Name: in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

Die außerordentlichen Zuschüsse an Dileep Vasudevan vom Science and Engineering Research Board, Government of India [CRG/2018/000695/PS] und dem Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Government of India [BT/INF/22/SP33046/2019], sowie die interne Unterstützung durch das Institute of Life Sciences, Bhubaneswar, werden sehr gewürdigt. Wir danken Frau Sudeshna Sen und Frau Annapurna Sahoo für ihre Hilfe bei der Histonvorbereitung. Die Gespräche mit unseren Kollegen Dr. Chinmayee Mohapatra, Manas Kumar Jagdev und Dr. Shaikh Nausad Hossain werden ebenfalls gewürdigt.

1. Analytische Größenausschlusschromatographie zur Aufklärung des oligomeren Status und der Stabilität von Histon-Chaperonen
<ol><li>Analyse des oligomeren Status von Histon-Chaperonen<ol><li>Eine analytische 24-ml-Säule zur Größenausschlusschromatographie (SEC) mit einem Volumen von 1,2 Säulen (CV), d. h. 28,8 ml entgastem SEC-Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl und 1 mM β-Mercaptoethanol (β-ME)] bei 4 °C (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Säulentyp, Pufferzusam...

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	<li>H&#252;bner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+and+transcriptional+regulation.">Chromatin organization and transcriptional regulation.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).</li><li>Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nucleosome+dynamics+and+their+links+to+gene+expression+and+DNA+replication.">Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).</li><li>Kim, U. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stoichiometry+of+histone+dimer+sets+is+necessary+for+high+fidelity+of+mitotic+chromosome+transmission.">Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission.</a> Cell. 44 (1), 43-52 (1986).</li><li>Groth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Asf1+regulates+the+flow+of+S+phase+histones+during+replicational+stress.">Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress.</a> Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).</li><li>Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. 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H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAF-1-induced+oligomerization+of+histones+H3/H4+and+mutually+exclusive+interactions+with+Asf1+guide+H3/H4+transitions+among+histone+chaperones+and+DNA.">CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).</li><li>Bowman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+chaperones+Vps75+and+Nap1+form+ring-like,+tetrameric+structures+in+solution.">The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).</li><li>Newman, E. 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J., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+in+nucleosome+assembly+and+human+disease.">Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).</li><li>Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperoning+histones+during+DNA+replication+and+repair.">Chaperoning histones during DNA replication and repair.</a> Cell. 140 (2), 183-195 (2010).</li><li>Chu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+electrostatic+interactions+in+the+association+of+intrinsically+disordered+histone+chaperone+Chz1+and+histone+H2A.Z-H2B.">Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B.</a> PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).</li><li>Heidarsson, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+proteins+enable+histone+chaperoning+on+the+nucleosome.">Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

Diese Arbeit demonstriert und validiert einen umfassenden Satz von Protokollen für die biochemische und biophysikalische Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons. Hier wurden rekombinant exprimierte und gereinigte Proteine der NAP-Familie, AtNRP1 und AtNRP2, und die N-terminale Nukleoplasmindomäne von AtFKBP53 verwendet, um die Protokolle zu demonstrieren. Die gleiche Reihe von Experimenten könnte sehr gut verwendet werden, um die funktionellen Eigenschaften von bisher nicht charakterisierten Histon-Chap...

