Name: in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

Les subventions extra-muros accordées à Dileep Vasudevan par le Science and Engineering Research Board, gouvernement indien [CRG/2018/000695/PS] et le Département de la biotechnologie, ministère de la Science et de la Technologie, gouvernement de l’Inde [BT/INF/22/SP33046/2019], ainsi que le soutien intra-muros de l’Institut des sciences de la vie, Bhubaneswar, sont grandement appréciés. Nous remercions Mme Sudeshna Sen et Mme Annapurna Sahoo pour leur aide dans la préparation des histones. Les discussions avec nos collègues, le Dr Chinmayee Mohapatra, M. Manas Kumar Jagdev et le Dr Shaikh Nausad Hossain, sont également reconnues.

1. Chromatographie analytique d’exclusion de taille pour élucider le statut oligomère et la stabilité des chaperons d’histones
<ol><li>Analyse du statut oligomérique des chaperons d’histones<ol><li>Équilibrer une colonne de chromatographie analytique d’exclusion de taille (SEC) de 24 mL avec 1,2 volume de colonne (CV), c.-à-d. 28,8 mL de tampon SEC dégazé [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM de NaCl et 1 mM de β-mercaptoéthanol (β-ME)] à 4 °C (voir le tableau des matériaux<...

<ol>
	<li>H&#252;bner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+and+transcriptional+regulation.">Chromatin organization and transcriptional regulation.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).</li><li>Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nucleosome+dynamics+and+their+links+to+gene+expression+and+DNA+replication.">Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).</li><li>Kim, U. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stoichiometry+of+histone+dimer+sets+is+necessary+for+high+fidelity+of+mitotic+chromosome+transmission.">Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission.</a> Cell. 44 (1), 43-52 (1986).</li><li>Groth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Asf1+regulates+the+flow+of+S+phase+histones+during+replicational+stress.">Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress.</a> Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).</li><li>Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomes+are+assembled+by+an+acidic+protein+which+binds+histones+and+transfers+them+to+DNA.">Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA.</a> Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).</li><li>Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+shuffle:+histone+chaperones+in+an+energetic+dance.">The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).</li><li>Akey, C. 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M., Ausi&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).</li><li>Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+NAP-1+is+a+core+histone+chaperone+that+functions+in+ATP-facilitated+assembly+of+regularly+spaced+nucleosomal+arrays.">Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).</li><li>Els&#228;sser, S. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+chromatin+containing+recombinant+Drosophila+core+histones.">Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtt106p+is+a+histone+chaperone+involved+in+heterochromatin-mediated+silencing.">Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).</li><li>Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. 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H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAF-1-induced+oligomerization+of+histones+H3/H4+and+mutually+exclusive+interactions+with+Asf1+guide+H3/H4+transitions+among+histone+chaperones+and+DNA.">CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).</li><li>Bowman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+chaperones+Vps75+and+Nap1+form+ring-like,+tetrameric+structures+in+solution.">The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).</li><li>Newman, E. 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J., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+in+nucleosome+assembly+and+human+disease.">Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).</li><li>Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+histone+chaperone+yeast+Asf1+in+the+assembly+and+disassembly+of+histone+H3/H4-DNA+complexes.">The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).</li><li>Avvakumov, N., Nourani, A., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+Modulators+of+chromatin+marks.">Histone chaperones: Modulators of chromatin marks.</a> Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).</li><li>Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperoning+histones+during+DNA+replication+and+repair.">Chaperoning histones during DNA replication and repair.</a> Cell. 140 (2), 183-195 (2010).</li><li>Chu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+electrostatic+interactions+in+the+association+of+intrinsically+disordered+histone+chaperone+Chz1+and+histone+H2A.Z-H2B.">Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B.</a> PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).</li><li>Heidarsson, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+proteins+enable+histone+chaperoning+on+the+nucleosome.">Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

Ce travail démontre et valide un ensemble complet de protocoles pour la caractérisation biochimique et biophysique d’un chaperon putatif d’histones. Ici, des protéines de la famille NAP exprimées et purifiées par recombinaison, AtNRP1 et AtNRP2, et le domaine nucléoplasmine N-terminal d’AtFKBP53 ont été utilisés pour démontrer les protocoles. Le même ensemble d’expériences pourrait très bien être utilisé pour délimiter les attributs fonctionnels des chaperons d’histones non caractérisés aupara...

