Name: ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium
Uploaded: 2022-04-06T13:00:00
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El estudio fue financiado por el Consejo de Energía Atómica de Taiwán (Subvención No. A-IE-01-03-02-02), el Ministerio de Ciencia y Tecnología (Subvención No. NMRPG3E6202-3) y el Proyecto de Investigación Médica Chang Gung (Subvención No. CMRPG3H1281).

Todos los procedimientos experimentales en estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación del Chang Gung Memorial Hospital y se adhirieron a la declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.
1. Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón
<ol><li>Preparación de los ratones<ol><li>Administrar anestesia general a ratones C57BL/6 mediante administración intra...

<ol>
	<li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensions+and+morphology+of+the+cornea+in+three+strains+of+mice.">Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MANF+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+and+nerve+regeneration+by+attenuating+hyperglycemia-induced+endoplasmic+reticulum+stress.">MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress.</a> Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+injury-induced+norepinephrine+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+keratitis.">Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis.</a> Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).</li><li>Chan, M. F., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+corneal+injury.">Animal models of corneal injury.</a> Bio Protocol. 5 (13), 1516 (2015).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+function+of+mesenchymal+stem+cells+in+corneal+injury.">Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).</li><li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+corneal+epithelial+wound+healing+in+vitro+and+in+vivo+by+annexin+A5.">Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).</li><li>Murataeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+CB2R+receptors+are+upregulated+with+corneal+injury+and+regulate+the+course+of+corneal+wound+healing.">Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).</li><li>Carter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+impact+of+2D+and+3D+culture+conditions+on+the+therapeutic+effects+of+human+mesenchymal+stem+cell+secretome+on+corneal+wound+healing+in+vitro+and+ex+vivo.">Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo.</a> Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).</li><li>Sanie-Jahromi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+limbal+stem+cells+on+polycaprolactone+and+polycaprolactone/gelatin+fibrous+scaffolds+and+transplantation+in+animal+model.">Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model.</a> Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).</li><li>Sun, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+membrane+protein+(EMP2)+antibody+blockade+reduces+corneal+neovascularization+in+an+In+vivo+model.">Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptor+1+suppresses+transient+receptor+potential+vanilloid+1-induced+inflammatory+responses+to+corneal+injury.">Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury.</a> Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).</li><li>Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+protein+TSG-6+reduces+inflammatory+damage+to+the+cornea+following+chemical+and+mechanical+injury.">Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+effects+of+biohcly+in+an+in+vivo+model+of+mechanical+wounds+in+the+rabbit+cornea.">Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+nintedanib+thermos-sensitive+hydrogel+on+neovascularization+in+alkali+burn+rat+model.">Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model.</a> International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).</li><li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cells+on+cornea+wound+healing+induced+by+alkali+burn.">Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn.</a> PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).</li></ol>

Los modelos de ratón y conejo de lesión corneal proporcionan una plataforma útil ex vivo e in vivo para monitorear la cicatrización de heridas, probar nuevas terapias y estudiar los mecanismos subyacentes de las vías de curación y tratamiento de heridas. Se pueden utilizar diferentes modelos animales para un experimento a corto o largo plazo, dependiendo del propósito de la investigación. Por ejemplo, después de crear un defecto epitelial en la córnea de ratón in vivo, se podría usa...