Nukleosomen, die aus DNA und Histonproteinen bestehen, bilden die strukturelle Einheit des Chromatins und regulieren mehrere kritische zelluläre Ereignisse. Nukleosomen werden dynamisch neu positioniert und umgestaltet, um DNA für verschiedene Prozesse wie Replikation, Transkription und Translation zugänglich zu machen 1,2. Sehr basische Histone neigen entweder dazu, mit sauren Proteinen im zellulären Milieu zu interagieren oder eine Aggregation zu durchlaufen, was zu verschiedenen zellulären Defekten führt 3,4,5. Eine Gruppe von dedizierten Proteinen, die Histon-Chaperone genannt werden, unterstützen den Transport von Histonen aus dem Zytoplasma zum Zellkern und verhindern aberrante Histon-DNA-Aggregationsereignisse 6,7. Grundsätzlich speichern und übertragen die meisten Histon-Chaperone Histone mit physiologischer Ionenstärke auf DNA, wodurch die Bildung von Nukleosomen unterstütztwird 8,9. Einige Histon-Chaperone haben eine deutliche Vorliebe für die Histon-Oligomere H2A/H2B oder H3/H410.
Histon-Chaperone werden aufgrund ihrer Fähigkeit charakterisiert, Nukleosomen abhängig oder unabhängig von der DNA-Synthesezu bilden 11. Zum Beispiel ist der Chromatin-Assemblierungsfaktor-1 (CAF-1) abhängig, während der Histonregulator A (HIRA) unabhängig von der DNA-Synthese12,13 ist. In ähnlicher Weise ist die Nukleoplasmin-Familie der Histon-Chaperone an der Spermienchromatin-Dekondensation und der Nukleosomenmontage beteiligt14. Die Mitglieder der Nukleosomen-Assemblierungsprotein-Familie (NAP) erleichtern die Bildung nukleosomenähnlicher Strukturen in vitro und sind am Pendeln von Histonen zwischen Zytoplasma und Kern15 beteiligt. Nukleoplasmine und Proteine der NAP-Familie sind beide funktionelle Histon-Chaperone, haben aber keine strukturellen Merkmale. Im Wesentlichen erlaubt kein einzelnes strukturelles Merkmal die Klassifizierung eines Proteins als Histon-Chaperon16. Die Verwendung von funktionellen und biophysikalischen Assays zusammen mit Strukturstudien funktioniert am besten bei der Charakterisierung von Histon-Chaperonen.
Diese Arbeit beschreibt biochemische und biophysikalische Methoden zur Charakterisierung eines Proteins als Histon-Chaperon, das die Nukleosomenbildung unterstützt. Zunächst wurde eine analytische Größenausschlusschromatographie durchgeführt, um den oligomeren Status und die Stabilität von Histon-Chaperonen zu analysieren. Als nächstes wurde ein Pull-Down-Assay durchgeführt, um die treibenden Kräfte und den Wettbewerbscharakter von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen zu bestimmen. Die hydrodynamischen Parameter dieser Wechselwirkungen konnten jedoch nicht genau mit der analytischen Größenausschlusschromatographie berechnet werden, da die Form des Proteins und seine Komplexe ihre Migration durch die Säule beeinflussen. Daher wurde eine analytische Ultrazentrifugation verwendet, die in Lösung makromolekulare Eigenschaften liefert, die ein genaues Molekulargewicht, die Stöchiometrie der Wechselwirkung und die Form der biologischen Moleküle umfassen. Frühere Studien haben ausgiebig In-vitro-Histon-Chaperoning-Assays verwendet, um Histon-Chaperone wie yScS116 17, DmACF 18, ScRTT106p 19, HsNPM120 funktionell zu charakterisieren. Der Histon-Chaperoning-Assay wurde auch verwendet, um die Proteine funktionell als Histon-Chaperone zu charakterisieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>814326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>193983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25M FPLC</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Instrument for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An-60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361964</td>
			<td>Rotor for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.15444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (7 kDa cut-off)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>68700</td>
			<td>For dialysing protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ATX224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide (EtBr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12009077</td>
			<td>For imaging gels after staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704405</td>
			<td>Instrument for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683779</td>
			<td>For pipetting of micro-volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000</td>
			<td>Instrument for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>800172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano drop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For measurement of protein and DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>Resin beads for pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima AUC analytical ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B86437</td>
			<td>Instrument for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MT30130863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SD0061</td>
			<td>Plasmid for supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated high-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDFIT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDNTERP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPrep Spin Columns</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SC1000</td>
			<td>For pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.10732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topoisomerase I</td>
			<td>Inspiralis</td>
			<td>WGT102</td>
			<td>Enzyme used in plasmid supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>N&#252;ve</td>
			<td>NB 5</td>
			<td>For heat treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays

