Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub och NIH 1U01NS103516.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li><li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain.">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li><li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li><li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+Ca2++imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy.">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li><li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy.">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177 (2019).</li><li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain.">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li><li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser.">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science &amp; Applications. 7, 12 (2018).</li><li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain.">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots.">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull.">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li><li>Xu, C., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+of+molecular+fluorophores+and+nonlinear+laser+microscopy.">Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy.</a> Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , 471-540 (2002).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).</li><li>&#321;ukasiewicz, K., Robacha, M., Bo&#380;ycki, &. #. 3. 2. 1. ;., Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex.">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).</li><li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity.">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).</li><li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms.">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging.">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li><li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1,700+nm.">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain.">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205 (2020).</li><li>Cheng, L. -. C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -. J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy.">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li><li>Huang, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish.">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche.">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li><li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain.">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li><li>Vogel, A., Noack, J., H&#252;ttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues.">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li><li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy.">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li><li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).</li><li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy.">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li></ol>

Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Detta protokoll förklarar steg-för-steg-procedurer för att ställa in 3P-avbildning med ett kommersiellt mikroskop och laserkälla. Jämfört med 2PM har 3PM en fördel i applikationer som kräver optisk åtkomst i de djupare regionerna, till exempel i mushjärnan hippocampus. Även om 3PM mest används inom neurovetenskap, kan 3PM potentiellt appliceras i andra vävnader såsom lymfkörtlar, ben och tumörer för djupvävnadsobservation.
Det är viktigt att verifiera att bildsystemet presterar nära skottbrusgränsen, vilket säkerställer att detekterings- och datainsamlingselektroniken bidrar med försumbart brus till bilden efter PMT: erna. Osäkerheten i antalet upptäckta fotoner begränsas i grunden av fotonbrus. Skottbrusbegränsad prestanda kan uppnås i ett typiskt multifotonmikroskop med hjälp av en fotodetektor med hög förstärkning (t.ex. en PMT). Fotonskottsbrus följer en Poisson-statistisk fördelning, där standardavvikelsen för fördelningen är lika med kvadratroten av medelvärdet av fördelningen. För att verifiera den begränsade prestandan för skottbrus, följ steg 1.14 i protokollavsnittet.
För att undvika ljusdämpning medH2Oär det bra att användaD2Oför nedsänkning, särskilt för ~ 1,700 nm excitation. När D2O används är det viktigt att uppdatera D2O var ~ 10: e minut eller använda en stor volym D2O för att undvika D2O / H2O-utbyte under avbildning. Man kan också täta D2O från rumsmiljön3. Om en objektivlins med långt arbetsavstånd (WD) (t.ex. WD vid 4 mm eller längre) används för avbildning kan nedsänkningsvätskans tjocklek överstiga 2-3 mm. Den ökade tjockleken gör attH2O-absorptioneninte är försumbar även vid ~1 300 nm21. Därför kan D2O vara nödvändigt även för 1 300 nm 3PM när du använder en lång WD-objektivlins.
Eftersom 3P-fluorescensintensiteten beror på kuben för excitationspulsenergin vid fokus (Eq. (1)), är det särskilt viktigt att ställa in lämplig lasereffekt för att erhålla adekvata 3P-fluorescenssignaler samtidigt som man undviker termisk och olinjär skada i levande vävnader. Den genomsnittliga lasereffekten bör hållas under tröskeln för termisk skada. I mushjärnan, till exempel, för att undvika termisk vävnadsskada, bör den genomsnittliga effekten på musens hjärnyta hållas på eller under ~ 100 mW för ~ 1 300 nm excitation på ett djup av 1 mm och med ett synfält (FOV) på 230 μm x 230 μm21. På samma sätt bör den genomsnittliga effekten vid ~ 1 700 nm hållas på eller under ~ 50 mW vid ~ 1 mm djup och ett synfält på ~ 230 μm x 230 μm (opublicerade data). Vidare, för att undvika excitationsmättnad och potentiell olinjär skada, bör excitationspulsenergin hållas vid <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2 nJ och <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 nJ för ~ 1 300 nm respektive ~ 1 700 nm excitation30.