La córnea humana consta de cinco capas principales y desempeña un papel fundamental en la refracción ocular para mantener la agudeza visual y la integridad estructural para proteger los tejidos intraoculares1. La parte más externa de la córnea es el epitelio corneal, compuesto por cinco a seis capas de células que se diferencian secuencialmente de las células basales y se mueven hacia arriba para desprenderse de la superficie ocular1. En comparación con la córnea en humanos y conejos de Nueva Zelanda, la córnea de ratón tiene una estructura corneal similar, pero una periferia más delgada que la parte central debido a un grosor reducido en el epitelio y el estroma2. Debido a su posición única en el sistema óptico ocular, muchos insultos externos como lesiones mecánicas, inoculación bacteriana y agentes químicos pueden poner en peligro fácilmente la integridad epitelial y provocar un defecto epitelial que amenaza la visión, queratitis infecciosa, fusión corneal e incluso perforación corneal.
Aunque varios agentes terapéuticos, como lubricantes, antibióticos, agentes antiinflamatorios, productos de autosuero y membrana amniótica ya se han utilizado para mejorar la reepitelización y reducir las cicatrices, otras posibles modalidades de tratamiento que pueden permitir la cicatrización de heridas, reducir la inflamación y suprimir la formación de cicatrices todavía se están desarrollando y probando en diferentes plataformas. Se han propuesto varios modelos animales para la cicatrización de heridas epiteliales corneales, incluida la eliminación del epitelio corneal con un removedor de anillo de óxido corneal en ratón diabético3, rasguños lineales sobre el epitelio corneal del ratón mediante una aguja estéril de 25 G para la inoculación bacteriana4, eliminación asistida por trepines del epitelio corneal mediante removedor de anillo de óxido corneal5, cauterización epitelial sobre la mitad de la córnea y el limbo6 , abrasión corneal de conejo facilitada por trefina por una hoja de bisturí opaca7, y lesión de la córnea bovina por congelación repentina en nitrógeno líquido8.
Además de la lesión mecánica al epitelio corneal, los agentes químicos también son insultos comunes a la superficie ocular, especialmente los agentes ácidos y alcalinos. El hidróxido de sodio (NaOH, 0.1-1 N para 30-60 s) es uno de los productos químicos comúnmente utilizados en modelos murinos y de conejo de quemaduras químicas corneales 9,10,11,12,13. El etanol al 100% también se había aplicado a la córnea en el modelo de quemadura química de rata, seguido de un desguace mecánico adicional utilizando una cuchilla quirúrgica14. Dado que el mantenimiento de una superficie ocular sana depende de unidades funcionales, incluidos los párpados, las glándulas de Meibomio, el sistema lagrimal, la conjuntiva y la córnea, los modelos animales in vivo tienen algunos méritos sobre las células epiteliales de córnea cultivadas ex vivo o los tejidos corneales. En este artículo, se demuestra el modelo de ratón de la herida por abrasión corneal y el modelo de conejo de quemadura alcalina corneal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6/0 Ethicon vicryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>6/0VICRYL</td>
			<td>tarsorrhaphy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer lid speculum</td>
			<td>katena</td>
			<td>K1-5355</td>
			<td>15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer needle holder</td>
			<td>Katena</td>
			<td>K6-3310</td>
			<td>without lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barron Vacuum Punch 8.0 mm</td>
			<td>katena</td>
			<td>K20-2108</td>
			<td>for cutting filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>National Laboratory Animal Center</td>
			<td>RMRC11005</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo forceps 0.12 mm</td>
			<td>katena</td>
			<td>K5-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr</td>
			<td>Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX</td>
			<td>CHI-675</td>
			<td>for debridement of the corneal epithelium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Toyo Roshi Kaisha,Ltd.</td>
			<td>1.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P</td>
			<td>OPTITECH</td>
			<td>OPTFL100</td>
			<td>staining for corneal epithelial defect</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61763-23-3</td>
			<td>intraperitoneal or intramuscular anesthetics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Zealand White Rabbits</td>
			<td>Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td>
			<td>100-120-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>ALC2UD09</td>
			<td>topical anesthetics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin biopsy punch 2mm</td>
			<td>STIEFEL</td>
			<td>22650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td>a chemical agent for alkali burn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA</td>
			<td>SV11</td>
			<td>microscope for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Westcott Tenotomy Scissors Medium</td>
			<td>katena</td>
			<td>K4-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL</td>
			<td>Elanco animal health Korea Co., LTD.</td>
			<td>047-956</td>
			<td>intraperitoneal or intramuscular anesthetics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium

La lesión corneal en la superficie ocular, incluyendo quemaduras químicas y traumatismos, puede causar cicatrices graves, simblefarón, deficiencia de células madre limbares corneales y provocar un defecto epitelial corneal grande y persistente. El defecto epitelial con la siguiente opacidad corneal y la neovascularización periférica resultan en una discapacidad visual irreversible y dificultan el manejo futuro, especialmente la queratoplastia. Dado que el modelo animal se puede utilizar como una plataforma efectiva de desarrollo de fármacos, aquí se desarrollan modelos de lesión corneal en el ratón y quemaduras alcalinas en el epitelio corneal del conejo. El conejo blanco de Nueva Zelanda se utiliza en el modelo de quema alcalina. Se pueden aplicar diferentes concentraciones de hidróxido de sodio en el área circular central de la córnea durante 30 s bajo anestesia intramuscular y tópica. Después de una copiosa irrigación salina normal isotónica, se eliminó el epitelio corneal suelto residual con rebaba corneal profundamente hasta la capa de Bowman dentro de esta área circular. La cicatrización de heridas se documentó mediante tinción con fluoresceína bajo luz azul cobalto. Se utilizaron ratones C57BL/6 en el modelo traumático de epitelio corneal murino. La córnea central murina se marcó con un punzón de piel, de 2 mm de diámetro, y luego se desbridó con un removedor de anillo de óxido corneal con una rebaba de 0,5 mm bajo un microscopio estereoscópico. Estos modelos se pueden utilizar prospectivamente para validar el efecto terapéutico de gotas para los ojos o agentes mixtos como las células madre, que potencialmente facilitan la regeneración epitelial corneal. Al observar la opacidad corneal, la neovascularización periférica y la congestión conjuntival con estereomicroscopio y software de imágenes, se pueden monitorear los efectos terapéuticos en estos modelos animales.

Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón: Después del desbridamiento in vivo del epitelio corneal del ratón con removedor de anillo de óxido corneal de mano, se puede encontrar un área corneal central ligeramente deprimida con tinción positiva de fluoresceína en el área central de 2 mm (Figura 3A-B). Después de cosechar el globo ocular del ratón, se fijó fáci...

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Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Aquí, se desarrollan modelos animales basados en ratones y conejos para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal para detectar nuevas terapias y el mecanismo subyacente.

Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, ...