Les nucléosomes composés d’ADN et de protéines histones forment l’unité structurelle de la chromatine et régulent plusieurs événements cellulaires critiques. Les nucléosomes sont repositionnés et remodelés dynamiquement pour rendre l’ADN accessible à divers processus tels que la réplication, la transcription et la traduction 1,2. Les histones qui sont très basiques ont tendance à interagir avec les protéines acides dans le milieu cellulaire ou subissent une agrégation, conduisant ainsi à divers défauts cellulaires 3,4,5. Un groupe de protéines dédiées appelées chaperons d’histones aide au transport des histones du cytoplasme vers le noyau et prévient les événements aberrants d’agrégation histone-ADN 6,7. Fondamentalement, la plupart des chaperons d’histones stockent et transfèrent les histones sur l’ADN à une force ionique physiologique, facilitant ainsi la formation de nucléosomes 8,9. Certains chaperons d’histones ont une nette préférence pour les oligomères d’histones H2A/H2B ou H3/H410.
Les chaperons d’histones sont caractérisés en fonction de leur capacité à assembler des nucléosomes dépendants ou indépendants de la synthèse de l’ADN11. Par exemple, le facteur d’assemblage de la chromatine 1 (CAF-1) est dépendant tandis que le régulateur d’histones A (HIRA) est indépendant de la synthèse de l’ADN12,13. De même, la famille des nucléoplasmines des chaperons d’histones est impliquée dans la décondensation de la chromatine des spermatozoïdes et l’assemblage des nucléosomes14. Les membres de la famille des protéines d’assemblage des nucléosomes (NAP) facilitent la formation de structures de type nucléosome in vitro et sont impliqués dans la navette des histones entre le cytoplasme et le noyau15. Les nucléoplasmines et les protéines de la famille NAP sont toutes deux des chaperons fonctionnels des histones, mais ne partagent aucune caractéristique structurelle. Essentiellement, aucune caractéristique structurelle unique ne permet la classification d’une protéine comme chaperond’histones 16. L’utilisation d’essais fonctionnels et biophysiques ainsi que d’études structurelles fonctionne mieux pour caractériser les chaperons d’histones.
Ce travail décrit des méthodes biochimiques et biophysiques pour caractériser une protéine en tant que chaperon d’histones qui facilite l’assemblage des nucléosomes. Tout d’abord, une chromatographie analytique d’exclusion de taille a été réalisée pour analyser le statut oligomère et la stabilité des chaperons d’histones. Ensuite, un test de pull-down a été effectué pour déterminer les forces motrices et la nature compétitive des interactions hiperon-histone. Cependant, les paramètres hydrodynamiques de ces interactions n’ont pas pu être calculés avec précision à l’aide de la chromatographie analytique taille-exclusion en raison de la forme de la protéine et de ses complexes qui ont un impact sur leur migration à travers la colonne. Par conséquent, l’ultracentrifugation analytique a été utilisée, qui fournit des propriétés macromoléculaires en solution qui incluent un poids moléculaire précis, la stœchiométrie de l’interaction et la forme des molécules biologiques. Des études antérieures ont largement utilisé le test de chaperonnage in vitro des histones pour caractériser fonctionnellement les chaperons d’histones tels que yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Le test de chaperonnage des histones a également été utilisé pour caractériser fonctionnellement les protéines en tant que chaperons d’histones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>814326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>193983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25M FPLC</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Instrument for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An-60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361964</td>
			<td>Rotor for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.15444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (7 kDa cut-off)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>68700</td>
			<td>For dialysing protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ATX224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide (EtBr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12009077</td>
			<td>For imaging gels after staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704405</td>
			<td>Instrument for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683779</td>
			<td>For pipetting of micro-volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000</td>
			<td>Instrument for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>800172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano drop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For measurement of protein and DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>Resin beads for pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima AUC analytical ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B86437</td>
			<td>Instrument for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MT30130863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SD0061</td>
			<td>Plasmid for supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated high-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDFIT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDNTERP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPrep Spin Columns</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SC1000</td>
			<td>For pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.10732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topoisomerase I</td>
			<td>Inspiralis</td>
			<td>WGT102</td>
			<td>Enzyme used in plasmid supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>N&#252;ve</td>
			<td>NB 5</td>
			<td>For heat treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays

Les protéines d’histone s’associent à l’ADN pour former la chromatine eucaryote. L’unité de base de la chromatine est un nucléosome, constitué d’un octamère d’histones constitués de deux copies des histones centrales H2A, H2B, H3 et H4, enroulées par l’ADN. L’octamère est composé de deux copies d’un dimère H2A/H2B et d’une seule copie d’un tétramère H3/H4. Les histones du noyau hautement chargées sont sujettes à des interactions non spécifiques avec plusieurs protéines du cytoplasme cellulaire et du noyau. Les chaperons d’histones forment une classe diversifiée de protéines qui transportent les histones du cytoplasme dans le noyau et facilitent leur dépôt sur l’ADN, facilitant ainsi le processus d’assemblage des nucléosomes. Certains chaperons d’histones sont spécifiques pour H2A/H2B ou H3/H4, et certains fonctionnent comme chaperons pour les deux. Ce protocole décrit comment des techniques de laboratoire in vitro telles que les essais de pull-down, la chromatographie analytique d’exclusion de la taille, l’ultracentrifugation analytique et le test de chaperonnage des histones pourraient être utilisées en tandem pour confirmer si une protéine donnée est fonctionnelle en tant que chaperon d’histones.