På grund av ljusabsorption och spridning i vävnader dämpas pulsenergin vid fokus till 1/e (~ 37%) efter penetrering av vävnader med 1 EAL. EAL varierar i olika vävnader och med excitationsvåglängderna, t.ex. i neocortexen i mushjärnan, är EAL ~ 300 μm och ~ 400 μm vid ~ 1 300 nm respektive ~ 1 700 nm 3,29 (figur 5). För att hålla samma pulsenergi i fokus (t.ex. 1 nJ/puls) på ett djup av n EEL måste ytpulsenergin multipliceras med 1 nJ × en. För snabb avbildning av strukturell och funktionell dynamik är en excitationslaser med hög repetitionshastighet (vid 1 MHz eller högre) önskvärd för att uppnå en hög bildhastighet 5,6,7,10. Pulsenergibehovet och den genomsnittliga lasereffektgränsen begränsar dock den tillämpliga repetitionshastigheten.
När vi till exempel avbildar ett måttligt djupt område vid 4 EALL (dvs ~ 1,2 mm i musbarken med 1 300 nm excitation) krävs ~ 55 nJ / puls vid ytan för att hålla 1 nJ / puls i fokus. När den genomsnittliga effektbegränsningen är 100 mW kan vi tillämpa en ~ 2 MHz laserrepetitionshastighet. Men för att avbilda djupare på ett djup av 7 AEL krävs ~1 100 nJ/puls vid ytan för att bibehålla 1 nJ/puls vid fokus. Förutsatt att den maximala medeleffekten är 100 mW för att undvika termisk skada, bör laserrepetitionshastigheten minskas till 0,1 MHz för att uppnå en 1 100 nJ / puls vid ytan. Tabell 1 sammanfattar typiska avbildningsförhållanden i musens hjärnbark. Observera att avbildningsdjupen i tabell 1 förutsätter att EAL är enhetligt i hela musbarken.
Dessutom, på grund av lasereffektbegränsningen i djupvävnad 3PM, finns det en avvägning mellan bildhastigheten och bildpixelstorleken, vilket är särskilt viktigt för funktionell avbildning som kalciumavbildning. Den maximala tillgängliga laserrepetitionshastigheten bestäms vid varje djup baserat på den erforderliga pulsenergin vid fokus och den tillämpliga genomsnittliga lasereffekten som diskuterats ovan, t.ex. 2 MHz vid ett djup motsvarande ~ 4 EALs med 1 300 nm excitation. I allmänhet kräver avbildning minst en puls per pixel. Följaktligen bestäms den minsta tillgängliga pixelvistelsetiden av laserrepetitionshastigheten, t.ex. 0,5 μs / pixel med 2 MHz excitation.
För att behålla den höga rumsliga upplösningen (~ 1 μm i sidled) i 3P-bilder är det idealiskt att ställa in 1 pixel till ett område på ~ 1 μm2, t.ex. 256 x 256 pixlar för ett synfält på 250 x 250 μm2. För att utföra snabb avbildning med ett betydligt stort synfält (t.ex. 250 x 250 μm2 med 256 x 256 pixlar) ger därför 0,5 MHz, 1 MHz och 2 MHz pulsrepetitionshastigheter teoretiska maximala bildhastigheter på ~ 7,6, ~ 15 respektive ~ 30 bilder / s. På samma sätt är optimeringen av laserrepetitionshastigheten avgörande, beroende på måldjup, skanningshastighet och synfält, för att applicera tillräcklig pulsenergi under tröskeln för termisk skada. För att öka bildhastigheten kan en adaptiv excitationskälla användas för att koncentrera alla excitationspulser på neuronerna (dvs. regioner av intresse) genom att leverera laserpulser på begäran till neuronerna31.
3PM är fördelaktigt jämfört med 2PM i djupavbildning i levande vävnader och genom mycket spridda medier som en skalle, ben och det vita substansskiktet (dvs. den yttre kapseln) i mushjärnan. Ju längre EAL och den högre ordningens olinjära excitation av 3PE gynnar djupvävnadsavbildning. Till exempel, för att avbilda GCaMP6 i musbarken, är 2P fluorescenssignal med 920 nm excitation högre än 3P fluorescenssignal med 1 300 nm excitation i grunda områden vid <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">690 μm (dvs ~ 2,3 EEL vid 1 300 nm)21. Men på grund av den längre EAL vid 1,300 nm jämfört med 920 nm, ger 3PE starkare fluorescens än 2P excitation (2PE) på ett djup av ~ 690 μm och djupare21. Detta djup definieras som "signalövergångsdjup", vid vilket fluorescenssignalstyrkorna för 2PE och 3PE är identiska med samma repetitionshastighet och samma maximala tillåtna medelkrafter21. Signalkorsningsdjupet beror på excitationsvåglängderna för 2PE och 3PE och fluoroforen.
