Name: ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium
Uploaded: 2022-04-06T13:00:00
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L’étude a été financée par le Conseil de l’énergie atomique de Taïwan (subvention n° A-IE-01-03-02-02), le ministère de la Science et de la Technologie (subvention n° NMRPG3E6202-3) et le projet de recherche médicale Chang Gung (subvention n° CMRPG3H1281).

Toutes les procédures expérimentales dans les études animales ont été approuvées par le comité d’éthique de la recherche de l’hôpital Chang Gung Memorial et ont adhéré à la déclaration ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
1. Modèle de cicatrisation ex vivo de l’épithélium cornéen de souris
<ol><li>Préparation des souris<ol><li>Administrer une anesthésie générale à des souris C57BL/6 par administ...

<ol>
	<li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. 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F., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+corneal+injury.">Animal models of corneal injury.</a> Bio Protocol. 5 (13), 1516 (2015).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+function+of+mesenchymal+stem+cells+in+corneal+injury.">Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).</li><li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+corneal+epithelial+wound+healing+in+vitro+and+in+vivo+by+annexin+A5.">Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).</li><li>Murataeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB2R+receptors+are+upregulated+with+corneal+injury+and+regulate+the+course+of+corneal+wound+healing.">Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).</li><li>Carter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+impact+of+2D+and+3D+culture+conditions+on+the+therapeutic+effects+of+human+mesenchymal+stem+cell+secretome+on+corneal+wound+healing+in+vitro+and+ex+vivo.">Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo.</a> Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).</li><li>Sanie-Jahromi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+limbal+stem+cells+on+polycaprolactone+and+polycaprolactone/gelatin+fibrous+scaffolds+and+transplantation+in+animal+model.">Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model.</a> Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).</li><li>Sun, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+membrane+protein+(EMP2)+antibody+blockade+reduces+corneal+neovascularization+in+an+In+vivo+model.">Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptor+1+suppresses+transient+receptor+potential+vanilloid+1-induced+inflammatory+responses+to+corneal+injury.">Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury.</a> Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).</li><li>Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+mouse+model+of+grade+II+corneal+alkali+burn.">Research on mouse model of grade II corneal alkali burn.</a> International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).</li><li>Oh, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+protein+TSG-6+reduces+inflammatory+damage+to+the+cornea+following+chemical+and+mechanical+injury.">Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+effects+of+biohcly+in+an+in+vivo+model+of+mechanical+wounds+in+the+rabbit+cornea.">Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+nintedanib+thermos-sensitive+hydrogel+on+neovascularization+in+alkali+burn+rat+model.">Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model.</a> International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cells+on+cornea+wound+healing+induced+by+alkali+burn.">Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn.</a> PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).</li></ol>

Les modèles de lésions cornéennes chez la souris et le lapin fournissent une plate-forme ex vivo et in vivo utile pour surveiller la cicatrisation des plaies, tester de nouveaux traitements et étudier les mécanismes sous-jacents de la cicatrisation des plaies et des voies de traitement. Différents modèles animaux peuvent être utilisés pour une expérience à court ou à long terme, selon le but de la recherche. Par exemple, après avoir créé un défaut épithélial sur la cornée de souri...