Histonproteine assoziieren mit DNA, um das eukaryotische Chromatin zu bilden. Die Grundeinheit von Chromatin ist ein Nukleosom, das aus einem Histon-Oktamer besteht, das aus zwei Kopien der Kernhistone H2A, H2B, H3 und H4 besteht, die von der DNA umwickelt sind. Das Oktamer besteht aus zwei Kopien eines H2A/H2B-Dimers und einer einzigen Kopie eines H3/H4-Tetramers. Die hochgeladenen Kernhistonen neigen zu unspezifischen Wechselwirkungen mit mehreren Proteinen im zellulären Zytoplasma und im Zellkern. Histon-Chaperone bilden eine vielfältige Klasse von Proteinen, die Histone aus dem Zytoplasma in den Zellkern transportieren und deren Ablagerung auf der DNA unterstützen, wodurch der Nukleosomenzusammenbauprozess unterstützt wird. Einige Histonchaperone sind spezifisch für H2A / H2B oder H3 / H4, und einige fungieren als Chaperone für beide. Dieses Protokoll beschreibt, wie In-vitro-Labortechniken wie Pull-Down-Assays, analytische Größenausschlusschromatographie, analytische Ultrazentrifugation und Histon-Chaperoning-Assay zusammen verwendet werden können, um zu bestätigen, ob ein bestimmtes Protein als Histon-Chaperon funktionsfähig ist.

Die rekombinante N-terminale Nukleoplasmin-Domäne des Proteins FKBP53 aus Arabidopsis thaliana wurde einer analytischen SEC unterzogen. Das Elutionspeakvolumen wurde gegen die Standardkurve aufgetragen, um seinen oligomeren Zustand zu identifizieren. Die analytischen SEC-Ergebnisse zeigten, dass die Domäne als Pentamer in Lösung mit einer ungefähren Molekülmasse von 58 kDa existiert (Abbildung 1A,B). Weiterhin wurde die Nukleoplasmindomäne in Verbindung mit an...

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In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, die eine analytische Größenausschlusschromatographie zur Untersuchung der Histon-Chaperon-Oligomerisierung und -stabilität, den Pull-Down-Assay zur Entschlüsselung von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen, die AUC zur Analyse der Stöchiometrie der Proteinkomplexe und den Histon-Chaperoning-Assay zur funktionellen Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons in vitro umfassen.