I praktiken tillåter 920 nm excitation högre genomsnittlig lasereffekt än 1 300 nm excitation på grund av mindre vattenabsorption. Den högre genomsnittliga effekten för 2PE skulle dock bara driva signalövergångsdjupet med 0,9 EALs4. Dessutom, när provet är tätt märkt, har 3PE den ytterligare fördelen med mycket högre SBR. Därför, även innan du når signalkorsningslängden, kan 3PM vara bättre för avbildning än 2PM. Till exempel, när man avbildar musens hjärnkärl, som har en volymfraktion (dvs. märkningstäthet) på ~ 2%, 1,300 nm 3PM med 100 mW excitationseffekt överträffar 920 nm 2PM med 200 mW excitationseffekt på ett djup av ~ 700 μm för fluorescein.
3PM har också en fördel vid avbildning genom ett tunt men mycket spridande skikt som kan förvränga excitationsstrålens punktspridningsfunktion och generera en oskärpa bakgrund4. Till exempel, genom den intakta skallen i mushjärnan, lider 2PM-bilder av oskärpa bakgrunden även på det grunda djupet av <100 μm från hjärnytan13. En liknande defokuseringsbakgrund observerades vid 14-tiden med 1 280 nm excitation genom den vita substansen i mushjärnan32. Därför, när vävnader avbildas genom grumliga lager, är 3PM att föredra framför 2PM för högkontrastavbildning oavsett märkningstäthet.
Vi rapporterade nyligen en pärlfantom och teoretisk analys som visar att bilddjupsgränsen på 3PM är över 8 EALs33; 8 EEL motsvarar ~3 mm med ~1 700 nm excitation i musbarken. Den för närvarande tillgängliga lasern har dock inte tillräckligt med pulsenergi för att uppnå 8 ECL i mushjärnan. Vidareutveckling av starkare lasrar kommer att driva den nuvarande bilddjupsgränsen på 3PM.

Inom life science har multifotonmikroskopi (MPM) tekniker, såsom 2PM och 3PM, varit kraftfulla verktyg för djup in vivo-avbildning med hög spatiotemporal upplösning och hög kontrast i spridningsvävnader. Dessutom orsakar dessa metoder mindre fotoblekning jämfört med en-foton konfokalmikroskopi 1,2,3,4. 3PM är fördelaktigt för djupare vävnadsavbildning jämfört med 2PM på grund av två huvudfunktioner: (i) användning av längre våglängdsexcitation (~ 1,300 nm eller ~ 1,700 nm) minskar vävnadsspridning, och (ii) den högre ordningens excitationsprocess (dvs fluorescenssignal beror på kuben för excitationseffekten i 3PM istället för kvadraten på excitationseffekten i 2PM) som undertrycker den oönskade bakgrundsfluorescensen3 . Följaktligen möjliggör 3PM avbildning med hög kontrast vid djupare regioner i levande vävnader som hippocampus i en intakt vuxen mushjärna 3,5,6,7,8,9,10,11 och hela framhjärnan hos vuxna zebrafiskar 12, inklusive Ca2+ aktivitetsinspelning och flerfärgade observationer. Dessutom har bilder med hög kontrast erhållits med 3PM genom de intakta skallarna på mus och vuxen zebrafisk 12,13.
