Name: deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Bu çalışma NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub ve NIH 1U01NS103516 tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li><li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain.">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li><li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li><li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+Ca2++imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy.">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li><li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy.">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177 (2019).</li><li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain.">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li><li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser.">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science &amp; Applications. 7, 12 (2018).</li><li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain.">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots.">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull.">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li><li>Xu, C., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+of+molecular+fluorophores+and+nonlinear+laser+microscopy.">Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy.</a> Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , 471-540 (2002).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).</li><li>&#321;ukasiewicz, K., Robacha, M., Bo&#380;ycki, &. #. 3. 2. 1. ;., Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex.">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).</li><li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity.">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).</li><li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms.">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging.">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li><li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1,700+nm.">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain.">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205 (2020).</li><li>Cheng, L. -. C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -. J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy.">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li><li>Huang, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish.">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb.">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li><li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain.">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche.">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li><li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain.">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li><li>Vogel, A., Noack, J., H&#252;ttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues.">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li><li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy.">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li><li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex.">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).</li><li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy.">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li></ol>

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Bu protokol, ticari bir mikroskop ve lazer kaynağı ile 3P görüntüleme kurmak için adım adım prosedürleri açıklamaktadır. 2PM ile karşılaştırıldığında, 3PM, fare beyni hipokampüsü gibi daha derin bölgelerde optik erişim gerektiren uygulamalarda bir avantaja sahiptir. 3PM çoğunlukla sinirbilimde kullanılmasına rağmen, 3PM derin doku gözlemi için lenf düğümleri, kemikler ve tümörler gibi diğer dokularda potansiyel olarak uygulanabilir.
Görüntüleme sisteminin, algılama ve veri toplama elektroniklerinin PMT'lerden sonra görüntüye ihmal edilebilir bir parazit katkıda bulunmasını sağlayan çekim gürültüsü sınırına yakın bir hızda performans gösterdiğini doğrulamak önemlidir. Tespit edilen foton sayısındaki belirsizlik temelde foton atış gürültüsü ile sınırlıdır. Çekim gürültüsü sınırlı performansı, tipik bir çoklu foton mikroskobunda, yüksek kazançlı bir fotodetektör (örneğin, bir PMT) kullanılarak elde edilebilir. Foton atış gürültüsü, dağılımın standart sapmasının dağılım ortalamasının kareköküne eşit olduğu bir Poisson istatistiksel dağılımını izler. Çekim gürültüsü sınırlı performansını doğrulamak için, protokol bölümündeki 1.14 adımını izleyin.
H2 O ile hafif zayıflamayı önlemek için, daldırma için D2O kullanmak, özellikle ~ 1.700 nm uyarma için yararlıdır. D 2O kullanıldığında, görüntüleme sırasında D 2 O / H 2 O değişimini önlemek için her ~ 10 dakikada birD2O'nun yenilenmesi veyabüyük miktarda D2O kullanılması önemlidir. Ayrıca D2O'yu oda ortamından3. Görüntüleme için uzun çalışma mesafesi (WD) objektif lens (örneğin, 4 mm veya daha uzun WD) kullanılıyorsa, daldırma sıvısı kalınlığı 2-3 mm'yi aşabilir. Artan kalınlık,H2O absorpsiyonunu ~ 1.300 nm21'de bile ihmal edilemez hale getirir. Bu nedenle, uzun bir WD objektif lens kullanırken 1.300 nm 3PM için bile D2O gerekli olabilir.
3P floresan yoğunluğu, odaktaki uyarma darbe enerjisinin küpüne bağlı olduğundan (Eq. (1)), canlı dokularda termal ve doğrusal olmayan hasarı önlerken yeterli 3P floresan sinyallerini elde etmek için uygun lazer gücünün ayarlanması özellikle önemlidir. Ortalama lazer gücü termal hasar eşiğinin altında tutulmalıdır. Örneğin, fare beyninde, termal doku hasarını önlemek için, fare beyin yüzeyindeki ortalama güç, 1 mm derinlikte ~1.300 nm uyarma için ~100 mW'da veya altında tutulmalı ve 230 μm x 230 μm21'lik bir görüş alanı (FOV) ile tutulmalıdır. Benzer şekilde, ~ 1.700 nm'deki ortalama güç, ~ 1 mm derinlikte ~ 50 mW'da veya altında tutulmalı ve ~ 230 μm x 230 μm'lik bir FOV (yayınlanmamış veriler). Ayrıca, uyarma doygunluğunu ve potansiyel doğrusal olmayan hasarı önlemek için, uyarma darbe enerjisi sırasıyla ~ 1.300 nm ve ~ 1.700 nm uyarma için 2 nJ ve <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3 nJ'de <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">tutulmalıdır.
Dokulardaki ışık emilimi ve saçılması nedeniyle, odaktaki nabız enerjisi, dokuların 1 EAL tarafından nüfuz edilmesinden sonra 1/e'ye (~% 37) kadar zayıflatılır. EAL farklı dokularda ve uyarma dalga boylarında, örneğin fare beyninin neokorteksinde değişir, EAL ~ 1.300 nm ve ~ 1.700 nm'de ~ 300 μm ve ~ 400 μm'dir, sırasıyla 3,29'dur (Şekil 5). Bu nedenle, aynı darbe enerjisini n EAL derinliğinde odakta (örneğin, 1 nJ / darbe) tutmak için, yüzey darbe enerjisinin 1 nJ × en ile çarpılması gerekir. Yapısal ve fonksiyonel dinamiklerin hızlı görüntülenmesi için, yüksek bir kare hızı 5,6,7,10 elde etmek için yüksek tekrarlama hızına (1 MHz veya daha yüksek) sahip bir uyarma lazeri arzu edilir. Bununla birlikte, darbe enerjisi gereksinimi ve ortalama lazer güç sınırı, uygulanabilir tekrarlama oranını kısıtlar.