Le domaine nucléoplasmine N-terminal recombinant de la protéine FKBP53 d’Arabidopsis thaliana a été soumis à une SEC analytique. Le volume du pic d’élution a été tracé par rapport à la courbe standard pour identifier son état oligomère. Les résultats analytiques de la SEC ont révélé que le domaine existe en tant que pentamer en solution, avec une masse moléculaire approximative de 58 kDa (Figure 1A,B). De plus, la stabilité thermique et chimiqu...

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In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Ce protocole décrit une batterie de méthodes qui comprend la chromatographie analytique taille-exclusion pour étudier l’oligomérisation et la stabilité des histones chaperones, le test pull-down pour démêler les interactions hiperon-histone, l’ASC pour analyser la stœchiométrie des complexes protéiques et le test de chaperonnage des histones pour caractériser fonctionnellement un chaperon histones putatif in vitro.

In vitro Caractérisation des chaperons de histones à l’aide d’essais analytiques, de rabattement et de chaperoning

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Notre protocole décrit comment des techniques telles que la chromatographie analytique d’exclusion de la taille, l’ultracentrifugation analytique et le test de chaperonnage des histones pourraient être utilisées pour confirmer si une protéine est un chaperon d’histones. Les techniques abordées ici, lors de l’utilisation du tandem, pourraient être appliquées directement pour caractériser un chaperon putatif. Il pourrait aller de pair avec la technique de biologie structurale.Les techniques sont applicables au domaine de la recherche sur la chromatine. Cependant, les méthodes individuelles pourraient être appliquées à toute autre protéine d’intérêt, au besoin. M. Surajit Gandhi, un étudiant au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure pour le test de descente compliqué;Archana Samal, doctorant, avec M. Ruchir C.Bobde pour l’expérience analytique d’ultracentrifugation;M. Somanath Baral, doctorant;avec M.Ketul Saharan pour le test de super-enroulement plasmidique Tout d’abord, mélanger des chaperons d’histones à cinq micromolaires avec des dimères H2A/H2B à 20 micromolaires dans 300 microlitres de tampon d’équilibre. Centrifuger le complexe H2A/H2B du chaperon d’histones pour éliminer tout précipité.Chargez l’échantillon sur la colonne de spin pré-équilibrée avec un tampon d’équilibre. Lavez la colonne avec 100 volumes de colonne ou quatre millilitres de tampon de lavage pour éliminer l’excès de dimère H2A/H2B. Ensuite, mélangez le chaperon d’histones H2A/H2B avec du tétramère H3/H4 de 20 à 60 micromolaires.Laver à nouveau la colonne avec 100 volumes de colonne ou quatre millilitres de tampon de lavage pour éliminer tout tétramère H3/H4 non lié, puis éluer les échantillons avec un tampon d’élution. Soumettre les échantillons élués à 18% SDS-PAGE. Ensuite, colorez avec Coomassie bleu brillant R250 et visualisez le gel.Purifier le dimère H2A/H2B, le tétramère H3/H4 dans le chaperon d’histones individuellement avec le tampon de dialyse en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille analytique. Conserver le tampon de l’essai pour préparer d’autres dilutions ultérieurement et l’utiliser comme référence dans la cellule ASC. Pour les échantillons de SSC, mélanger les chaperons purifiés avec du dimère ou du tétramère dans des tubes séparés jusqu’à un volume final de 450 microlitres en utilisant le tampon de dialyse enregistré pour atteindre un OD280 de 0,3 à 0,6.Assemblez la cellule avec une pièce maîtresse à double secteur et des fenêtres en quartz équipées d’une ultracentrifugeuse analytique avec détecteur d’absorbance. Remplissez 400 microlitres de la solution échantillon et 420 microlitres de tampon de dialyse dans les secteurs de référence et d’échantillon de la cellule, respectivement. Pesez et équilibrez avec précision les cellules et chargez-les dans un rotor en titane à quatre trous.Alignez les cellules à l’aide des marques situées au bas des cellules et du rotor. Chargez le rotor dans la centrifugeuse, fermez le couvercle et démarrez la course, ce qui permet au vide de se développer et à la température de se stabiliser. Pour l’analyse des données, calculer la densité et la viscosité des composants tampons des protéines et le volume spécifique partiel en fonction de la composition en acides aminés de la protéine à l’aide du programme