Idag är excitationslaserkällor lämpliga för 3P-excitation (3PE) vid ~ 1,300 och ~ 1,700 nm kommersiellt tillgängliga. Eftersom laserskanningssystemet i huvudsak är detsamma för 2PM och 3PM, är det möjligt att konvertera en befintlig 2P-installation till en 3P-installation i biologilaboratorier med installation av en kommersiellt tillgänglig laser för 3PE. 3P-fluorescenssignalen är beroende av objektivlinsens lasereffekt, pulsvaraktighet, laserrepetitionshastighet och numerisk bländare (NA). Om man antar ett diffraktionsbegränsat fokus (dvs. objektivlinsens bakre bländare överfylls av excitationsstrålen), beskriver Eq (1) det tidsmedelvärdet fluorescensfotonflöde från brännvidden som härrör från 3PE.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Där f är laserrepetitionshastigheten, τ är laserpulsens varaktighet (full bredd vid hälften maximalt), φ är systemets insamlingseffektivitet, η är fluorescenskvanteffektiviteten, σ3 är 3P-absorptionstvärsnittet, C är fluoroforkoncentrationen, n0 är det reflekterande indexet för provmediet (t.ex. vatten), λ är excitationsvåglängden i vakuum, NA är objektivlinsens numeriska bländare, en3 är den rumsliga integrationskonstanten för brännvolymen, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> är det tidsmedelvärdet för excitation fotonflödet (fotoner / s) under objektivlinsen, z är det avbildade djupet och EAL är den effektiva dämpningslängden14. Här har vi antagit att EAL (vanligtvis > 100 μm) är mycket större än mikroskopets axiella upplösning (vanligtvis < 10 μm). Under paraxial approximation är en3 lika med 28, 114. gp(3) är excitationskällans temporala koherens i 3rd-ordningen och gp(3) är 0,41 och 0,51 för hyperbolisk-sekant-kvadrerade pulser respektive gaussiska pulser. Uppsamlingseffektiviteten φ kan uppskattas genom att ta hänsyn till fluorescensuppsamlingen av objektivlinsen, objektivlinsens transmittans, den dikroiska spegelns reflektivitet, filtrens transmittans och detektorns detektionseffektivitet (t.ex. fotomultiplikatorrör eller PMT). Eftersom 3P-fluorescensintensiteten är mycket beroende av olika parametrar krävs optimering av 3P-installationen för att maximera 3P-fluorescenssignalerna.
Detta protokoll illustrerar optimeringsprocessen för en typisk 3P-installation, vilket kommer att vara användbart särskilt för biologilaboratorier som har en 2P-installation och planerar att utöka sin kapacitet till 3P-avbildning eller för att behålla sin kommersiella 3P-installation med optimal prestanda. Denna videoartikel visar också djupvävnad 3P-avbildning i levande djurhjärnor. Det första avsnittet behandlar optimering av en typisk 3P-installation med en kommersiellt tillgänglig laserkälla och multifotonmikroskop. Det andra och tredje avsnittet beskriver zebrafisk- respektive musberedning för 3PM av neuronala strukturer och aktiviteter. Muskraniotomioperationen har tidigare rapporterats i protokollpapper samt 15,16,17. Det fjärde avsnittet visar intravital 3P-avbildning i zebrafisk- och mushjärnor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

Multifotonmikroskopitekniker, såsom tvåfotonmikroskopi (2PM) och trefotonmikroskopi (3PM), är kraftfulla verktyg för djupvävnadsin vivo-avbildning med subcellulär upplösning. 3PM har två stora fördelar för djupvävnadsavbildning över 2PM som har använts i stor utsträckning i biologiska laboratorier: (i) längre dämpningslängd i spridningsvävnader genom att använda ~ 1,300 nm eller ~ 1,700 nm excitationslaser; ii) mindre generering av bakgrundsfluorescens på grund av olinjär excitation av högre ordning. Som ett resultat tillåter 3PM strukturell och funktionell avbildning med hög kontrast djupt inne i spridningsvävnader som intakt mushjärna från de kortikala skikten till hippocampus och hela framhjärnan hos vuxna zebrafiskar.
Idag är laserkällor lämpliga för 3PM kommersiellt tillgängliga, vilket möjliggör omvandling av ett befintligt tvåfoton (2P) bildsystem till ett trefotonsystem (3P). Dessutom finns flera kommersiella 3P-mikroskop tillgängliga, vilket gör denna teknik lätt tillgänglig för biologiska forskningslaboratorier. Detta dokument visar optimeringen av en typisk 3PM-inställning, särskilt inriktad på biologigrupper som redan har en 2P-inställning, och visar intravital 3D-avbildning i intakta mus- och vuxna zebrafiskhjärnor. Detta protokoll täcker det fullständiga experimentella förfarandet för 3P-avbildning, inklusive mikroskopinriktning, prechirping av ~ 1,300 och ~ 1,700 nm laserpulser, djurberedning och intravital 3P fluorescensavbildning djupt i vuxna zebrafisk- och mushjärnor.

