Name: in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

المنح الخارجية لديليب فاسوديفان من مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، حكومة الهند [CRG / 2018 / 000695 / PS] وإدارة التكنولوجيا الحيوية ، وزارة العلوم والتكنولوجيا ، حكومة الهند [BT / INF / 22 / SP33046 / 2019] ، بالإضافة إلى الدعم الداخلي من معهد علوم الحياة ، بوبانسوار معترف بها إلى حد كبير. نشكر السيدة سوديشنا سين والسيدة أنابورنا ساهو على مساعدتهما في إعداد الهيستون. كما نعرب عن تقديرنا للمناقشات مع زملائنا الدكتور تشينمايي موهاباترا والسيد ماناس كومار جاغديف والدكتور شيخ نوساد حسين.

1. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتوضيح الحالة قليلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون
<ol><li>تحليل الحالة قليلة القسيمات لمرافقي هيستون<ol><li>موازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي (SEC) سعة 24 مل مع حجم عمود 1.2 (CV)، أي 28.8 مل من المخزن المؤقت SEC المنزوع الغازات [20 mM من Tris-...

<ol>
	<li>H&#252;bner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+and+transcriptional+regulation.">Chromatin organization and transcriptional regulation.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).</li><li>Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nucleosome+dynamics+and+their+links+to+gene+expression+and+DNA+replication.">Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).</li><li>Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+histone+H4+depletion+on+the+cell+cycle+and+transcription+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).</li><li>Prado, F., Aguilera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+depletion+of+histone+H4+increases+homologous+recombination-mediated+genetic+instability.">Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).</li><li>Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stoichiometry+of+histone+dimer+sets+is+necessary+for+high+fidelity+of+mitotic+chromosome+transmission.">Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission.</a> Cell. 44 (1), 43-52 (1986).</li><li>Groth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Asf1+regulates+the+flow+of+S+phase+histones+during+replicational+stress.">Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress.</a> Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).</li><li>Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomes+are+assembled+by+an+acidic+protein+which+binds+histones+and+transfers+them+to+DNA.">Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA.</a> Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).</li><li>Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+shuffle:+histone+chaperones+in+an+energetic+dance.">The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).</li><li>Akey, C. W., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+and+nucleosome+assembly.">Histone chaperones and nucleosome assembly.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).</li><li>De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+An+escort+network+regulating+histone+traffic.">Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).</li><li>Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+30+years+from+isolation+to+elucidation+of+the+mechanisms+of+nucleosome+assembly+and+disassembly.">Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).</li><li>Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+largest+subunit+of+chromatin+assembly+factor+1:+importance+in+vitro+and+during+Xenopus+early+development.">Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development.</a> EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).</li><li>Ray-Gallet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIRA+is+critical+for+a+nucleosome+assembly+pathway+independent+of+DNA+synthesis.">HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).</li><li>Frehlick, L. J., Eir&#237;n-L&#243;pez, J. M., Ausi&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).</li><li>Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+NAP-1+is+a+core+histone+chaperone+that+functions+in+ATP-facilitated+assembly+of+regularly+spaced+nucleosomal+arrays.">Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).</li><li>Els&#228;sser, S. J., D'Arcy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+mechanism+for+histone+chaperones.">Towards a mechanism for histone chaperones.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).</li><li>Rodr&#237;guez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+competent+chromatin+assembled+with+exogenous+histones+in+a+yeast+whole+cell+extract.">Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract.</a> Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).</li><li>Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+chromatin+containing+recombinant+Drosophila+core+histones.">Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtt106p+is+a+histone+chaperone+involved+in+heterochromatin-mediated+silencing.">Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).