La cornée humaine se compose de cinq couches principales et joue un rôle central dans la réfraction oculaire pour maintenir l’acuité visuelle et l’intégrité structurelle afin de protéger les tissus intraoculaires1. La partie la plus externe de la cornée est l’épithélium cornéen, composé de cinq à six couches de cellules qui se différencient séquentiellement des cellules basales et se déplacent vers le haut pour se détacher de la surface oculaire1. Comparée à la cornée chez l’homme et le lapin néo-zélandais, la cornée de souris a une structure cornéenne similaire, mais une périphérie plus mince que la partie centrale en raison d’une épaisseur réduite de l’épithélium et du stroma2. En raison de sa position unique dans le système optique oculaire, de nombreuses agressions externes telles que les blessures mécaniques, l’inoculation bactérienne et les agents chimiques peuvent facilement mettre en danger l’intégrité épithéliale et entraîner un défaut de l’épithélium menaçant la vision, une kératite infectieuse, une fusion de la cornée et même une perforation cornéenne.
Bien que divers agents thérapeutiques, tels que les lubrifiants, les antibiotiques, les agents anti-inflammatoires, les produits auto-sérums et la membrane amniotique aient déjà été utilisés pour améliorer la réépithélialisation et réduire les cicatrices, d’autres modalités de traitement potentielles pouvant permettre la cicatrisation des plaies, réduire l’inflammation et supprimer la formation de cicatrices sont encore en cours de développement et de test sur différentes plateformes. Divers modèles animaux pour la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes ont été proposés, y compris l’ablation de l’épithélium cornéen avec un dissolvant de l’anneau de rouille cornéenne chez la sourisdiabétique 3, les rayures linéaires sur l’épithélium cornéen de souris par une aiguille stérile de 25 G pour l’inoculation bactérienne4, l’élimination assistée par tréphine de l’épithélium par un dissolvant de l’anneau de rouille cornéenne5, la cautérisation épithéliale sur la moitié de la cornée et des limbes6 , abrasion cornéenne du lapin facilitée par la tréphine par une lame de scalpel émoussée7, et lésion de la cornée bovine par congélation instantanée dans de l’azote liquide8.
Outre les lésions mécaniques de l’épithélium cornéen, les agents chimiques sont également des insultes courantes à la surface oculaire, en particulier les agents acides et alcalins. L’hydroxyde de sodium (NaOH, 0,1-1 N pendant 30-60 s) est l’un des produits chimiques couramment utilisés dans les modèles murins et lapins de brûlure chimique cornéenne 9,10,11,12,13. L’éthanol à 100% avait également été appliqué sur la cornée dans le modèle de brûlure chimique chez le rat, suivi d’un grattage mécanique supplémentaire à l’aide d’une lame chirurgicale14. Étant donné que le maintien d’une surface oculaire saine repose sur des unités fonctionnelles, notamment les paupières, les glandes de Meibomius, le système lacrymal, la conjonctive et la cornée, les modèles animaux in vivo présentent certains avantages par rapport aux cellules épithéliales cornéennes ou aux tissus cornéens en culture ex vivo. Dans cet article, le modèle murin de plaie d’abrasion cornéenne et le modèle de lapin de brûlure alcaline cornéenne sont démontrés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6/0 Ethicon vicryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6/0VICRYL</td>
			<td>tarsorrhaphy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer lid speculum</td>
			<td>katena</td>
			<td>K1-5355</td>
			<td>15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer needle holder</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K6-3310</td>
			<td>without lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barron Vacuum Punch 8.0 mm</td>
			<td>katena</td>
			<td>K20-2108</td>
			<td>for cutting filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>National Laboratory Animal Center</td>
			<td>RMRC11005</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo forceps 0.12 mm</td>
			<td>katena</td>
			<td>K5-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr</td>
			<td>Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX</td>
			<td>CHI-675</td>
			<td>for debridement of the corneal epithelium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Toyo Roshi Kaisha,Ltd.</td>
			<td>1.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P</td>
			<td>OPTITECH</td>
			<td>OPTFL100</td>
			<td>staining for corneal epithelial defect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61763-23-3</td>
			<td>intraperitoneal or intramuscular anesthetics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Zealand White Rabbits</td>
			<td>Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td>
			<td>100-120-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>ALC2UD09</td>
			<td>topical anesthetics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punch 2mm</td>
			<td>STIEFEL</td>
			<td>22650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>a chemical agent for alkali burn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA</td>
			<td>SV11</td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westcott Tenotomy Scissors Medium</td>
			<td>katena</td>
			<td>K4-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL</td>
			<td>Elanco animal health Korea Co., LTD.</td>
			<td>047-956</td>
			<td>intraperitoneal or intramuscular anesthetics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium

Les lésions cornéennes à la surface oculaire, y compris les brûlures chimiques et les traumatismes, peuvent causer de graves cicatrices, un symblepharon, un déficit en cellules souches limbiques cornéennes et entraîner un défaut épithélial cornéen important et persistant. Un défaut épithélial avec l’opacité cornéenne suivante et une néovascularisation périphérique entraînent une déficience visuelle irréversible et entravent la prise en charge future, en particulier la kératoplastie. Étant donné que le modèle animal peut être utilisé comme une plate-forme de développement de médicaments efficace, des modèles de lésion cornéenne à la souris et de brûlure alcaline à l’épithélium cornéen de lapin sont développés ici. Le lapin blanc de Nouvelle-Zélande est utilisé dans le modèle de brûlure alcaline. Différentes concentrations d’hydroxyde de sodium peuvent être appliquées sur la zone circulaire centrale de la cornée pendant 30 s sous anesthésie intramusculaire et topique. Après une abondante irrigation isotonique normale de la solution saline, l’épithélium cornéen lâche résiduel a été enlevé avec une bavure cornéenne profondément jusqu’à la couche de Bowman dans cette zone circulaire. La cicatrisation des plaies a été documentée par coloration à la fluorescéine sous lumière bleu cobalt. Des souris C57BL/6 ont été utilisées dans le modèle traumatique de l’épithélium cornéen murin. La cornée centrale murine a été marquée à l’aide d’un poinçon cutané de 2 mm de diamètre, puis débridée par un dissolvant d’anneau de rouille cornéenne avec une bavure de 0,5 mm sous stéréomicroscope. Ces modèles peuvent être utilisés prospectivement pour valider l’effet thérapeutique des gouttes ophtalmiques ou des agents mixtes tels que les cellules souches, qui facilitent potentiellement la régénération épithéliale cornéenne. En observant l’opacité cornéenne, la néovascularisation périphérique et la congestion conjonctivale avec un stéréomicroscope et un logiciel d’imagerie, les effets thérapeutiques de ces modèles animaux peuvent être surveillés.

Modèle de cicatrisation ex vivo de l’épithélium cornéen de la souris: Après débridement in vivo de l’épithélium cornéen de souris avec un dissolvant d’anneau de rouille cornéen portatif, une zone cornéenne centrale légèrement déprimée avec une coloration positive à la fluorescéine peut être trouvée dans la zone centrale de 2 mm (Figure 3A-B). Après avoir récolté le globe ocul...

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Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Ici, des modèles animaux basés sur la souris et le lapin sont développés pour les lésions mécaniques et chimiques de l’épithélium cornéen afin de cribler de nouveaux traitements et le mécanisme sous-jacent.

Modèles animaux ex vivo et in vivo pour les lésions mécaniques et chimiques de l’épithélium cornéen

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, ...