Det framgångsrika slutförandet av detta protokoll kommer att resultera i ett korrekt anpassat mikroskop med optimala ljusparametrar (t.ex. pulsvaraktighet, NA) och djurpreparat som är lämpliga för in vivo 3PM. Den kommersiellt tillgängliga 3P-installationen består av lämpliga speglar och linser för både ~ 1,300 nm och ~ 1,700 nm; Därför krävs ingen förändring i optiken när excitationsvåglängden växlas mellan 1 300 nm och 1 700 nm. Om linserna i en 3P-installation inte har en lämplig beläggning för 1 300 och 1 700 nm måste dessa bytas ut mot lämpliga för att minska lasereffektförlusten. Med den optimerade 3PM och korrekt djurberedning kan in vivo fluorescens och THG-bilder med hög kontrast samlas djupt inne i hjärnan.
Figur 3 visar representativa 3P-bilder av intakt vuxen zebrafisk. Högupplöst, icke-invasiv och djup avbildning av genetiskt märkta nervceller i den vuxna zebrafiskhjärnan uppnås med hjälp av 3PM. Även om avbildning i telencephalonregionen har rapporterats i den vuxna zebrafiskhjärnan med 2PM 24,25,26,27, möjliggör 3PM tillgång till hela telencephalon och regioner som är mer utmanande eller omöjliga att observera med andra tekniker. Fördelningen av cellskikt i optisk tectum och cerebellum kan observeras i figur 3C. I en lyckad avbildningssession är benet synligt i THG-kanalen och neuroner synliga i fluorescenskanalen. För avbildning av vuxna zebrafiskar användes mikroskopets kamerafunktion för att lokalisera fisken (figur 3A). Detta steg är inte nödvändigt för mus hjärnavbildning eftersom glasfönstret är tillräckligt stort för att göra hjärnan lättillgänglig. Högupplösta strukturella bilder av vuxen zebrafiskhjärna erhölls med hjälp av det system som beskrivs i föregående avsnitt. Skallen ses i THG-kanalen (figur 3B), vilket hjälper till att navigera i hjärnan och hitta den övre ytan. Som observerats i figur 3C kan neuroner särskiljas med ett högt signal-till-bakgrundsförhållande (SBR) djupt i den vuxna hjärnan. Vävnaden ovanför hjärnan är synlig i fluorescenskanalen på grund av autofluorescens.
Figur 4 visar flerfärgade 3P-bilder av GCaMP6s-märkta nervceller (gröna) och Texas Red-märkta blodkärl (röda) tillsammans med THG (blå) signaler i den vuxna mushjärnan med 1 340 nm excitation10. Bilderna är återgivna från tidigare verk10. I figur 4 bibehölls pulsenergin vid fokus vid ~ 1,5 nJ i hela djupet för att erhålla tillräcklig fluorescens och THG-signaler, och den maximala genomsnittliga lasereffekten var ~ 70 mW. Pulsvaraktigheten justerades till ~60 fs och den effektiva NA var ~0,8. Med optimering av 3PM-inställningen erhölls bilder med hög kontrast framgångsrikt ner till 1,2 mm från hjärnytan, i CA1 hippocampus-regionen (figur 4A, B). Figur 4C, D visar Ca2+ aktivitetsspår av GCaMP6s-märkta neuroner på ett djup av 750 μm under en 10 minuters inspelningssession, vilket visar hög inspelningstrohet.
Om excitationslasern är feljusterad kan ojämnhet i signalljusstyrka över synfältet observeras. Dessutom, om laserparametrarna, såsom pulsvaraktighet, excitationspulsenergin vid fokus och den effektiva NA, inte är optimerade, kommer THG-bilden från fiskskallen eller kraniotomifönstret i mushjärnan inte att vara synlig och / eller kräver hög excitationspulsenergi (t.ex. >2 nJ / puls vid fokus). Därför kan THG-signalerna vid hjärnytan användas som en indikator för en optimerad 3PM-inställning innan djupvävnadsavbildning påbörjas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> Bild 1: Schematisk illustration av en installation kl. 15. Excitationslaserns våglängd är inställd på ~1 300 nm eller ~1 700 nm, utgång från NOPA:s tomgångsport. Prisma-pair-kompressorn och Si-plattkompressorn används för lasern ~1 300 nm respektive ~1 700 nm för att prechirp excitationslaserpulsen. Laserstrålarna ~1 300 nm och ~1 700 nm kan växlas med flipperspeglar. Signalporten för NOPA används för att erhålla utlösningssignalen. En halv vågplatta och en PBS används för att styra excitationseffekten. Fluorescensen och THG detekteras av GaAsP PMTs. Lämpliga kombinationer av dikroiska speglar och bandpassfilter används för att separera fluorescens- och THG-signalerna. Förkortningar: 3PM = trefotonmikroskopi; NOPA = icke-kollinjär optisk parametrisk förstärkare; PBS = polariserande stråldelare; THG = tredje harmoniska generationen; DAQ = datainsamling; PMT = fotomultiplikatorrör. