OT y CB. (B) Imagen representativa adquirida en modo Multiphoton GG con una lente de objetivo 25x que contiene la imagen THG de (A). (C) Imágenes de fluorescencia del cerebro adulto del pez cebra en la intersección del cerebelo y el tectum óptico donde la GFP se expresa en el citoplasma de las neuronas en varias profundidades. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: OT = tectam óptico; CB = cerebelo; THG = tercera generación armónica; GFP = proteína fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> Figura 4: Multicolor 3 PM de neuronas marcadas con GCaMP6s (verde), vasos sanguíneos marcados con rojo de Texas (rojo) y tercera generación armónica (azul) sobre excitación de 1.340 nm en el cerebro del ratón. (A) Imágenes de pila Z de hasta 1.200 μm de la superficie del cerebro con un campo de visión de 270 x 270 μm (512 x 512 píxeles por fotograma). La potencia del láser se varió de acuerdo con la profundidad de la imagen para mantener ~ 1.5 nJ de energía de pulso en el foco. La potencia media máxima del objetivo fue de 70 mW. (B) Imágenes 2D seleccionadas a varias profundidades de imagen. (C) Sitio de registro de actividad a 750 μm debajo de la duramadre con un campo de visión de 270 x 270 μm (256 x 256 píxeles). (D) Rastros de actividad cerebral espontánea registrados en un ratón despierto a partir de las neuronas marcadas indicadas en (C). La velocidad de fotogramas fue de 8,3 Hz, con un tiempo de permanencia de píxeles de 0,51 μs. La tasa de repetición láser fue de 2 MHz, y la potencia promedio bajo la lente del objetivo fue de 56 mW. Cada traza se normalizó a su línea de base y se filtró de paso bajo utilizando una ventana de hamming de 0,72 s constante de tiempo. Barras de escala = 50 μm. Esta figura y la leyenda de la figura se reproducen a partir del 10. Abreviatura: 3PM = microscopía de tres fotones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> Figura 5: Longitud efectiva de atenuación en la neocorteza del cerebro del ratón. EAL (línea magenta) se calcula a partir de la dispersión del tejido (línea roja) y la absorción de agua en el tejido (línea azul), asumiendo una composición de agua del 75%. Las estrellas negras indican datos experimentales reportados de EAL en la neocorteza del cerebro del ratón 3,21,28,29. Tenga en cuenta que la EAL varía en diferentes tejidos. Abreviatura: EAL = longitud efectiva de atenuación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Longitud de onda de excitación (nm)</td>
			<td>Agua de inmersión</td>
			<td>Potencia máxima del láser (mW)</td>
			<td>Máxima energía de pulso en el foco* (nJ)</td>
			<td>EAL típica en la corteza del ratón (μm)</td>
			<td>Profundidad de imagen en la corteza del ratón** (mm)</td>
			<td>Energía de pulso bajo el objetivo*** (nJ)</td>
			<td>Tasa máxima de repetición láser**** (MHz)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O o D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Condiciones típicas de excitación de 3P para imágenes de la corteza del ratón. * Con un objetivo de NA alto (~ 1.0), ancho de pulso de ~ 50 fs y fluoróforos típicos como proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP y RFP). ** Con la suposición de que la EAL es uniforme en toda la corteza. Para lograr ~1 nJ/pulso en el foco, calculado a partir del EAL y la profundidad de la imagen. Calculado a partir de la energía del pulso bajo el objetivo y la potencia máxima del láser permisivo. Abreviaturas: 3P = tres fotones; NA = apertura numérica; GFP = proteína fluorescente verde; RFP = proteína fluorescente roja; EAL = longitud efectiva de atenuación.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

La microscopía de tres fotones permite obtener imágenes de fluorescencia de alto contraste en lo profundo de tejidos biológicos vivos, como cerebros de ratón y pez cebra, con alta resolución espaciotemporal.