Örneğin, 4 EAL'de orta derecede derin bir bölge görüntülediğimizde (yani, 1.300 nm uyarımla fare korteksinde ~ 1.2 mm), 1 nJ / darbeyi odakta tutmak için yüzeyde ~ 55 nJ / darbe gerekir. Ortalama güç sınırlaması 100 mW olduğunda, ~ 2 MHz lazer tekrarlama hızı uygulayabiliriz. Bununla birlikte, 7 EAL derinliğinde daha derin görüntü elde etmek için, odakta 1 nJ / darbeyi korumak için yüzeyde ~ 1.100 nJ / darbe gereklidir. Termal hasarı önlemek için maksimum ortalama gücün 100 mW olduğu varsayılarak, yüzeyde 1.100 nJ / darbe elde etmek için lazer tekrarlama hızı 0,1 MHz'ye düşürülmelidir. Tablo 1, fare beyin korteksindeki tipik görüntüleme koşullarını özetlemektedir. Tablo 1'deki görüntüleme derinliklerinin, EAL'nin tüm fare korteksinde eşit olduğunu varsaydığını unutmayın.
Dahası, derin doku 3PM'deki lazer güç sınırlaması nedeniyle, kare hızı ile görüntü piksel boyutu arasında bir denge vardır, bu da kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel görüntüleme için özellikle önemlidir. Mevcut maksimum lazer tekrarlama hızı, odaktaki gerekli darbe enerjisine ve yukarıda tartışıldığı gibi uygulanabilir ortalama lazer gücüne bağlı olarak her derinlikte kararlaştırılır, örneğin, 1.300 nm uyarma ile ~ 4 EAL'ye eşdeğer bir derinlikte 2 MHz. Genel olarak, görüntüleme piksel başına en az bir darbe gerektirir. Buna göre, mevcut minimum piksel bekleme süresi, lazer tekrarlama hızına göre belirlenir, örneğin, 2 MHz uyarma ile 0,5 μs / piksel.
3P görüntülerde yüksek uzamsal çözünürlüğü (yanal olarak ~1 μm) korumak için, 1 pikseli ~1 μm2'lik bir alana ayarlamak idealdir, örneğin, 250 x 250 μm2'lik bir FOV için 256 x 256 piksel. Bu nedenle, oldukça büyük bir FOV (örneğin, 256 x 256 piksel ile 250 x250 μm2), 0,5 MHz, 1 MHz ve 2 MHz darbe tekrarlama hızları ile hızlı görüntüleme gerçekleştirmek için sırasıyla ~ 7,6, ~ 15 ve ~ 30 kare / s teorik maksimum kare hızları verir. Benzer şekilde, termal hasar eşiğinin altında yeterli darbe enerjisi uygulamak için hedef derinliğe, tarama hızına ve FOV'a bağlı olarak lazer tekrarlama hızının optimizasyonu esastır. Görüntüleme hızını artırmak için, nöronlara talep üzerine lazer darbeleri göndererek tüm uyarma darbelerini nöronlara (yani ilgi alanlarına) yoğunlaştırmak için uyarlanabilir bir uyarma kaynağı kullanılabilir31.
3PM, canlı dokular içinde derin görüntülemede ve kafatası, kemikler ve fare beyninin beyaz madde tabakası (yani dış kapsül) gibi yüksek oranda saçılan ortamlar aracılığıyla 2PM ile karşılaştırıldığında avantajlıdır. 3PE'nin daha uzun EAL ve daha yüksek dereceli doğrusal olmayan uyarılması derin doku görüntülemeye fayda sağlar. Örneğin, fare korteksindeki GCaMP6'yı görüntülemek için, 920 nm uyarımlı 2P floresan sinyali, 690 μm'de sığ bölgelerde 1.300 nm uyarılma <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">ile 3P floresan sinyalinden daha yüksektir (yani, 1.300 nm'de ~2.3 EAL)21. Bununla birlikte, 920 nm'ye kıyasla 1.300 nm'de daha uzun EAL nedeniyle, 3PE, ~ 690 μm derinlikte ve daha derin21'de 2P uyarımdan (2PE) daha güçlü floresan verir. Bu derinlik, 2PE ve 3PE'lik floresan sinyal kuvvetlerinin aynı tekrarlama oranı ve aynı izin verilen maksimum ortalama güçler21 ile aynı olduğu 'sinyal çapraz derinliği' olarak tanımlanır. Sinyal çapraz derinliği, 2PE ve 3PE için uyarma dalga boylarına ve florofora bağlıdır.