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> Bild 2: Representativa skärmbilder för intravital avbildning i fisk (protokollavsnitt 4.1). (A) Kameralägesvy av bildförvärvsprogrammet med 4x objektivlins på plats. Viktiga funktioner i programvaran beskrivs och numreras enligt följande: 1. Bildläge för bildförvärvsprogramvaran. Lägesalternativen är Kamera, Multifoton och Multifoton GG. För avbildning av vitt ljus med CCD-kamera väljs kameraläge . 2. Klicka på Live-knappen slår på kameran (eller PMTs om det finns multifoton-alternativ), och en realtidsvy av mikroskopet kan observeras. 3. På fliken Capture Setup ställs önskade bildparametrar (effekt, plats, djup) in. 4. På fliken Capture tilldelas en mappplats för bilderna som ska sparas. Bildbehandlingen kan startas på den här fliken. Inställningen Z-kontroll styr bilddjupet genom att flytta z-stegsmotorn. 6. Representativ bild av ett zebrafiskhuvud. Den rostrala sidan av huvudet är till vänster. (B) Representativ bild av kameraläget med 25x objektiv. (C) Representativ vy av Multiphoton GG-läge som innehåller THG-bilden av bilden som ses i (B). Förkortningar: CCD = laddningskopplad enhet; PMT = fotomultiplikatorrör; THG = tredje harmoniska generationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> Figur 3: Representativa bilder av den vuxna zebrafiskhjärnan som förvärvats med programvaran för bildförvärv. Överst på bilden är rostralriktningen. OT-loberna och CB beskrivs. (B) Representativ bild som förvärvats i Multiphoton GG-läge med en 25x objektivlins som innehåller THG-bilden av (A). (C) Fluorescensbilder av vuxen zebrafiskhjärna i skärningspunkten mellan lillhjärnan och den optiska tectum där GFP uttrycks i cytoplasma av neuroner i olika djup. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: OT = optisk tectam; CB = lillhjärnan; THG = tredje harmoniska generationen; GFP = grönt fluorescerande protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> Figur 4: Flerfärgad 3PM av GCaMP6s-märkta neuroner (grön), Texas Red-märkta blodkärl (röd) och tredje harmoniska generationen (blå) vid 1 340 nm excitation i mushjärnan. Lasereffekten varierades beroende på bilddjupet för att bibehålla ~1,5 nJ pulsenergi i fokus. Maximal genomsnittlig effekt enligt målet var 70 mW. (B) Utvalda 2D-bilder på olika bilddjup. (C) Aktivitetsinspelningsplats vid 750 μm under dura med ett synfält på 270 x 270 μm (256 x 256 pixlar). (D) Spontana hjärnaktivitetsspår registrerade i en vaken mus från de märkta neuronerna som anges i (C). Bildhastigheten var 8,3 Hz, med en pixel uppehållstid på 0,51 μs. Laserrepetitionshastigheten var 2 MHz och den genomsnittliga effekten under objektivlinsen var 56 mW. Varje spår normaliserades till sin baslinje och lågpassfiltrerades med hjälp av ett hammingfönster på 0,72 s tidskonstant. Skalstänger = 50 μm. Denna figur och figurförklaringen återges från 10. Förkortning: 3PM = trefotonmikroskopi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> Figur 5: Effektiv dämpningslängd i mushjärnans neocortex. EAL (magentalinjen) beräknas utifrån vävnadsspridningen (röd linje) och vattenabsorptionen i vävnaden (blå linje), förutsatt 75% vattenkomposition. De svarta stjärnorna indikerar rapporterade experimentella data om EAL i neocortexen i mushjärnan 3,21,28,29. Observera att EAL varierar i olika vävnader. Förkortning: EAL = effektiv dämpningslängd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Excitation våglängd (nm)</td>
			<td>Nedsänkningsvatten</td>
			<td>Maximal lasereffekt (mW)</td>
			<td>Maximal pulsenergi vid fokus* (nJ)</td>
			<td>Typisk EAL i musbarken (μm)</td>
			<td>Bilddjup i musbarken** (mm)</td>
			<td>Pulsenergi under målet*** (nJ)</td>
			<td>Maximal laserrepetitionshastighet**** (MHz)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2OellerD2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Typiska 3P excitationsförhållanden för musbarkavbildning. * Med ett högt NA (~ 1.0) mål, pulsbredd på ~ 50 fs och typiska fluoroforer som fluorescerande proteiner (t.ex. GFP och RFP). ** Med antagandet att EAL är enhetlig i hela cortex. För att uppnå ~ 1 nJ / puls vid fokus, beräknat från EAL och bilddjupet. Beräknat från pulsenergin under målet och den maximala tillåtna lasereffekten. Förkortningar: 3P = tre foton; NA = numerisk bländare; GFP = grönt fluorescerande protein; RFP = rött fluorescerande protein; EAL = effektiv dämpningslängd.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Trefotonmikroskopi möjliggör fluorescensavbildning med hög kontrast djupt i levande biologiska vävnader, såsom mus- och zebrafiskhjärnor, med hög spatiotemporal upplösning.