Des modèles animaux ex vivo et in vivo ont été mis en place pour étudier les lésions cornéennes mécaniques et chimiques. La technique fournit une plate-forme facile à construire pour les chercheurs pour étudier les lésions mécaniques et chimiques de la cornée. Pour créer une plaie épithéliale cornéenne murine, marquez la cornée centrale de la souris anesthésiée à l’aide d’un coup de biopsie cutanée pour confirmer une zone bien circonscrite et bien mesurable de la plaie.Indentez doucement le poinçon sur la cornée centrale pour laisser une marque circulaire Débridez l’épithélium cornéen jusqu’à la couche de Bowman à l’aide d’un dissolvant d’anneau de rouille cornéen tenu à la main avec une bavure de 0,5 millimètre en veillant à ne pas endommager la couche de Bowman. Retirez les tissus lâches résiduels dans le bord de la plaie avec une pince cornéenne. Confirmez la zone de débridement avec coloration fluorescente en mettant une goutte de solution saline normale sur un papier fluorescéine pour dissoudre la fluorescéine, puis en plaçant la goutte contenant de la fluorescéine sur le défaut épithélial murin pour le visualiser sous lumière bleu cobalt.Procéder à la culture ex vivo du modèle de plaie par abrasion cornéenne murine en appuyant doucement sur les bords orbitaux supérieur et inférieur des souris euthanasiées pour pousser le globe oculaire vers l’extérieur. Introduisez la pointe des ciseaux cornéens fermés dans l’espace rétrobulbaire le long de la paroi orbitale inférieure en veillant à ne pas pénétrer dans le globe oculaire. Maintenez le globe oculaire stable avec une pince cornéenne de 0,3 millimètre, puis coupez le nerf optique et les tissus mous périorbitaires avec des ciseaux cornéens pour isoler le globe oculaire.Pour la culture ex vivo de globes oculaires murins, préparez une plaque de 48 puits avec de la cire fondue à l’intérieur du puits et attendez la solidification, puis avec la pointe de pinces conjonctives, créez un trou rond sur la surface de la cire solidifiée pour accueillir les globes oculaires. Placez les globes oculaires récoltés directement sur la plaque de 48 puits avec des fonds et des parois latérales recouverts de cire pour établir la stabilisation. Culture des globes oculaires avec du DMEM contenant 1% de sérum fœtal bovin avec ou sans antibiotiques selon le but de l’étude.Immergez la surface oculaire avec le milieu de culture sans faire flotter le globe oculaire et documentez le déroulement de la cicatrisation des plaies en colorant à la fluorescéine et en recueillant des photographies avec un appareil photo numérique sous lumière bleu cobalt. Pour provoquer une brûlure alcaline, placez un papier filtre circulaire d’un diamètre de 8 millimètres dans une boîte de Pétri. À l’aide d’un compte-gouttes, ajouter 0,5 hydroxyde de sodium normal dans la boîte de Petri pour faire tremper les papiers filtres et égoutter l’excès de solution du papier filtre avant de les placer sur la cornée de lapin anesthésiée.Après avoir ouvert les paupières avec un spéculum de paupière, assurez-vous que la membrane nictitante du lapin n’interfère pas avec l’insertion du papier filtre et placez le papier filtre imbibé d’alcalin sur la cornée centrale pendant 30 secondes. Retirez le papier filtre et rincez la surface oculaire avec 10 millilitres de solution saline normale pour éliminer les matières alcalines. Pour compléter le défaut cornéen, débrider l’épithélium cornéen dans la zone opacifiée jusqu’à la membrane de Bowman à l’aide d’un dissolvant d’anneau de rouille cornéen.Confirmer la zone de débridement avec coloration à la fluorescéine sous la lumière bleu cobalt et enlever l’épithélium cornéen résiduel à l’aide d’une pince cornéenne. Pour sécuriser l’état de la plaie avec tarsorrhaphie, confirmer que la membrane nictitante recouvre en douceur la surface oculaire et le défaut épithélial cornéen du côté nasal. Effectuer une tarsorrhaphie temporaire avec ou sans agents topiques en utilisant une suture 6-0 pour protéger la surface oculaire et empêcher le lapin de la gratter, s’assurer que la suture pour la tarsorrhaphie est à 3 à 4 millimètres des bords supérieur et inférieur de la paupière avec quatre à cinq attaches et des nœuds plus longs pour empêcher le lapin de casser les sutures.Dans le modèle de cicatrisation ex vivo de l’épithélium cornéen de souris, la zone cornéenne centrale légèrement déprimée avec une coloration positive à la fluorescéine a été observée dans la zone centrale deux millimètres après le débridement in vivo de l’épithélium cornéen de la souris. La culture ex vivo des globes oculaires murins fixés sur une plaque de culture de 48 puits recouverte de cire a été examinée et documentée quotidiennement dans une plaque de culture de 48 puits sous un stéréomicroscope. Un jour après avoir dévié de l’épithélium cornéen murin, un défaut épithélial circulaire coloré à la fluorescéine de 2 millimètres de diamètre a été révélé sur des photographies numériques obtenues sous lumière bleu cobalt.Après avoir créé une lésion alcaline à l’épithélium cornéen du lapin, une coloration positive à la fluorescéine a été observée avec ou sans lumière bleu cobalt sur la cornée centrale avec une marge circulaire claire et complète. La réépithélialisation de la plaie épithéliale cornéenne avec croissance du pannus a été observée à partir du limbe. Les étapes les plus importantes sont des procédures visant à créer des défauts épithéliaux lisses et uniformes sur les surfaces cornéennes de souris et de lapins.De nouveaux traitements médicaux et chirurgicaux peuvent être testés sur ces plateformes. L’effet de la réépithélialisation peut être surveillé après les procédures. La néovascularisation cornéenne et l’opacité après une lésion dans ce protocole constitueraient un besoin non satisfait pour des recherches supplémentaires.

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