Uygulamada, 920 nm uyarım, daha az su emilimi nedeniyle 1.300 nm uyarmadan daha yüksek ortalama lazer gücüne izin verir. Bununla birlikte, 2PE'nin daha yüksek ortalama gücü, sinyal çapraz derinliğini yalnızca 0,9 EAL4 ile itecektir. Ek olarak, numune yoğun bir şekilde etiketlendiğinde, 3PE çok daha yüksek SBR'nin ek avantajına sahiptir. Bu nedenle, sinyal çapraz uzunluğuna ulaşmadan önce bile, 3PM, görüntüleme için 2PM'den daha iyi olabilir. Örneğin, ~% 2'lik bir hacim fraksiyonuna (yani etiketleme yoğunluğuna) sahip fare beyin vaskülatürünü görüntülerken, 100 mW uyarma gücüne sahip 1.300 nm 3PM, floresein için ~ 700 μm derinlikte 200 mW uyarma gücü ile 920 nm 2PM'den daha iyi performans gösterir.
3PM ayrıca, uyarma ışınının nokta yayılma işlevini bozabilecek ve bulanıklaştırma arka planıoluşturabilecek ince ama yüksek oranda saçılan bir tabakadan görüntüleme yaparken de bir avantaja sahiptir 4. Örneğin, fare beyninin bozulmamış kafatası boyunca, 2PM görüntüleri, beyin yüzeyinden13 μm <100 μm'lik sığ derinlikte bile bulanıklaştırma arka planından muzdariptir. Benzer bir bulanıklaştırma arka planı, fare beynindeki beyaz madde32 aracılığıyla 1.280 nm uyarılma ile 2PM'de gözlendi. Bu nedenle, dokular bulanık tabakalar yoluyla görüntülendiğinde, etiketleme yoğunluğundan bağımsız olarak yüksek kontrastlı görüntüleme için 3PM'den 2PM'ye tercih edilir.
Son zamanlarda, 3PM'nin görüntüleme derinliği sınırının 8 EAL 33'ün üzerinde olduğunu gösteren bir boncukhayaleti ve teorik analiz bildirdik; 8 EAL, fare korteksinde ~ 1.700 nm uyarma ile ~ 3 mm'ye eşdeğerdir. Bununla birlikte, şu anda mevcut olan lazer, fare beyninde 8 EAL elde etmek için yeterli darbe enerjisine sahip değildir. Daha güçlü lazerlerin daha da geliştirilmesi, mevcut görüntüleme derinliği sınırını 3PM'ye zorlayacaktır.

Yaşam bilimlerinde, 2PM ve 3PM gibi çoklu foton mikroskopisi (MPM) teknikleri, yüksek uzaysal zamansal çözünürlük ve saçılma dokularında yüksek kontrast ile derin in vivo görüntüleme için güçlü araçlar olmuştur. Ek olarak, bu yöntemler tek fotonlu konfokal mikroskopi 1,2,3,4 ile karşılaştırıldığında daha az fotobeyazlatmaya neden olur. 3PM, iki ana özellik nedeniyle 2PM ile karşılaştırıldığında daha derin doku görüntülemesi için avantajlıdır: (i) daha uzun dalga boyu uyarımı (~1.300 nm veya ~1.700 nm) istihdamı doku saçılımını azaltır ve (ii) istenmeyen arka plan floresansını baskılayan daha yüksek dereceli uyarma işlemi (yani, floresan sinyali, 2PM'deki uyarma gücünün karesi yerine 3PM'deki uyarma gücünün küpüne bağlıdır) 3PM'de uyarılma gücüne bağlıdır3 . Sonuç olarak, 3PM, bozulmamış bir yetişkin fare beynindeki hipokampus 3,5,6,7,8,9,10,11 ve Ca2+ dahil olmak üzere yetişkin zebra balığı 12'nin tüm ön beyni gibi canlı dokuların daha derin bölgelerinde yüksek kontrastlı görüntüleme sağlar. aktivite kaydı ve çok renkli gözlemler. Ayrıca, fare ve yetişkin zebra balığı12,13'ün bozulmamış kafatasları aracılığıyla 3PM ile yüksek kontrastlı görüntüler elde edilmiştir.
Bugün, ~ 1.300 ve ~ 1.700 nm'de 3P uyarma (3PE) için uygun uyarma lazer kaynakları ticari olarak temin edilebilir. Lazer tarama sistemi esasen 2PM ve 3PM için aynı olduğundan, mevcut bir 2P kurulumunu 3P kurulumuna dönüştürmek, biyoloji laboratuvarlarında 3PE için ticari olarak temin edilebilen bir lazerin kurulmasıyla mümkündür. 3P floresan sinyali, objektif lensin lazer gücüne, darbe süresine, lazer tekrarlama hızına ve sayısal açıklığına (NA) bağlıdır. Kırınım sınırlı bir odağın (yani, objektif lensin arka açıklığının uyarma ışını tarafından aşırı doldurulduğunu) varsayarsak, Eq (1), 3PE'den kaynaklanan odak hacminden gelen zaman ortalamalı floresan foton akısını tanımlar.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Burada f, lazer tekrarlama hızıdır, τ lazer darbe süresidir (maksimum yarıda tam genişlik), φ sistem toplama verimliliğidir, η floresan kuantum verimliliğidir, σ3P absorpsiyon kesitidir, C florofor konsantrasyonudur, n0 numune ortamının yansıtıcı indeksidir (örneğin, su), λ vakumdaki uyarma dalga boyudur, NA, objektif lensin sayısal açıklığıdır, 3, odak hacminin uzamsal entegrasyon sabitidir, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> objektif lensin altındaki zaman ortalamalı uyarma foton akısıdır (fotonlar / s), z görüntülenen derinliktir ve EAL etkili zayıflama uzunluğu14'tür. Burada EAL'nin (tipik olarak 100 μm'>) mikroskopun eksenel çözünürlüğünden çok daha büyük olduğunu varsaydık (tipik olarak 10 μm'<). Paraksiyel yaklaşım altında,3 28.114'e eşittir. g p(3), uyarma kaynağının 3. dereceden zamansal tutarlılığıdır ve gp(3), hiperbolik-sekant-kareli darbeler ve gaussian darbeler için sırasıyla 0.41 ve 0.51'dir. φ toplama verimliliği, objektif lens tarafından floresan toplanması, objektif lensin geçirgenliği, dikroik aynanın yansıtıcılığı, filtrelerin geçirgenliği ve dedektörün algılama verimliliği (örneğin, fotoçarpan tüpü veya PMT) dikkate alınarak tahmin edilebilir. 3P floresan yoğunluğu çeşitli parametrelere büyük ölçüde bağlı olduğundan, 3P floresan sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için 3P kurulumunun optimizasyonu gerekir.