Microscopía de fluorescencia de tres fotones de tejido profundo en cerebro intacto de ratón y pez cebra

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

El protocolo ilustra cómo realizar in vivo microscopía de tres fotones de tejido profundo en cerebro de ratón y pez cebra adulto. Dos sistemas modelo importantes en las ciencias de la vida. La microscopía de tres fotones de longitud de onda larga permite obtener imágenes in vivo de alta resolución espacial de tejidos u órganos intactos a profundidades que son inaccesibles mediante microscopía de dos fotones.Esta técnica puede ayudarnos a comprender los mecanismos subyacentes de las enfermedades neurológicas, como el Alzheimer y el autismo, donde falta una comprensión completa de cómo la enfermedad afecta al cerebro. Demostrando el procedimiento de imágenes cerebrales de ratón estará Kibaek Choe, el investigador postdoctoral de nuestro laboratorio y demostrando el procedimiento de imágenes cerebrales del pez cebra será Kristine Kolkman, investigadora asociada del Laboratorio de Investigación Fetcho. Para comenzar, encienda el láser y establezca la longitud de onda central de la salida de ralentí del amplificador paramétrico óptico no colineal a 1, 300 o 1, 700 nanómetros, luego coloque los compresores de pulso en la trayectoria de la luz para pre-chirriar el láser de femtosegundo y optimizar la duración del pulso para imágenes de tres fotones.Establezca el ángulo entre la placa de silicio y la trayectoria del láser en el ángulo de Brewster para maximizar la transmitancia del láser, luego gire la placa de silicio para lograr el ángulo de Brewster minimizando la reflexión. A continuación, coloque espejos de aleta para cambiar convenientemente entre las líneas de haz de 1, 300 y 1, 700 nanómetros. Coloque una media placa de onda montada en una etapa de rotación y un divisor de haz polarizador para controlar la intensidad del láser, luego coloque un bloqueador de haz en la trayectoria de reflexión del divisor de haz.Prepare una placa de Petri con 0,5 centímetros de agar de alto punto de fusión al 2%. Una vez que el agar se haya enfriado y solidificado, corte un agujero rectangular en el agar más largo y ligeramente más ancho que el pescado. Usando cera, conecte tubos delgados a la placa de Petri con un extremo en el rectángulo y un tubo de mayor diámetro al borde de la placa de Petri.A continuación, anestesiar el pescado colocándolo en una solución de 0,2 miligramos por mililitro de tricaína, luego colocar el pescado anestesiado de lado sobre una esponja húmeda, luego usando una microjeringa, inyectar retro-orbitalmente 3 microlitros de bromuro de pancuronio para paralizar el pez y colocarlo brevemente en la solución de Hank para asegurarse de que esté completamente paralizado. A continuación, coloque el lado dorsal del pez hacia arriba en la placa de Petri con la cabeza hacia el tubo, luego use fórceps, abra suavemente la boca del pez y deslice el tubo hacia la boca. Deslice suavemente el pez hacia el tubo para que el tubo esté en la parte posterior de la boca del pez.Rápidamente, pero suavemente, seque el agar alrededor del pescado y retire el agua sobre el pescado. Sumerja un pequeño trozo de tejido de laboratorio en pegamento de laboratorio y coloque el tejido en el agar a ambos lados del pez y sobre la espalda del pez caudal hasta las branquias. A continuación, anestesia la piel del pez colocando una pequeña gota de bupivacaína directamente en la superficie de la cabeza, luego lleva la placa de Petri con el pescado al microscopio.Llene el plato con agua de la instalación de peces y conéctelo al tubo a una bomba de agua para bombear agua del sistema a la boca del pez. Asegúrese de que el agua se oxigena con un burbujeador y se calienta a 30 grados centígrados con un calentador de acuario. Para obtener imágenes, coloque un objetivo de bajo aumento en el microscopio de tres fotones, luego coloque la placa de Petri que contiene el pescado y los tubos debajo del microscopio y use una fuente de luz LED para iluminar la placa de Petri.Desde el software de