</li><li>Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+chaperone+nucleophosmin+enhances+acetylation-dependent+chromatin+transcription.">Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).</li><li>Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtFKBP53:+A+chimeric+histone+chaperone+with+functional+nucleoplasmin+and+PPIase+domains.">AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains.</a> Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).</li><li>Scofield, B. T. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Electrophoresis. , (2012).</li><li>Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialysis+and+concentration+of+protein+solutions.">Dialysis and concentration of protein solutions.</a> Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).</li><li>Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+analysis+of+recombinant+importin-histone+complexes+using+analytical+ultracentrifugation.">Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation.</a> Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).</li><li>Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+current+methods+in+sedimentation+velocity+and+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2013).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-distribution+analysis+of+macromolecules+by+sedimentation+velocity+ultracentrifugation+and+Lamm+equation+modelling.">Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+Arabidopsis+thaliana+NAP1-related+protein+2+(AtNRP2)+and+comparison+with+its+homolog+AtNRP1.">Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1.</a> Molecules. 24 (12), 2258 (2019).</li><li>Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAF-1-induced+oligomerization+of+histones+H3/H4+and+mutually+exclusive+interactions+with+Asf1+guide+H3/H4+transitions+among+histone+chaperones+and+DNA.">CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).</li><li>Bowman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+chaperones+Vps75+and+Nap1+form+ring-like,+tetrameric+structures+in+solution.">The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).</li><li>Newman, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+multimeric+assemblies+of+nucleosome+assembly+protein+and+histones+revealed+by+small-angle+X-ray+scattering+and+electron+microscopy.">Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).</li><li>Edlich-Muth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pentameric+nucleoplasmin+fold+is+present+in+Drosophila+FKBP39+and+a+large+number+of+chromatin-related+proteins.">The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).</li><li>Franco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+ability+of+nucleoplasmin+to+assemble+and+chaperone+histone+octamers+for+DNA+deposition.">Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).</li><li>Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FK506-binding+protein,+Fpr4,+is+an+acidic+histone+chaperone.">The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone.</a> FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).</li><li>Graziano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hydrophobic+effect+in+the+salt-induced+dimerization+of+bovine+beta-lactoglobulin+at+pH+3.">Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3.</a> Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).</li><li>Burgess, R. J., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+in+nucleosome+assembly+and+human+disease.">Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).</li><li>Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+histone+chaperone+yeast+Asf1+in+the+assembly+and+disassembly+of+histone+H3/H4-DNA+complexes.">The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).</li><li>Avvakumov, N., Nourani, A., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+Modulators+of+chromatin+marks.">Histone chaperones: Modulators of chromatin marks.</a> Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).</li><li>Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperoning+histones+during+DNA+replication+and+repair.">Chaperoning histones during DNA replication and repair.</a> Cell. 140 (2), 183-195 (2010).</li><li>Chu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+electrostatic+interactions+in+the+association+of+intrinsically+disordered+histone+chaperone+Chz1+and+histone+H2A.Z-H2B.">Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B.</a> PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).</li><li>Heidarsson, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+proteins+enable+histone+chaperoning+on+the+nucleosome.">Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