Bu protokol, özellikle 2P kurulumuna sahip olan ve kapasitesini 3P görüntülemeye genişletmeyi veya ticari 3P kurulumlarını optimum performansta sürdürmeyi planlayan biyoloji laboratuvarları için yararlı olacak tipik bir 3P kurulumunun optimizasyon sürecini göstermektedir. Bu video makalesi aynı zamanda canlı hayvan beyinlerinde derin doku 3P görüntülemeyi de göstermektedir. İlk bölüm, ticari olarak temin edilebilen bir lazer kaynağı ve çoklu foton mikroskobu ile tipik bir 3P kurulumunun optimizasyonunu ele almaktadır. İkinci ve üçüncü bölümler, nöronal yapıların ve aktivitelerin 3PM için sırasıyla zebra balığı ve fare hazırlığını açıklar. Fare kraniyotomisi ameliyatı daha önce protokol belgelerinde de15,16,17 olarak bildirilmiştir. Dördüncü bölüm, zebra balığı ve fare beyinlerinde intravital 3P görüntülemeyi göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5% Povidone-iodine</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NDC 67818-155-32</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CAS 64-17-5</td>
			<td>Aceptical cleaning of surgical areas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4718-256</td>
			<td>Preparing zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bergamo II</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Imaging Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)</td>
			<td>Potomac Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye ointment (or topical ophthalmic ointment)</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP Amplified PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMT2100</td>
			<td>PMT detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycopyrrolate</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater (800 W)</td>
			<td>Finnex</td>
			<td></td>
			<td>Aquarium heater for zebrafish water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-0013-25</td>
			<td>For anesthesia of mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td></td>
			<td>Laboratory tissue for preparing zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL + NF36BV</td>
			<td>Syringe and needle for injection of pancuronium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>To stick round coverslip and donut shape glass together.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium Bromide</td>
			<td>Cornell Veterinary Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>ESI MP2</td>
			<td>Water pump for zebrafish setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)</td>
			<td>Elemental Science</td>
			<td>MP2 pump tubing</td>
			<td>Tubing that goes in the mouth of the zebrafish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7229605</td>
			<td>Cover glass used for craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spirit-NOPA</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td>Tunable Optical Parametric Amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR400</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR400</td>
			<td>Photon counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S122C</td>
			<td>Power detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SKU 806552-500ml</td>
			<td>Used during mouse brain surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Dynarex disposable towel drape</td>
			<td>4410</td>
			<td>For aceptical mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin strip boxing wax</td>
			<td>Corning Rubber Co., Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Holding tubing in place in zebrafish chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThorImage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td>MP</td>
			<td>103106</td>
			<td>Zebrafish anesthesia and euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td></td>
			<td>Tubing for water flow for zebrafish preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGuard</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td>For recycling isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton Excitation Dedicated Objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep-tissue three-photon fluorescence microscopy in intact mouse and zebrafish brain

İki foton mikroskobu (2PM) ve üç foton mikroskobu (3PM) gibi multifoton mikroskopi teknikleri, hücre altı çözünürlükte derin doku in vivo görüntüleme için güçlü araçlardır. 3PM, biyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan 2PM'ye göre derin doku görüntüleme için iki önemli avantaja sahiptir: (i) ~ 1.300 nm veya ~ 1.700 nm uyarma lazeri kullanılarak saçılma dokularında daha uzun zayıflama uzunluğu; (ii) daha yüksek dereceli doğrusal olmayan uyarma nedeniyle daha az arka plan floresan üretimi. Sonuç olarak, 3PM, kortikal katmanlardan hipokampusa ve yetişkin zebra balıklarının tüm ön beynine kadar bozulmamış fare beyni gibi saçılma dokularının derinliklerinde yüksek kontrastlı yapısal ve işlevsel görüntülemeye izin verir.