SEDNTERP.Chargez les données de la machine AUC dans le programme SEDFIT. Définissez les lignes vertes du ménisque, de la ligne rouge, du bas de la cellule, de la ligne bleue et des limites de l’analyse des données. Choisissez Distribution CS continue comme modèle.Dans la section des paramètres, définissez la résolution maximale jusqu’à 100. Ensuite, fixez le coefficient de sédimentation minimum à zéro et maximum à 10 à 15. Définissez initialement le rapport de frottement sur 1,2 et choisissez de flotter pour dériver le rapport à partir des données.Réglez le rapport F à 0,68 pour une régularisation sigma. Définir le volume spécifique partiel, la densité tampon et la viscosité obtenus à partir de la SEDNTURP. Appuyez sur Exécuter pour permettre au logiciel de résoudre l’équation lam.Appuyez sur Ajuster pour affiner. Choisissez Afficher le pic Mw dans CS dans la fonction d’affichage de la barre d’outils principale pour estimer les masses moléculaires. Mélanger deux tétramères H3/H4 micromolaires et quatre dimères H2A/H2B micromolaires avec des concentrations croissantes de chaperon d’histones, allant de un à six micromolaires, dans un tampon d’assemblage à un volume final de 50 microlitres.Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Simultanément, prétraiter 500 nanogrammes du plasmide PUC-19 super-enroulé négativement avec un microgramme d’enzyme topoisomérase I dans le tampon d’assemblage dans un volume final à 50 microlitres. Ensuite, combinez la solution prémélangée contenant le tétramère, le dimère et le chaperon d’histones avec l’ADN plasmatique détendu.Ajouter 100 microlitres de tampon stop 2X et incuber pour mettre fin à la réaction d’assemblage en déprotéinisant l’ADN plasmidique. Ajouter un volume égal de phénol saturé en tris dans le tube contenant le mélange réactionnel et bien mélanger le contenu du mélange réactionnel. Ensuite, centrifuger l’échantillon.Prélever délicatement la phase aqueuse supérieure contenant l’ADN plasmidique à l’aide d’une micropipette et mélanger un volume égal de chloroforme. Vortex le mélange. Ensuite, recueillir la phase aqueuse supérieure, ajouter un volume 1/10 d’acétate de sodium à trois molaires de pH 5,5 et 2,5 volumes d’éthanol glacé.Bien mélanger la solution en retournant le tube trois à quatre fois. Centrifuger l’échantillon à 16, 200 G pendant 10 minutes et jeter délicatement le surnageant. Gardez les tubes ouverts à température ambiante jusqu’à ce que même des traces d’éthanol s’évaporent, laissant l’ADN plasmidique précipité dans le tube.Les résultats analytiques de la SEC ont révélé que le domaine nucléoplasmine N-terminal recombinant de la protéine Arabidopsis thaliana FKBP53 est un pentamer de 65 kilodaltons en solution. L’échantillon de nucléoplasmine soumis à un traitement thermique a montré que le domaine est très thermostable. Le domaine nucléoplasmine présentait une stabilité en sel jusqu’à deux molaires de chlorure de sodium et une stabilité à l’urée jusqu’à quatre molaires.Un essai de pull-down a révélé que l’interaction du domaine nucléoplasmine avec le dimère H2A/H2B était stable jusqu’à 0,4 molaire de chlorure de sodium, alors que l’association avec H3/H4 était stable jusqu’à 0,7 molaire. Le chaperon lie simultanément le dimère H2A/H2B et le tétramère H3/H4, quel que soit l’ordre dans lequel ils sont ajoutés au chaperon, indiquant des sites d’interaction distincts pour les oligomères. Les masses moléculaires estimées par ASC-SV révèlent une stœchiométrie 1:1 du domaine nucléoplasmine avec les oligomères d’histones.Dans le test de super-enroulement plasmidique, les chaperons d’histones recombinants AtNRP1 et AtNRP2 ont augmenté la quantité de plasmide super-enroulé, suggérant qu’il pourrait déposer des histones sur l’ADN pour former des nucléosomes, provoquant un super enroulement de l’ADN. Le dosage du super-enroulement plasmidique nécessite un soin particulier et une optimisation possible pour la caractérisation de l’ADN des histones et du chaperon. La télémétrie de caractérisation isomérique peut être utilisée comme suivi d’expériences analytiques d’exclusion de taille pour confirmer la stabilité de liaison.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Détermination des espèces et Quantification en mélanges utilisant la spectrométrie de masse MRM de Peptides appliquée à l&#39;authentification de la viande

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

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