يوضح هذا العمل ويتحقق من صحة مجموعة شاملة من البروتوكولات للتوصيف البيوكيميائي والبيوفيزيائي لمرافق هيستون المفترض. هنا ، تم استخدام بروتينات عائلة NAP المعبر عنها والمنقاة ، AtNRP1 و AtNRP2 ، ومجال بلازما النواة N-terminal ل AtFKBP53 لإظهار البروتوكولات. يمكن استخدام نفس المجموعة من التجارب لتحديد الس?...

تشكل النيوكليوسومات المكونة من الحمض النووي وبروتينات هيستون الوحدة الهيكلية للكروماتين وتنظم العديد من الأحداث الخلوية الحرجة. يتم تغيير موضع النيوكليوسومات ديناميكيا وإعادة تشكيلها لجعل الحمض النووي في متناول العمليات المختلفة مثل النسخ المتماثل والنسخ والترجمة 1,2. الهستونات الأساسية للغاية إما تميل إلى التفاعل مع البروتينات الحمضية في الوسط الخلوي أو تخضع للتجميع ، مما يؤدي إلى عيوب خلوية مختلفة3،4،5. تساعد مجموعة من البروتينات المخصصة تسمى مرافقو هيستون في نقل الهستونات من السيتوبلازم إلى النواة ومنع أحداث تجميع الحمض النووي الهستون الشاذة 6,7. بشكل أساسي ، تقوم معظم مرافقات الهستون بتخزين ونقل الهستونات إلى الحمض النووي بالقوة الأيونية الفسيولوجية ، مما يساعد على تكوين النيوكليوسومات 8,9. بعض مرافقي هيستون لديهم تفضيل واضح لأوليغومرات هيستون H2A / H2B أو H3 / H410.
تتميز مرافقات هيستون بناء على قدرتها على تجميع النيوكليوسومات المعتمدة أو المستقلة عن تخليق الحمض النووي11. على سبيل المثال ، يعتمد عامل تجميع الكروماتين -1 (CAF-1) بينما منظم هيستون A (HIRA) مستقل عن تخليق الحمض النووي12,13. وبالمثل ، تشارك عائلة النيوكليوبلازمين من مرافقي هيستون في تكثيف كروماتين الحيوانات المنوية وتجميع النيوكليوسوم14. يسهل أفراد عائلة بروتين تجميع النيوكليوسوم (NAP) تكوين هياكل تشبه النيوكليوسوم في المختبر ويشاركون في نقل الهستونات بين السيتوبلازم والنواة15. تعتبر كل من بروتينات عائلة النيوكليوبلازمين وبروتينات عائلة NAP مرافقين هيستون وظيفيين ولكنهما لا يشتركان في أي ميزات هيكلية. بشكل أساسي ، لا توجد ميزة هيكلية واحدة تسمح بتصنيف البروتين على أنه مرافقة هيستون16. يعمل استخدام المقايسات الوظيفية والفيزيائية الحيوية جنبا إلى جنب مع الدراسات الهيكلية بشكل أفضل في توصيف مرافقي الهستون.
يصف هذا العمل الطرق البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية لتوصيف البروتين على أنه مرافقة هيستون تساعد على تجميع النيوكليوسوم. أولا ، تم إجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتحليل حالة قلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار منسدل لتحديد القوى الدافعة والطبيعة التنافسية لتفاعلات هيستون المرافقة والهيستون. ومع ذلك ، لا يمكن حساب المعلمات الهيدروديناميكية لهذه التفاعلات بدقة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية بسبب شكل البروتين ومعقداته التي تؤثر على هجرتها عبر العمود. لذلك ، تم استخدام الطرد المركزي التحليلي الفائق ، والذي يوفر خصائص جزيئية كبيرة في المحلول تشمل الوزن الجزيئي الدقيق ، والقياس المتكافئ للتفاعل ، وشكل الجزيئات البيولوجية. استخدمت الدراسات السابقة على نطاق واسع مقايسة مرافقة هيستون في المختبر لتوصيف مرافقي هيستون وظيفيا مثل yScS116 17 و DmACF18 و ScRTT106p19 و HsNPM120. كما تم استخدام مقايسة مرافقة هيستون لتوصيف البروتينات وظيفيا على أنها مرافقة هيستون.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>814326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>193983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25M FPLC</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Instrument for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An-60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361964</td>
			<td>Rotor for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.15444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (7 kDa cut-off)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>68700</td>
			<td>For dialysing protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ATX224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide (EtBr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12009077</td>
			<td>For imaging gels after staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704405</td>
			<td>Instrument for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683779</td>
			<td>For pipetting of micro-volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000</td>
			<td>Instrument for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>800172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano drop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For measurement of protein and DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>Resin beads for pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima AUC analytical ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B86437</td>
			<td>Instrument for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MT30130863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SD0061</td>
			<td>Plasmid for supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated high-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDFIT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDNTERP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPrep Spin Columns</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SC1000</td>
			<td>For pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.10732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topoisomerase I</td>
			<td>Inspiralis</td>
			<td>WGT102</td>
			<td>Enzyme used in plasmid supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>N&#252;ve</td>
			<td>NB 5</td>
			<td>For heat treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays

ترتبط بروتينات الهستون بالحمض النووي (DNA) لتكوين الكروماتين حقيقي النواة. الوحدة الأساسية للكروماتين هي نيوكليوسوم ، يتكون من ثماني هيستون يتكون من نسختين من الهستونات الأساسية H2A و H2B و H3 و H4 ، ملفوفة حول الحمض النووي. يتكون الأوكتامير من نسختين من ثنائي H2A / H2B ونسخة واحدة من رباعي H3 / H4. الهستونات الأساسية عالية الشحنة عرضة لتفاعلات غير محددة مع العديد من البروتينات في السيتوبلازم الخلوي والنواة. تشكل مرافقات هيستون فئة متنوعة من البروتينات التي تنقل الهستونات من السيتوبلازم إلى النواة وتساعد على ترسبها على الحمض النووي ، وبالتالي تساعد في عملية تجميع النيوكليوسوم. بعض مرافقي هيستون محددون إما ل H2A / H2B أو H3 / H4 ، وبعضها يعمل كمرافقين لكليهما. يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام التقنيات المختبرية في المختبر مثل المقايسات المنسدلة ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية ، والطرد المركزي التحليلي الفائق ، ومقايسة مرافقة هيستون جنبا إلى جنب لتأكيد ما إذا كان بروتين معين يعمل كمرافق هيستون.

تعرض مجال نيوكليوبلازمين N-terminal المؤتلف للبروتين FKBP53 من Arabidopsis thaliana ل SEC التحليلي. تم رسم حجم ذروة الشطف مقابل المنحنى القياسي لتحديد حالته قليلة القسيمة. كشفت نتائج SEC التحليلية أن المجال موجود كمحلول خماسي ، بكتلة جزيئية تقريبية تبلغ 58 كيلو دالتون (الشكل 1 أ ، ب</stro...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق التي تتضمن كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لدراسة قلة القلة واستقرارية هيستون ، ومقايسة السحب لأسفل لكشف تفاعلات هيستون تشابيرون هيستون ، والجامعة الأمريكية بالقاهرة لتحليل القياس المتكافئ لمجمعات البروتين ، ومقايسة مرافقة هيستون لتوصيف وظيفيا لمرافقة هيستون مفترضة في المختبر.