Bugün, 3PM için uygun lazer kaynakları ticari olarak temin edilebilmekte ve mevcut iki fotonlu (2P) görüntüleme sisteminin üç fotonlu (3P) bir sisteme dönüştürülmesini sağlamaktadır. Ek olarak, birden fazla ticari 3P mikroskop mevcuttur, bu da bu tekniği biyoloji araştırma laboratuvarları için hazır hale getirir. Bu makale, özellikle zaten 2P kurulumuna sahip biyoloji gruplarını hedefleyen tipik bir 3PM kurulumunun optimizasyonunu göstermektedir ve bozulmamış fare ve yetişkin zebra balığı beyinlerinde intravital 3D görüntülemeyi göstermektedir. Bu protokol, mikroskop hizalaması, ~ 1.300 ve ~ 1.700 nm lazer darbelerinin ön cıvıltıları, hayvan hazırlığı ve yetişkin zebra balığı ve fare beyinlerinin derinliklerinde intravital 3P floresan görüntüleme dahil olmak üzere 3P görüntülemenin tam deneysel prosedürünü kapsar.

Bu protokolün başarıyla tamamlanması, optimal ışık parametreleri (örneğin, nabız süresi, NA) ve in vivo 3PM için uygun hayvan preparatları ile uygun şekilde hizalanmış bir mikroskopla sonuçlanacaktır. Ticari olarak temin edilebilen 3P kurulumu, hem ~ 1.300 nm hem de ~ 1.700 nm için uygun aynalar ve lenslerden oluşur; bu nedenle, uyarma dalga boyu 1.300 nm ile 1.700 nm arasında değiştirildiğinde optikte herhangi bir değişiklik gerekmez. 3P kurulumundaki lenslerin 1.300 ve 1.700 nm için uygun bir kaplaması yoksa, lazer güç kaybını azaltmak için bunların uygun olanlarla değiştirilmesi gerekir. Optimize edilmiş 3PM ve uygun hayvan hazırlığı ile, yüksek kontrastlı in vivo floresan ve THG görüntüleri beynin derinliklerinde toplanabilir.
Şekil 3, bozulmamış yetişkin zebra balıklarının temsili 3P görüntülerini göstermektedir. Yetişkin zebra balığı beynindeki genetik olarak etiketlenmiş nöronların yüksek çözünürlüklü, invaziv olmayan ve derin görüntülemesi 3PM kullanılarak elde edilir. Telensefalon bölgesindeki görüntüleme, yetişkin zebra balığı beyninde 2PM24,25,26,27 kullanılarak bildirilmiş olmasına rağmen, 3PM, tüm telensefalona ve diğer teknikler kullanılarak gözlemlenmesi daha zor veya imkansız olan bölgelere erişim sağlar. Optik tektum ve beyincikteki hücre tabakalarının dağılımı Şekil 3C'de görülebilir. Başarılı bir görüntüleme seansında, kemik THG kanalında görünür ve nöronlar floresan kanalında görülebilir. Yetişkin zebra balığı görüntülemesinde, balığın yerini belirlemek için mikroskopun kamera özelliği kullanılmıştır (Şekil 3A). Bu adım, fare beyninin görüntülenmesi için gerekli değildir, çünkü cam pencere beynin kolayca erişilebilir olmasını sağlayacak kadar büyüktür. Yetişkin zebra balığı beyninin yüksek çözünürlüklü yapısal görüntüleri, önceki bölümlerde açıklanan sistem kullanılarak elde edilmiştir. Kafatası, beyinde gezinmeye ve üst yüzeyi bulmaya yardımcı olan THG kanalında (Şekil 3B) görülür. Şekil 3C'de gözlemlendiği gibi, nöronlar yetişkin beyninin derinliklerinde yüksek sinyal-arka plan oranı (SBR) ile ayırt edilebilir. Beynin üzerindeki doku, otofloresan nedeniyle floresan kanalında görülebilir.
Şekil 4, GCaMP6s etiketli nöronların (yeşil) ve Teksas Kırmızı etiketli kan damarlarının (kırmızı) çok renkli 3P görüntülerini, yetişkin fare beynindeki THG (mavi) sinyalleri ile birlikte 1.340 nm uyarım10 ile göstermektedir. Görüntüler önceki çalışma10'dan çoğaltılmıştır. Şekil 4'te, odaktaki darbe enerjisi, yeterli floresan ve THG sinyalleri elde etmek için tüm derinlikte ~ 1.5 nJ'de tutuldu ve maksimum ortalama lazer gücü ~ 70 mW idi. Nabız süresi ~ 60 fs'ye ayarlandı ve etkili NA ~ 0.8 idi. 3PM kurulumunun optimizasyonu ile CA1 hipokampus bölgesinde beyin yüzeyinden 1,2 mm'ye kadar yüksek kontrastlı görüntüler başarıyla elde edilmiştir (Şekil 4A,B). Şekil 4C, D, GCaMP6s etiketli nöronların Ca2+ aktivite izlerini, 10 dakikalık bir kayıt oturumu için 750 μm derinlikte gösterir ve yüksek kayıt doğruluğu gösterir.