In vitro Charakterisierung von Histon-Chaperonen mittels analytischer, Pull-Down- und Chaperoning-Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Unser Protokoll beschreibt, wie Techniken wie Pull-Down-Assays analytische Größenausschlusschromatographie, analytische Ultrazentrifugation und Histon-Chaperoning-Assay verwendet werden können, um zu bestätigen, ob ein Protein ein Histon-Chaperon ist. Die hier behandelten Techniken bei der Verwendung von Tandem könnten direkt angewendet werden, um ein mutmaßliches Chaperon zu charakterisieren. Seine könnte mit der strukturbiologischen Technik einhergehen.Die Techniken sind auf dem Gebiet der Chromatinforschung anwendbar. Die einzelnen Methoden könnten jedoch bei Bedarf auf jedes andere Protein von Interesse angewendet werden. Das Verfahren wird Herr Surajit Gandhi, ein Doktorand aus meinem Labor, für den komplizierten Pulldown-Assay demonstrieren.Archana Samal, eine Doktorandin, zusammen mit Herrn Ruchir C. Bobde für das analytische Ultrazentrifugationsexperiment;Herr Somanath Baral, ein Doktorand; zusammen mit Herrn Ketul Saharan für den Plasmid-Super-Coiling-Assay Mischen Sie zunächst fünf mikromolare Histonchaperone mit 20-Mikromolaren H2A / H2B-Dimeren in 300 Mikrolitern Gleichgewichtspuffer. Zentrifugieren Sie den Histon-Chaperon-H2A/H2B-Komplex, um Niederschläge zu entfernen.Laden Sie die Probe auf die Spinsäule, die mit dem Gleichgewichtspuffer voräquilibriert ist. Waschen Sie die Säule mit 100 Säulenvolumen oder vier Milliliter Waschpuffer, um überschüssiges H2A/H2B-Dimer zu entfernen. Als nächstes mischen Sie den Histon-Chaperon-H2A / H2B-Komplex mit 20 bis 60 Mikromolaren H3 / H4-Tetramer.Waschen Sie die Säule erneut mit 100 Säulenvolumina oder vier Milliliter Waschpuffer, um ungebundenes H3/H4-Tetramer zu entfernen, und eluieren Sie dann die Proben mit Elutionspuffer. Die eluierten Samples auf 18%SDS-PAGE setzen. Dann mit Coomassie Brilliant Blue R250 färben und das Gel visualisieren.Reinigen Sie das H2A/H2B-Dimer, H3/H4-Tetramer im Histon-Chaperon einzeln mit dem Dialysepuffer mittels analytischer Größenausschlusschromatographie. Speichern Sie den Puffer aus dem Durchlauf, um später weitere Verdünnungen vorzubereiten und als Referenz in der AUC-Zelle zu verwenden. Für AUC-Proben mischen Sie die gereinigten Chaperone mit Dimer oder Tetramer in separaten Röhrchen unter Verwendung des gespeicherten Dialysepuffers auf ein Endvolumen von 450 Mikrolitern, um einen OD280 von 0,3 bis 0,6 zu erreichen.Bauen Sie die Zelle mit einem Doppelsektor-Mittelstück und Quarzfenstern zusammen, die mit einer analytischen Ultrazentrifuge mit einem Absorptionsdetektor versehen sind. Füllen Sie 400 Mikroliter der Probenlösung und 420 Mikroliter Dialysepuffer in die Referenz- bzw. Probensektoren der Zelle. Wiegen und balancieren Sie die Zellen genau aus und laden Sie sie in einen Vierloch-Titanrotor.Richten Sie die Zellen anhand der Markierungen am unteren Rand der Zellen und am Rotor aus. Laden Sie den Rotor in die Zentrifuge, schließen Sie den Deckel und starten Sie den Lauf, wodurch sich ein Vakuum entwickeln und die Temperatur stabilisiert werden kann. Für die Datenanalyse berechnen Sie die Dichte und Viskosität für die Proteinpufferkomponenten und das partielle spezifische Volumen basierend auf der Aminosäurezusammensetzung des Proteins mit dem Programm SEDNTERP.Laden Sie die Daten von der AUC-Maschine in das Programm SEDFIT. Definieren Sie den Meniskus, die rote Linie, den Zellboden, die blaue Linie und die Datenanalysegrenzen grüne Linien. Wählen Sie Continuous CS distribution als Modell aus.Stellen Sie im Abschnitt Parameter die maximale Auflösung auf 100 ein. Als nächstes stellen Sie den Sedimentationskoeffizienten minimal auf Null und maximal auf 10 bis 15 ein. Stellen Sie das Reibungsverhältnis zunächst auf 1,2 ein und entscheiden Sie sich für floating, um das Verhältnis aus den Daten abzuleiten.Stellen Sie das F-Verhältnis für die Ein-Sigma-Regularisierung auf 0,68 ein. Stellen Sie partielles spezifisches Volumen, Pufferdichte und Viskosität ein, wie vom SEDNTURP erhalten. Drücken Sie Ausführen, damit