في المختبر توصيف مرافقي هيستون باستخدام المقايسات التحليلية والمنسدلة والمرافقة

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

يصف بروتوكولنا كيف يمكن استخدام تقنيات مثل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي للمقايسات المنسدلة ، والطرد المركزي التحليلي الفائق ، ومقايسة مرافقة هيستون لتأكيد ما إذا كان البروتين هو مرافقة هيستون. يمكن تطبيق التقنيات التي يتم تناولها هنا ، عند استخدام الترادف ، مباشرة لتوصيف المرافق المفترض. يمكن أن يتماشى مع تقنية البيولوجيا الهيكلية.التقنيات قابلة للتطبيق في مجال أبحاث الكروماتين. ومع ذلك ، يمكن تطبيق الطرق الفردية على أي بروتين آخر مهم ، حسب الحاجة. ومما يدل على الإجراء أن السيد سوراجيت غاندي ، طالب دكتوراه من مختبري ، من أجل الفحص المعقد للسحب ؛ السيدة.أرشانا سامال ، طالبة دكتوراه ، جنبا إلى جنب مع السيد Ruchir C.Bobde لتجربة الطرد المركزي الفائق التحليلية ؛ السيد Somanath Baral ، طالب دكتوراه ؛ جنبا إلى جنب مع السيد Ketul Sahara لفحص البلازميد فائق اللف أولا ، امزج مرافقي هيستون خمسة ميكرومولار مع 20 ميكرومولار H2A / H2B dimers في 300 ميكرولتر من عازلة التوازن. جهاز طرد مركزي لمركب هيستون مرافقة H2A / H2B لإزالة أي راسب.قم بتحميل العينة على عمود الدوران المتوازن مسبقا مع مخزن التوازن المؤقت. اغسل العمود ب 100 حجم عمود أو أربعة ملليلتر من محلول الغسيل لإزالة ديمر H2A / H2B الزائد. بعد ذلك ، امزج مركب هيستون مرافقة H2A / H2B مع 20 إلى 60 ميكرومولار H3 / H4 tetramer.أعد غسل العمود ب 100 حجم عمود أو أربعة ملليلتر من مخزن الغسيل المؤقت لإزالة أي رباعي H3 / H4 غير منضم ، ثم قم بتخفيف العينات باستخدام محلول الشطف. إخضاع العينات المستخلصة إلى 18٪ SDS-PAGE. ثم ، وصمة عار مع Coomassie الأزرق اللامع R250 وتصور الجل.تنقية H2A / H2B dimer ، H3 / H4 tetramer في مرافقة هيستون بشكل فردي مع عازلة غسيل الكلى باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي. احفظ المخزن المؤقت من المدى لإعداد المزيد من التخفيفات لاحقا واستخدامها كمرجع في خلية AUC. بالنسبة لعينات AUC ، امزج المرافقين المنقى مع dimer أو tetramer في أنابيب منفصلة إلى حجم نهائي يبلغ 450 ميكرولتر باستخدام مخزن غسيل الكلى المحفوظ للوصول إلى OD280 من 0.3 إلى 0.6.قم بتجميع الخلية بقطعة مركزية مزدوجة القطاع ونوافذ كوارتز مزودة بجهاز طرد مركزي تحليلي فائق مع كاشف امتصاص. املأ 400 ميكرولتر من محلول العينة و 420 ميكرولترا من محلول غسيل الكلى في القطاعين المرجعي والعينة في الخلية ، على التوالي. قم بوزن الخلايا وموازنتها بدقة وتحميلها في دوار من التيتانيوم رباعي الثقوب.قم بمحاذاة الخلايا باستخدام العلامات الموجودة أسفل الخلايا والدوار. قم بتحميل الدوار في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء ، وابدأ التشغيل ، مما يسمح بتطور الفراغ واستقرار درجة الحرارة. لتحليل البيانات ، احسب الكثافة واللزوجة للمكونات العازلة للبروتينات والحجم المحدد الجزئي بناء على تكوين الأحماض الأمينية للبروتين باستخدام برنامج SEDNTERP.قم بتحميل البيانات من جهاز AUC إلى برنامج SEDFIT. حدد الغضروف المفصلي والخط الأحمر وأسفل الخلية والخط الأزرق وحدود تحليل البيانات الخطوط الخضراء. اختر توزيع CS المستمر كنموذج.في قسم المعلمات ، قم بتعيين الدقة القصوى حتى 100. بعد ذلك ، قم بتعيين معامل الترسيب كحد أدنى إلى الصفر والحد الأقصى إلى 10 إلى 15. اضبط نسبة الاحتكاك على 1.2 في البداية واختر التعويم لاشتقاق النسبة من البيانات.اضبط نسبة F على 0.68 لتسوية سيجما واحدة. قم بتعيين الحجم المحدد الجزئي وكثافة المخزن المؤقت واللزوجة كما تم الحصول عليها من SEDNTURP. اضغط على Run للسماح للبرنامج بحل معادلة lam.اضغط على Fit للتحسين. اختر إظهار Peak Mw في CS في وظيفة العرض لشريط الأدوات الرئيسي لتقدير الكتل الجزيئية. امزج رباعي H3 / H4 ثنائي الميكرومولار وأربعة ميكرومولار H2A / H2B dimer مع تركيزات متزايدة من مرافقة هيستون ، تتراوح من واحد إلى ستة ميكرومولار ، في مخزن مؤقت للتجميع إلى حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولتر.احتضان الخليط عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. في نفس الوقت ، قم بمعالجة 500 نانوجرام من بلازميد PUC-19 فائق الالتفاف سلبيا مع ميكروغرام واحد من إنزيم topoisomerase I في المخزن المؤقت للتجميع في حجم نهائي عند 50 ميكرولتر. بعد ذلك ، ادمج المحلول المخلوط مسبقا الذي يحتوي على tetramer و dimer و histone chaperone مع الحمض النووي للبلازما المريح.أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2X stop واحتضان لإنهاء تفاعل التجميع عن طريق إزالة البروتين من الحمض النووي البلازميد. أضف حجما متساويا من الفينول المشبع بالتريس في الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل واخلط محتويات خليط التفاعل جيدا. ثم ، الطرد المركزي العينة.اجمع بلطف المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد مع ماصة دقيقة وخلط حجم متساو من الكلوروفورم. دوامة الخليط. بعد ذلك ، اجمع المرحلة المائية العليا ، وأضف حجم 1/10 من أسيتات الصوديوم ثلاثية المولي من الرقم الهيدروجيني 5.5 ، و 2.5 حجم من الإيثانول المثلج.امزج المحلول جيدا عن طريق قلب الأنبوب ثلاث إلى أربع مرات. جهاز طرد مركزي للعينة عند 16،200 جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية برفق. أبق الأنابيب مفتوحة في درجة حرارة الغرفة حتى تتبخر كميات ضئيلة من الإيثانول ، تاركة الحمض النووي البلازميد المترسب في الأنبوب.كشفت نتائج SEC التحليلية أن مجال النيوكليوبلازمين الطرفي N المؤتلف لبروتين Arabidopsis thaliana FKBP53 هو خماسي من 65 كيلو دالتون في المحلول. أظهرت عينة النيوكليوبلازمين الخاضعة للمعالجة الحرارية أن المجال مستقر للغاية للحرارة. أظهر مجال نيوكليوبلازمين استقرار الملح حتى اثنين من أضراس كلوريد الصوديوم واستقرار اليوريا حتى أربعة أضراس.كشف اختبار السحب لأسفل أن تفاعل مجال النيوكليوبلازمين مع H2A / H2B dimer كان مستقرا حتى 0.4 مولار كلوريد الصوديوم ، في حين أن الارتباط مع H3 / H4 كان مستقرا حتى 0.7 أضراس. يربط المرافق H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer في وقت واحد ، بغض النظر عن الترتيب الذي يتم إضافتهما به إلى المرافق ، مما يشير إلى مواقع تفاعل منفصلة ل oligomers. تكشف الكتل الجزيئية المقدرة من خلال AUC-SV عن قياس متكافئ 1: 1 لمجال النيوكليوبلازمين مع أوليغومرات هيستون.في مقايسة البلازميد فائقة اللف ، زاد مرافقو هيستون النبات المؤتلف AtNRP1 و AtNRP2 من كمية البلازميد فائق الالتفاف ، مما يشير إلى أنه يمكن أن يودع الهستونات على الحمض النووي لتكوين النيوكليوسومات ، مما يتسبب في التفاف الحمض النووي الفائق. يحتاج فحص البلازميد فائق اللف إلى عناية خاصة وتحسين ممكن لتوصيف الحمض النووي للهيستون وتوصيف المرافق. يمكن استخدام القياس عن بعد للتوصيف الأيزوميري كمتابعة لتجارب استبعاد الحجم التحليلية لتأكيد استقرار الربط.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

تحديد الأنواع والكميات في مخاليط عن طريق MRM الطيف الكتلي من الببتيدات التطبيقية للمصادقة اللحوم

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

الكالوري الضوئي التفاضلية - منهج في تقييم الثبات الحراري والتشكل من البروتين مستضد

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

توصيف الهيكلية من السكريات جدار الخلية المنان في النباتات باستخدام خطي

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

وصف جليكوبروتينس مع حظيرة الغلوبولين المناعي علم البلورات بالأشعة السينية والتقنيات الفيزيائية الحيوية

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

في كل مكان في المختبر واختبارات الديوبيكيتيمنت النيوكليوسوم

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

توصيف وظيفي لحلقه من نوع E3 اوبيكويتين الاربطه في المختبر وفي بلانتa

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

بروتوكول الدوس خطوة بخطوة لزيادة الإنتاجية في مقالات GPCR المستندة إلى المعاوقة الخالية من التسميات

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

توصيف هياكل أميلويد في الشيخوخة C. Elegans باستخدام التصوير مدى الحياة فلورسينس

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...