Uyarma lazeri yanlış hizalanmışsa, görüş alanı boyunca sinyal parlaklığında homojensizlik gözlenebilir. Ek olarak, nabız süresi, odaktaki uyarma darbe enerjisi ve etkili NA gibi lazer parametreleri optimize edilmezse, balık kafatasından veya fare beyninin kraniyotomi penceresinden gelen THG görüntüsü görünmez ve / veya yüksek uyarma darbe enerjisi gerektirir (örneğin, >2 nJ / odakta darbe). Bu nedenle, beyin yüzeyindeki THG sinyalleri, derin doku görüntülemeye başlamadan önce optimize edilmiş bir 3PM kurulumu için bir gösterge olarak kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> Şekil 1: 15:00 kurulumunun şematik gösterimi. Uyarma lazerinin dalga boyu, NOPA'nın avara portundan çıkan ~ 1.300 nm veya ~ 1.700 nm olarak ayarlanır. Prizma çifti kompresör ve Si plakalı kompresör, uyarma lazer darbesini önceden ayarlamak için sırasıyla ~ 1.300 nm ve ~ 1.700 nm lazer için kullanılır. ~ 1.300 nm ve ~ 1.700 nm lazer ışınları paletli aynalarla değiştirilebilir. NOPA'nın sinyal portu, tetikleyici sinyali elde etmek için kullanılır. Uyarma gücünü kontrol etmek için yarım dalga plakası ve PBS kullanılır. Floresan ve THG, GaAsP PMT'leri tarafından tespit edilir. Floresan ve THG sinyallerini ayırmak için dikroik aynaların ve bandpass filtrelerinin uygun kombinasyonları kullanılır. Kısaltmalar: 3PM = üç foton mikroskopisi; NOPA = kollineer olmayan optik parametrik amplifikatör; PBS = polarize edici ışın ayırıcı; THG = üçüncü harmonik nesil; DAQ = veri toplama; PMT = fotoçarpan tüpü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> Şekil 2: Balıklarda intravital Görüntüleme için temsili ekran görüntüleri (protokol bölüm 4.1). (A) 4x objektif lens ile görüntü alma yazılımının kamera modunda görünümü. Yazılımın temel özellikleri aşağıdaki gibi özetlenmiş ve numaralandırılmıştır: 1. Görüntü alma yazılımının görüntüleme modu. Mod seçenekleri Kamera, Multifoton ve Multifoton GG'dir. CCD kamera ile beyaz ışıkta görüntüleme için Kamera modu seçilir. 2. Canlı düğmesine tıklandığında kamera açılır (veya çoklu foton seçeneklerinde PMT'ler) ve mikroskopun gerçek zamanlı bir görünümü gözlemlenebilir. 3. Yakalama Ayarları sekmesinde, istenen görüntüleme parametreleri (güç, konum, derinlik) ayarlanır. 4. In Yakala sekmesinde, kaydedilecek görüntüler için bir klasör konumu atanır. Görüntüleme bu sekmeden başlatılabilir. 5. Z Control ayarı, z kademeli motoru hareket ettirerek görüntüleme derinliğini kontrol eder. 6. Bir zebra balığı kafasının temsili görüntüsü. Başın rostral tarafı soldadır. (B) 25x objektif lensle Kamera modunun temsili görünümü. (C) (B)'de görülen görüntünün THG görüntüsünü içeren Multifoton GG modunun temsili görünümü. Kısaltmalar: CCD = şarj bağlantılı cihaz; PMT = fotoçarpan tüpü; THG = üçüncü harmonik nesil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> Şekil 3: Görüntü yakalama yazılımı ile elde edilen yetişkin zebra balığı beyninin temsili görüntüleri. (A) 4x objektif lens ile elde edilen yetişkin zebra balığı kafasının kamera modu görüntüsü. Görüntünün üst kısmı rostral yöndür. OT lobları ve CB özetlenmiştir. (B) Multiphoton GG modunda, (A)'nın THG görüntüsünü içeren 25x objektif lens ile elde edilen temsili görüntü. (C) Yetişkin zebra balığı beyninin, beyincik ile GFP'nin çeşitli derinliklerdeki nöronların sitoplazmasında eksprese edildiği optik tektumun kesişimindeki floresan görüntüleri. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: OT = optik tektam; CB = beyincik; THG = üçüncü harmonik nesil; GFP = yeşil floresan proteini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> Şekil 4: Fare beyninde 1.340 nm uyarılma üzerine GCaMP6s etiketli nöronların (yeşil), Teksas Kırmızı etiketli kan damarlarının (kırmızı) ve üçüncü harmonik neslin (mavi) çok renkli 3 PM değeri. (A) Z-yığını görüntüleri, 270 x 270 μm (kare başına 512 x 512 piksel) görüş alanıyla beyin yüzeyinden 1.200 μm'ye kadar düşürür. Lazer gücü, odakta ~ 1.5 nJ darbe enerjisini korumak için görüntüleme derinliğine göre değiştirildi. Hedefin altında maksimum ortalama güç 70 mW idi. (B) Çeşitli görüntüleme derinliklerinde seçilen 2D görüntüler. (C) Dura'nın 750 μm altında, 270 x 270 μm (256 x 256 piksel) görüş alanına sahip etkinlik kayıt sitesi. (D) (C)'de belirtilen etiketli nöronlardan uyanık bir farede kaydedilen spontan beyin aktivitesi izleri. Kare hızı 8.3 Hz idi ve piksel bekleme süresi 0.51 μs'dir. Lazer tekrarlama hızı 2 MHz idi ve objektif lensin altındaki ortalama güç 56 mW idi. Her iz taban çizgisine normalleştirildi ve 0.72 s zaman sabiti olan bir hamming penceresi kullanılarak düşük geçişli filtrelendi. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu figür ve şekil göstergesi 10'dan çoğaltılmıştır. Kısaltma: 3PM = üç foton mikroskopisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> Şekil 5: Fare beyninin neokorteksindeki etkili zayıflama uzunluğu. EAL (macenta hattı), doku saçılmasından (kırmızı çizgi) ve dokudaki su emiliminden (mavi çizgi) hesaplanır ve% 75 su bileşimi varsayılır. Siyah yıldızlar, fare beyninin neokorteksindeki EAL'nin bildirilen deneysel verilerini göstermektedir 3,21,28,29. EAL'nin farklı dokularda değiştiğini unutmayın. Kısaltma: EAL = etkili zayıflama uzunluğu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Uyarma dalga boyu (nm)</td>