Djupvävnad trefotonfluorescensmikroskopi i intakt mus- och zebrafiskhjärna

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Protokollet illustrerar hur man utför in vivo djupvävnad trefotonmikroskopi i mushjärna och vuxna zebrafiskar. Två viktiga modellsystem inom livsvetenskaperna. Långvågig trefotonmikroskopi möjliggör in vivo-avbildning med hög rumslig upplösning av intakta vävnader eller organ på djup som är otillgängliga med tvåfotonmikroskopi.Denna teknik kan hjälpa oss att förstå de underliggande mekanismerna för neurologiska sjukdomar, såsom Alzheimers och autism, där en fullständig förståelse för hur sjukdomen påverkar hjärnan saknas. Att demonstrera mushjärnavbildningsproceduren kommer att vara Kibaek Choe, postdoktorn från vårt laboratorium och demonstrera zebrafiskhjärnavbildningsproceduren kommer att vara Kristine Kolkman, en forskningsassistent från Fetcho Research Laboratory. För att börja, slå på lasern och ställ in mittvåglängden för tomgångsutgången från den icke-kollinjära optiska parametriska förstärkaren vid 1 300 eller 1 700 nanometer, placera sedan pulskompressorer på ljusvägen för att förkäta femtosekundlasern och optimera pulsvaraktigheten för trefotonavbildning.Ställ in vinkeln mellan kiselplattan och laserbanan i Brewsters vinkel för att maximera lasertransmittansen och rotera sedan kiselplattan för att uppnå Brewsters vinkel genom att minimera reflektionen. Placera sedan flipperspeglar för att bekvämt växla mellan 1, 300 och 1 700 nanometer strållinjer. Placera en halv vågplatta monterad på ett rotationssteg och en polariserande stråldelare för att styra laserns intensitet och placera sedan en strålblockerare i stråldelarens reflektionsväg.Förbered en petriskål med 0,5 centimeter 2% agar med hög smältpunkt. När agar har svalnat och stelnat, skär ett rektangulärt hål i agar längre och något bredare än fisken. Använd vax och fäst tunna slangar på petriskålen med ena änden i rektangeln och en slang med större diameter i kanten av petriskålen.Därefter bedöva fisken genom att placera den i en 0,2 milligram per milliliter trikainlösning, placera sedan den sövda fisken på sidan på en våt svamp, använd sedan en mikrosyring, injicera retro-orbitalt 3 mikroliter pancuroniumbromid för att förlama fisken och placera den kort i Hanks lösning för att säkerställa att den är helt förlamad. Placera sedan fiskens ryggsida uppåt i petriskålen med huvudet mot slangen, använd sedan pincett, öppna försiktigt fiskens mun och skjut slangen i munnen. Skjut försiktigt fisken mot slangen så att slangen kommer att vara på baksidan av fiskens mun.Torka snabbt, men försiktigt, agar runt fisken och ta bort vattnet ovanpå fisken. Doppa en liten bit laboratorievävnad i laboratorielim och lägg vävnaden på agar på båda sidor av fisken och över fiskens rygg kaudala till gälarna. Därefter bedöva fiskens hud genom att placera en liten droppe bupivakain direkt på huvudets yta och ta sedan petriskålen med fisken till mikroskopet.Fyll skålen med fiskanläggningsvatten och anslut till slangen till en vattenpump för att pumpa systemvatten i fiskens mun. Se till att vattnet syresätts med en bubblare och värms till 30 grader Celsius med en akvarievärmare. För avbildning, placera ett mål med låg förstoring på trefotonmikroskopet, placera sedan petriskålen som innehåller fisken och rören under mikroskopet och använd en LED-ljuskälla för att belysa petriskålen.Från bildförvärvsprogramvaran öppnar du kameraläget, klickar på Live, väljer kanal A till höger på skärmen och justerar histograminställningarna för att se bilden tydligt. När du har ställt in motorinställningen på motorstyrenheten till basen, sänk målet tills fisken är synlig. Placera mitten av fiskhuvudet i mitten av synfältet och flytta sedan målet uppåt och bort från fiskens huvud.Byt ut objektivlinsen med låg förstoring med objektivlinsen med hög numerisk