adquisición de imágenes, abra el modo Cámara, haga clic en Live, elija el canal A en el lado derecho de la pantalla y ajuste la configuración del histograma para ver la imagen claramente. Después de ajustar la configuración del motor en el controlador del motor a la base, baje el objetivo hasta que el pez sea visible. Coloque el centro de la cabeza del pez en el centro del campo de visión, luego mueva el objetivo hacia arriba y lejos de la cabeza del pez.Reemplace la lente del objetivo de bajo aumento con la lente del objetivo de alta apertura numérica para obtener imágenes de tres fotones, luego muévala cerca de la cabeza del pez. Establezca los valores de eje de todos los motores en cero. Baje lentamente la lente del objetivo, asegurándose de que el objetivo no entre en contacto físico con la cabeza.En el software de la cámara CCD, deje de mover el objetivo cuando la parte superior de la cabeza esté visible y establezca las ubicaciones X, Y y Z en cero. Apague la fuente de luz LED y cierre la cortina oscura alrededor del sistema, luego configure el software de adquisición de imágenes en modo GG multifotón para imágenes de tres fotones y ajuste la potencia debajo de la lente del objetivo a menos de un milivatio. Haga clic en el botón Live en el software de adquisición de imágenes.Abra los canales de PMT y ajuste la ganancia de PMT y el nivel de fondo según sea necesario. Suba lentamente la lente del objetivo para localizar la superficie de la cabeza monitoreando el canal THG desde los vasos sanguíneos grandes y la superficie de vidrio de la ventana. Después de mover la lente del objetivo cerca de la ventana, aplique agua entre el objetivo y la ventana craneal, luego establezca los valores del eje de todos los motores en cero.Haga clic en el botón Live en el software de adquisición de imágenes. Abra los canales PMT y ajuste la ganancia de PMT y el nivel de fondo según sea necesario, luego suba lentamente la lente del objetivo para localizar la superficie del deslizamiento de la cubierta monitoreando el canal THG desde los vasos sanguíneos grandes y la superficie de vidrio de la ventana. Ajuste la orientación de la ventana si es necesario, luego ponga a cero los motores para definir la superficie del cerebro.Realice imágenes y ajuste el nivel de potencia de acuerdo con la profundidad de la imagen. Las imágenes de alta resolución, no invasivas y profundas de las neuronas marcadas genéticamente en el cerebro adulto del pez cebra se logran utilizando microscopía de tres fotones. También se puede observar la distribución de las capas celulares en el tectum óptico y el cerebelo.La función de cámara del microscopio se utilizó para localizar a los peces. El cráneo se ve en el canal THG, que ayuda a navegar por el cerebro y encontrar la superficie superior. Las neuronas son distinguibles con una alta relación señal-fondo en lo profundo del cerebro adulto.Aquí se muestran imágenes multicolores de tres fotones de neuronas marcadas con GCaMP6 y vasos sanguíneos marcados con Texas Red junto con señales THG en el cerebro de ratón adulto. Con la optimización de la configuración, se obtuvieron con éxito imágenes de alto contraste de hasta 1,2 milímetros de la superficie del cerebro en la región del hipocampo CA1. Los rastros de actividad de calcio de las neuronas marcadas con GCaMP6s a una profundidad de 750 micrómetros durante una sesión de grabación de 10 minutos mostraron una alta fidelidad de grabación.Esta configuración puede ayudar a visualizar la actividad neuronal para comprender la función cerebral. También se puede utilizar para rastrear el movimiento celular dentro del tejido biológico para comprender varios sistemas biológicos. Además, la velocidad del flujo sanguíneo también se puede medir para controlar la salud del animal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Investigación

Neurociencias

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

La purificación de los buques de cerebro de ratón

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

En Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...