			<td>Daldırma suyu</td>
			<td>Maksimum lazer gücü (mW)</td>
			<td>Odakta maksimum darbe enerjisi* (nJ)</td>
			<td>Fare korteksindeki tipik EAL (μm)</td>
			<td>Fare korteksindeki görüntüleme derinliği** (mm)</td>
			<td>Amaç altında darbe enerjisi*** (nJ)</td>
			<td>Maksimum lazer tekrarlama oranı**** (MHz)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2 O veya D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~ 1100</td>
			<td>~0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~ 400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~ 190</td>
			<td>~0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Fare korteksi görüntüleme için tipik 3 P uyarma koşulları. * Yüksek NA (~1.0) hedefi, ~50 fs'lik darbe genişliği ve floresan proteinleri (örneğin, GFP ve RFP) gibi tipik floroforlarla. ** EAL'nin tüm kortekste tek tip olduğu varsayımıyla. EAL ve görüntüleme derinliğinden hesaplanan odakta ~1 nJ/darbe elde etmek için. Hedefin altındaki darbe enerjisinden ve izin verilen maksimum lazer gücünden hesaplanır. Kısaltmalar: 3P = üç foton; NA = sayısal diyafram; GFP = yeşil floresan protein; RFP = kırmızı floresan proteini; EAL = etkili zayıflama uzunluğu.

Watch this Scientific Journal Video about Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain at JoVE.com

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Üç foton mikroskopisi, fare ve zebra balığı beyinleri gibi canlı biyolojik dokuların derinliklerinde, yüksek uzaysal zamansal çözünürlükte yüksek kontrastlı floresan görüntüleme sağlar.

Sağlam Fare ve Zebra Balığı Beyinde Derin Doku Üç Fotonlu Floresan Mikroskopisi

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Protokol, fare beyninde ve yetişkin zebra balıklarında in vivo derin doku üç foton mikroskobunun nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Yaşam bilimlerinde iki önemli model sistem. Uzun dalga boylu üç foton mikroskopisi, iki foton mikroskobu ile erişilemeyen derinliklerde bozulmamış dokuların veya organların in vivo yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.Bu teknik, hastalığın beyni nasıl etkilediğine dair tam bir anlayışın eksik olduğu Alzheimer ve otizm gibi nörolojik hastalıkların altında yatan mekanizmaları anlamamıza yardımcı olabilir. Fare beyin görüntüleme prosedürünü gösteren, laboratuvarımızdan doktora sonrası araştırmacı Kibaek Choe ve zebra balığı beyin görüntüleme prosedürünü gösteren, Fetcho Araştırma Laboratuvarı'ndan bir araştırma görevlisi olan Kristine Kolkman olacaktır. Başlamak için, lazeri açın ve kollineer olmayan optik parametrik amplifikatörün avara çıkışının merkez dalga boyunu 1, 300 veya 1.700 nanometreye ayarlayın, ardından femtosaniye lazeri önceden cıvıldamak ve üç fotonlu görüntüleme için darbe süresini optimize etmek için darbe kompresörlerini ışık yoluna yerleştirin.Lazer geçirgenliğini en üst düzeye çıkarmak için silikon plaka ve lazer yolu arasındaki açıyı Brewster'ın açısında ayarlayın, ardından yansımayı en aza indirerek Brewster'ın açısını elde etmek için silikon plakayı döndürün. Ardından, 1.300 ve 1.700 nanometre ışın hatları arasında rahatça geçiş yapmak için paletli aynalar yerleştirin. Lazerin yoğunluğunu kontrol etmek için bir dönme aşamasına monte edilmiş yarım dalga plakası ve polarize edici bir ışın ayırıcı yerleştirin, ardından ışın ayırıcının yansıma yoluna bir ışın engelleyici yerleştirin.0,5 santimetre% 2 yüksek erime noktası agar ile bir Petri kabı hazırlayın. Agar soğuduktan ve katılaştıktan sonra, agarda balıktan daha uzun ve biraz daha geniş dikdörtgen bir delik açın. Balmumu kullanarak, Petri kabına ince bir boruyu, dikdörtgende bir ucu ve Petri kabının kenarına daha büyük çaplı bir boru ile takın.Daha sonra, balığı mililitre trikain çözeltisi başına 0.2 miligramlık bir çözeltiye yerleştirerek anestezi yapın, daha sonra anestezi altındaki balığı ıslak bir sünger üzerine yan tarafına yerleştirin, daha sonra bir mikroşırınga kullanarak, balığı felç etmek için retro-orbital olarak 3 mikrolitre