bländare för trefotonavbildning och flytta den sedan nära fiskens huvud. Ställ in axelvärdena för alla motorer till noll. Sänk långsamt objektivlinsen och se till att målet inte kommer i kontakt med huvudet fysiskt.I CCD-kameraprogramvaran slutar du flytta målet när toppen av huvudet är synligt och ställer in X-, Y- och Z-platserna till noll. Stäng av LED-ljuskällan och stäng den mörka gardinen runt systemet, ställ sedan in programvaran för bildinsamling på multifoton GG-läge för trefotonavbildning och ställ in effekten under objektivlinsen till mindre än en milliwatt. Klicka på Live-knappen i programvaran för bildförvärv.Öppna PMT-kanaler och justera PMT-förstärkningen och bakgrundsnivån efter behov. Flytta långsamt upp objektivlinsen för att lokalisera huvudets yta genom att övervaka THG-kanalen från de stora blodkärlen och fönsterglasytan. När du har flyttat objektivlinsen nära fönstret, applicera vatten mellan målet och kranialfönstret och ställ sedan in axelvärdena för alla motorer till noll.Klicka på Live-knappen i programvaran för bildförvärv. Öppna PMT-kanaler och justera PMT-förstärkningen och bakgrundsnivån efter behov och flytta sedan långsamt upp objektivlinsen för att lokalisera ytan på täckglidningen genom att övervaka THG-kanalen från de stora blodkärlen och fönsterglasytan. Justera fönsterorienteringen om det behövs och nollställ sedan motorerna för att definiera hjärnans yta.Utför avbildning och justera effektnivån efter bilddjupet. Högupplöst, icke-invasiv och djup avbildning av genetiskt märkta nervceller i den vuxna zebrafiskhjärnan uppnås med hjälp av trefotonmikroskopi. Fördelningen av cellskikt i optisk tectum och cerebellum kan också observeras.Mikroskopets kamerafunktion användes för att lokalisera fisken. Skallen ses i THG-kanalen, vilket hjälper till att navigera i hjärnan och hitta den övre ytan. Neuroner kan särskiljas med ett högt signal-till-bakgrund-förhållande djupt i den vuxna hjärnan.Flerfärgade trefotonbilder av GCaMP6s-märkta nervceller och Texas Red-märkta blodkärl tillsammans med THG-signaler i den vuxna mushjärnan visas här. Med installationsoptimering erhölls bilder med hög kontrast framgångsrikt ner till 1,2 millimeter från hjärnytan i CA1 hippocampus-regionen. Kalciumaktivitetsspår av GCaMP6s-märkta neuroner på ett djup av 750 mikrometer för en 10-minuters inspelningssession visade hög inspelningstrohet.Denna inställning kan hjälpa till att visualisera neuronal aktivitet för att förstå hjärnans funktion. Det kan också användas för att spåra cellrörelser inom biologisk vävnad för att förstå olika biologiska system. Dessutom kan blodflödeshastigheten också mätas för att övervaka djurets hälsa.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Beredning av Mouse hjärnvävnad för Immunoelectron mikroskopi

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Fokuserad jonstråle Fräsning och Svepelektronmikroskopi av hjärnvävnad

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton Mikroskopi av Rensat mushjärna uttrycker YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiska inspelning i hjärnan i Intact vuxna zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation av Cerebellar granulneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Att studera neuronal morfologi och migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell för att studera axonal tillväxt Mönster och morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Rening av Mouse Brain Fartyg

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In vivo avbildning av cerebrospinalvätska transport genom intakt mus skalle med Fluorescensmakroskopi

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Helhjärna encellig avbildning och analys av intakta neonatala mushjärnor med hjälp av MR, vävnadsrensning och ljusarkmikroskopi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...