die Software die Lam-Gleichung lösen kann.Drücken Sie zum Verfeinern auf Anpassen. Wählen Sie in der Anzeigefunktion der Hauptsymbolleiste die Option Peak Mw in CS anzeigen, um die Molekülmassen zu schätzen. Mischen Sie zweimikromolares H3/H4-Tetramer und viermikromolares H2A/H2B-Dimer mit steigenden Konzentrationen von Histon-Chaperon, die von einem bis sechs Mikromolaren reichen, in einem Montagepuffer auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern.Die Mischung bei vier Grad Celsius 30 Minuten inkubieren. Gleichzeitig werden 500 Nanogramm des negativ überwickelten PUC-19-Plasmids mit einem Mikrogramm Topoisomerase-I-Enzym im Montagepuffer in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern vorbehandelt. Als nächstes kombinieren Sie die vorgemischte Lösung, die Tetramer, Dimer und Histon-Chaperon enthält, mit der entspannten Plasma-DNA.Fügen Sie 100 Mikroliter 2X-Stop-Puffer hinzu und inkubieren, um die Montagereaktion durch Deproteinisierung der Plasmid-DNA zu beenden. Geben Sie eine gleiche Menge Tris-gesättigtes Phenol in das Röhrchen, das das Reaktionsgemisch enthält, und mischen Sie den Inhalt des Reaktionsgemisches gut. Dann zentrifugieren Sie die Probe.Sammeln Sie vorsichtig die obere wässrige Phase, die die Plasmid-DNA enthält, mit einer Mikropipette und mischen Sie eine gleiche Menge Chloroform. Wirbeln Sie die Mischung. Als nächstes sammeln Sie die obere wässrige Phase, fügen Sie ein 1/10-Volumen dreimoliges Natriumacetat mit pH 5,5 und 2,5 Volumen eiskaltes Ethanol hinzu.Mischen Sie die Lösung gut, indem Sie das Röhrchen drei- bis viermal umdrehen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16, 200 G für 10 Minuten und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig. Halten Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur offen, bis auch nur Spuren von Ethanol verdampft sind und die gefällte Plasmid-DNA in der Röhre verbleibt.Die analytischen SEC-Ergebnisse zeigten, dass die rekombinante N-terminale Nukleoplasmin-Domäne des Arabidopsis thaliana-Proteins FKBP53 ein Pentamer von 65 Kilodalton in Lösung ist. Die Nukleoplasminprobe, die einer Wärmebehandlung unterzogen wurde, zeigte, dass die Domäne sehr thermostabil ist. Die Nukleoplasmindomäne zeigte eine Salzstabilität bis zu zwei Molaren Natriumchlorid und eine Harnstoffstabilität bis zu vier Molaren.Ein Pull-Down-Assay zeigte, dass die Wechselwirkung der Nukleoplasmindomäne mit H2A/H2B-Dimer bis zu 0,4-molaren Natriumchlorid stabil war, während die Assoziation mit H3/H4 bis zu 0,7 Molaren stabil war. Das Chaperon bindet H2A/H2B-Dimer und H3/H4-Tetramer gleichzeitig, unabhängig von der Reihenfolge, in der sie dem Chaperon zugesetzt werden, was auf separate Interaktionsstellen für die Oligomere hinweist. Die geschätzten Molekülmassen durch AUC-SV zeigen eine 1:1-Stöchiometrie der Nukleoplasmindomäne mit den Histon-Oligomeren.Im Plasmid-Super-Coiling-Assay erhöhten rekombinante Pflanzen-Histon-Chaperone AtNRP1 und AtNRP2 die Menge an super-coiled Plasmid, was darauf hindeutet, dass es Histone auf der DNA ablagern könnte, um Nukleosomen zu bilden, was zu DNA-Super-Coiling führt. Der Plasmid-Super-Coiling-Assay erfordert besondere Sorgfalt und mögliche Optimierung für die Charakterisierung von Histon-DNA und Chaperon. Die Telemetrie zur isomeren Charakterisierung kann als Folgemaßnahme zu analytischen Größenausschlussexperimenten verwendet werden, um die Bindungsstabilität zu bestätigen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Artbestimmung und Quantifizierung in Mischungen Mit MRM-Massenspektrometrie von Peptiden, der Fleisch-Authentifizierung

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Forschung

Biochemie

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry - Eine Methode zur Beurteilung der thermischen Stabilität und Konformation von Protein-Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Funktionelle Charakterisierung von RING-Typ E3 Ubiquitin Ligases In Vitro und In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impeddance-Based GPCR Assays

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...