pankuronyum bromür enjekte edin ve tamamen felç olmasını sağlamak için kısaca Hank'in çözeltisine yerleştirin. Daha sonra, balığın sırt tarafını Petri kabına yukarı doğru yerleştirin, ardından forseps kullanarak, balığın ağzını yavaşça açın ve tüpü ağzına kaydırın. Balıkları yavaşça boruya doğru kaydırın, böylece boru balığın ağzının arkasında olacaktır.Hızlıca, ama nazikçe, agar'ı balığın etrafında kurutun ve balığın üstündeki suyu çıkarın. Küçük bir laboratuvar dokusu parçasını laboratuvar yapıştırıcısına batırın ve dokuyu balığın her iki tarafındaki agarın üzerine ve balığın sırt kaudalinin üzerinden solungaçlara koyun. Daha sonra, doğrudan başın yüzeyine küçük bir damla bupivakain yerleştirerek balığın derisini uyuşturun, ardından Petri kabını balıkla birlikte mikroskopa getirin.Kabı balık tesisi suyuyla doldurun ve sistem suyunu balığın ağzına pompalamak için boruya bir su pompasına bağlayın. Suyun bir kabarcıkla oksijenlendiğinden ve bir akvaryum ısıtıcısıyla 30 santigrat dereceye kadar ısıtıldığından emin olun. Görüntüleme için, üç fotonlu mikroskopa düşük büyütmeli bir hedef yerleştirin, ardından balıkları ve tüpleri içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin ve Petri kabını aydınlatmak için bir LED ışık kaynağı kullanın.Görüntü alma yazılımından Kamera modunu açın, Canlı'yı tıklayın, ekranın sağ tarafındaki A kanalını seçin ve görüntüyü net bir şekilde görmek için histogram ayarlarını yapın. Motor kontrolöründeki motor ayarını tabana ayarladıktan sonra, balık görünene kadar hedefi düşürün. Balık kafasının merkezini görüş alanının merkezine yerleştirin, ardından hedefi balığın kafasından yukarı ve uzağa hareket ettirin.Düşük büyütmeli objektif lensi, üç fotonlu görüntüleme için yüksek sayısal diyaframlı objektif lensle değiştirin, ardından balığın kafasına doğru yaklaştırın. Tüm motorların eksen değerlerini sıfıra ayarlayın. Objektif lensi yavaşça alçaltın, objektifin kafaya fiziksel olarak temas etmemesini sağlayın.CCD kamera yazılımında, başın üst kısmı göründüğünde hedefi hareket ettirmeyi bırakın ve X, Y ve Z konumlarını sıfıra ayarlayın. LED ışık kaynağını kapatın ve sistemin etrafındaki karanlık perdeyi kapatın, ardından görüntüleme alma yazılımını üç fotonlu görüntüleme için çoklu foton GG moduna ayarlayın ve objektif lensin altındaki gücü bir miliwatt'tan daha az bir değere ayarlayın. Görüntü alma yazılımındaki Canlı düğmesine tıklayın.PMT kanallarını açın ve PMT kazancını ve arka plan seviyesini gerektiği gibi ayarlayın. THG kanalını büyük kan damarlarından ve pencere camı yüzeyinden izleyerek başın yüzeyini bulmak için objektif lensi yavaşça yukarı doğru hareket ettirin. Hedef lensi pencereye yaklaştırdıktan sonra, objektif ile kafatası penceresi arasına su uygulayın, ardından tüm motorların eksen değerlerini sıfıra ayarlayın.Görüntü alma yazılımındaki Canlı düğmesine tıklayın. PMT kanallarını açın ve PMT kazancını ve arka plan seviyesini gerektiği gibi ayarlayın, ardından THG kanalını büyük kan damarlarından ve pencere camı yüzeyinden izleyerek kapak kaymasının yüzeyini bulmak için objektif lensi yavaşça yukarı doğru hareket ettirin. Gerekirse pencere yönünü ayarlayın, ardından beynin yüzeyini tanımlamak için motorları sıfırlayın.Görüntüleme gerçekleştirin ve güç seviyesini görüntüleme derinliğine göre ayarlayın. Yetişkin zebra balığı beynindeki genetik olarak etiketlenmiş nöronların yüksek çözünürlüklü, invaziv olmayan ve derin görüntülemesi, üç foton mikroskobu kullanılarak elde edilir. Optik tektum ve beyincikteki hücre katmanlarının dağılımı da gözlemlenebilir.Mikroskobun kamera özelliği balığın yerini belirlemek için kullanıldı. Kafatası, beyinde gezinmeye ve üst yüzeyi bulmaya yardımcı olan THG kanalında görülür. Nöronlar, yetişkin beyninin derinliklerinde yüksek sinyal-arka plan oranı ile ayırt edilebilir.GCaMP6s etiketli nöronların ve Teksas Kırmızı etiketli kan damarlarının çok renkli üç foton görüntüleri, yetişkin fare beynindeki THG sinyalleri ile birlikte burada gösterilmektedir. Kurulum optimizasyonu ile, CA1 hipokampus bölgesindeki beyin yüzeyinden 1,2 milimetreye kadar yüksek kontrastlı görüntüler başarıyla elde edildi. GCaMP6s etiketli nöronların kalsiyum aktivitesi izleri, 10 dakikalık bir kayıt oturumu için 750 mikrometre derinlikte yüksek kayıt doğruluğu gösterdi.Bu kurulum, beyin fonksiyonunu anlamak için nöronal aktiviteyi görselleştirmeye yardımcı olabilir. Çeşitli biyolojik sistemleri anlamak için biyolojik doku içindeki hücre hareketini izlemek için de kullanılabilir. Ek olarak, hayvanın sağlığını izlemek için kan akış hızı da ölçülebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...