Se establecieron modelos animales ex vivo e in vivo para estudiar lesiones corneales mecánicas y químicas. La técnica proporciona una plataforma fácil de construir para que los investigadores estudien las lesiones mecánicas y químicas de la córnea. Para crear una herida epitelial corneal murina, marque la córnea central del ratón anestesiado con un punzón de biopsia de piel para confirmar un área bien circunscrita y bien medible de la herida.Aplique suavemente la punzón sobre la córnea central para dejar una marca circular Desgarre el epitelio corneal hasta la capa de Bowman utilizando un removedor de anillo de óxido corneal de mano con una rebaba de 0,5 milímetros que garantice no dañar la capa de Bowman. Retire los tejidos sueltos residuales en el margen de la herida con fórceps corneales. Confirme el área de desbridamiento con tinción fluorescente poniendo una gota de solución salina normal en un papel de fluoresceína para disolver la fluoresceína y luego colocando la gota que contiene fluoresceína sobre el defecto epitelial murino para visualizarlo bajo luz azul cobalto.Proceda con el cultivo ex vivo del modelo de herida de abrasión corneal murina presionando suavemente los bordes orbitales superior e inferior de ratones sacrificados para empujar el globo ocular hacia afuera. Introducir la punta de las tijeras corneales cerradas en el espacio retrobulbar a lo largo de la pared orbital inferior asegurándose de no penetrar en el globo ocular. Mantenga el globo ocular firme con pinzas corneales de 0,3 milímetros y luego corte el nervio óptico y el tejido blando periorbitario con tijeras corneales para aislar el globo ocular.Para el cultivo ex vivo de globos oculares murinos, prepare una placa de 48 pocillos con cera derretida dentro del pozo y espere la solidificación, luego con la punta de las pinzas de la conjuntiva, cree un orificio redondo en la superficie de la cera solidificada para acomodar los globos oculares. Coloque los globos oculares cosechados directamente sobre la placa de 48 pocillos con fondos y paredes laterales cubiertos de cera para establecer la estabilización. Cultivar los globos oculares con DMEM que contiene 1% de suero bovino fetal con o sin antibióticos, dependiendo del propósito del estudio.Sumerja la superficie ocular con el medio de cultivo sin hacer que el globo ocular flote y documente el curso de la cicatrización de heridas mediante la tinción de fluoresceína y la recolección de fotografías con una cámara digital bajo luz azul cobalto. Para inducir una lesión por quemadura alcalina, coloque un papel de filtro circular con un diámetro de 8 milímetros en una placa de Petri. Usando un gotero, agregue 0.5 hidróxido de sodio normal en la placa de Petri para remojar los papeles de filtro y drenar el exceso de solución del papel de filtro antes de colocarlos en la córnea de conejo anestesiada.Después de abrir los párpados con un espéculo del párpado, asegúrese de que la membrana nictitante del conejo no interfiera con la inserción del papel de filtro y coloque el papel de filtro empapado en álcali sobre la córnea central durante 30 segundos. Retire el papel de filtro y enjuague la superficie ocular con 10 mililitros de solución salina normal para eliminar el material alcalino. Para completar el defecto corneal, desbridar el epitelio corneal dentro del área opacificada hasta la membrana de Bowman usando un removedor de anillo de óxido corneal.Confirme el área de desbridamiento con tinción fluoresceínica bajo la luz azul cobalto y retire el epitelio corneal residual con fórceps corneales. Para asegurar la condición de la herida con tarsorrafia, confirme que la membrana nictitante cubre suavemente la superficie ocular y el defecto epitelial corneal en el lado nasal. Realice una tarsorrafia temporal con o sin agentes tópicos utilizando una sutura 6-0 para proteger la superficie ocular y para evitar que el conejo se rasque, asegúrese de que la sutura para la tarsorrafia esté a 3 a 4 milímetros de los márgenes superior e inferior del párpado con cuatro a cinco lazos y nudos más largos para evitar que el conejo rompa las suturas.En el modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón, se observó el área corneal central ligeramente deprimida con tinción positiva de fluoresceína en los dos milímetros centrales después del desbridamiento in vivo del epitelio corneal del ratón. El cultivo ex vivo de los globos oculares murinos fijados en una placa de cultivo de 48 pocillos recubierta de cera se examinó y documentó diariamente dentro de una placa de cultivo de 48 pocillos bajo un microscopio estéreo. Un día después de desbridar el epitelio corneal murino, se reveló un defecto epitelial circular teñido con fluoresceína de 2 milímetros de diámetro en fotografías digitales obtenidas bajo luz azul cobalto.Después de crear una lesión alcalina en el epitelio corneal del conejo, se observó tinción positiva de fluoresceína con o sin luz azul cobalto sobre la córnea central con un margen circular claro y completo. La reepitelización de la herida epitelial corneal con crecimiento interno de pannus se observó desde el limbo. Los pasos más importantes son los procedimientos para crear defectos epiteliales lisos e incluso en las superficies corneales de ratones y conejos.Se pueden probar nuevas terapias médicas y quirúrgicas en estas plataformas. El efecto de la reepitelización puede ser monitoreado después de los procedimientos. La neovascularización corneal y la opacidad después de la lesión en este protocolo serían una necesidad insatisfecha de investigación adicional.

Research

JoVE Journal

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