Name: in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

המענקים החוץ-אקדמיים לדיליפ וסודוואן ממועצת המחקר למדע והנדסה, ממשלת הודו [CRG/2018/000695/PS] והמחלקה לביוטכנולוגיה, משרד המדע והטכנולוגיה, ממשלת הודו [BT/INF/22/SP33046/2019], כמו גם התמיכה התוך-מורלית מהמכון למדעי החיים, בובנשוואר מוכרים מאוד. אנו מודים לגב' סודשנה סן וגב' אנאפורנה סאהו על עזרתן בהכנת היסטון. גם הדיונים עם עמיתינו ד"ר צ'ינמאיי מוהפטרה, מר מנאס קומאר ג'אגדב וד"ר שייח' נוסאד חוסיין זוכים להכרה.

1. כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל כדי להבהיר את המצב האוליגומרי והיציבות של מלווים היסטון
<ol><li>ניתוח הסטטוס האוליגומרי של מלווים היסטון<ol><li>שיווי משקל של כרומטוגרפיה של 24 מ"ל בגודל אנליטי (SEC) עם נפח עמודה של 1.2 טורים (CV), כלומר, 28.8 מ"ל של מאגר SEC נטול גזים [20 mM של Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl...

<ol>
	<li>H&#252;bner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+and+transcriptional+regulation.">Chromatin organization and transcriptional regulation.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).</li><li>Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nucleosome+dynamics+and+their+links+to+gene+expression+and+DNA+replication.">Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).</li><li>Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+histone+H4+depletion+on+the+cell+cycle+and+transcription+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).</li><li>Prado, F., Aguilera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+depletion+of+histone+H4+increases+homologous+recombination-mediated+genetic+instability.">Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).</li><li>Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stoichiometry+of+histone+dimer+sets+is+necessary+for+high+fidelity+of+mitotic+chromosome+transmission.">Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission.</a> Cell. 44 (1), 43-52 (1986).</li><li>Groth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Asf1+regulates+the+flow+of+S+phase+histones+during+replicational+stress.">Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress.</a> Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).</li><li>Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomes+are+assembled+by+an+acidic+protein+which+binds+histones+and+transfers+them+to+DNA.">Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA.</a> Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).</li><li>Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+shuffle:+histone+chaperones+in+an+energetic+dance.">The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).</li><li>Akey, C. W., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+and+nucleosome+assembly.">Histone chaperones and nucleosome assembly.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).</li><li>De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+An+escort+network+regulating+histone+traffic.">Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).</li><li>Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+30+years+from+isolation+to+elucidation+of+the+mechanisms+of+nucleosome+assembly+and+disassembly.">Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).</li><li>Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+largest+subunit+of+chromatin+assembly+factor+1:+importance+in+vitro+and+during+Xenopus+early+development.">Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development.</a> EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).</li><li>Ray-Gallet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIRA+is+critical+for+a+nucleosome+assembly+pathway+independent+of+DNA+synthesis.">HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).</li><li>Frehlick, L. J., Eir&#237;n-L&#243;pez, J. M., Ausi&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).</li><li>Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+NAP-1+is+a+core+histone+chaperone+that+functions+in+ATP-facilitated+assembly+of+regularly+spaced+nucleosomal+arrays.">Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).</li><li>Els&#228;sser, S. J., D'Arcy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+mechanism+for+histone+chaperones.">Towards a mechanism for histone chaperones.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).</li><li>Rodr&#237;guez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+competent+chromatin+assembled+with+exogenous+histones+in+a+yeast+whole+cell+extract.">Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract.</a> Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).</li><li>Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+chromatin+containing+recombinant+Drosophila+core+histones.">Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtt106p+is+a+histone+chaperone+involved+in+heterochromatin-mediated+silencing.">Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).</li><li>Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+chaperone+nucleophosmin+enhances+acetylation-dependent+chromatin+transcription.">Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).</li><li>Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtFKBP53:+A+chimeric+histone+chaperone+with+functional+nucleoplasmin+and+PPIase+domains.">AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains.</a> Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).</li><li>Scofield, B. T. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Electrophoresis. , (2012).</li><li>Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialysis+and+concentration+of+protein+solutions.">Dialysis and concentration of protein solutions.</a> Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).</li><li>Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+analysis+of+recombinant+importin-histone+complexes+using+analytical+ultracentrifugation.">Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation.</a> Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).</li><li>Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+current+methods+in+sedimentation+velocity+and+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2013).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-distribution+analysis+of+macromolecules+by+sedimentation+velocity+ultracentrifugation+and+Lamm+equation+modelling.">Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+Arabidopsis+thaliana+NAP1-related+protein+2+(AtNRP2)+and+comparison+with+its+homolog+AtNRP1.">Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1.</a> Molecules. 24 (12), 2258 (2019).</li><li>Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAF-1-induced+oligomerization+of+histones+H3/H4+and+mutually+exclusive+interactions+with+Asf1+guide+H3/H4+transitions+among+histone+chaperones+and+DNA.">CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).</li><li>Bowman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+chaperones+Vps75+and+Nap1+form+ring-like,+tetrameric+structures+in+solution.">The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).</li><li>Newman, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+multimeric+assemblies+of+nucleosome+assembly+protein+and+histones+revealed+by+small-angle+X-ray+scattering+and+electron+microscopy.">Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).</li><li>Edlich-Muth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pentameric+nucleoplasmin+fold+is+present+in+Drosophila+FKBP39+and+a+large+number+of+chromatin-related+proteins.">The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).</li><li>Franco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+ability+of+nucleoplasmin+to+assemble+and+chaperone+histone+octamers+for+DNA+deposition.">Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).</li><li>Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FK506-binding+protein,+Fpr4,+is+an+acidic+histone+chaperone.">The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone.</a> FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).</li><li>Graziano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hydrophobic+effect+in+the+salt-induced+dimerization+of+bovine+beta-lactoglobulin+at+pH+3.">Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3.</a> Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).</li><li>Burgess, R. J., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+in+nucleosome+assembly+and+human+disease.">Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).</li><li>Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+histone+chaperone+yeast+Asf1+in+the+assembly+and+disassembly+of+histone+H3/H4-DNA+complexes.">The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).</li><li>Avvakumov, N., Nourani, A., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+Modulators+of+chromatin+marks.">Histone chaperones: Modulators of chromatin marks.</a> Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).</li><li>Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperoning+histones+during+DNA+replication+and+repair.">Chaperoning histones during DNA replication and repair.</a> Cell. 140 (2), 183-195 (2010).</li><li>Chu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+electrostatic+interactions+in+the+association+of+intrinsically+disordered+histone+chaperone+Chz1+and+histone+H2A.Z-H2B.">Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B.</a> PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).</li><li>Heidarsson, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+proteins+enable+histone+chaperoning+on+the+nucleosome.">Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

עבודה זו מדגימה ומאמתת מערך מקיף של פרוטוקולים לאפיון ביוכימי וביופיזי של מלווה היסטון פוטטיבי. כאן, חלבוני משפחת NAP המבוטאים באופן רקומביננטי ומטוהרים, AtNRP1 ו- AtNRP2, ותחום הנוקלאופלסמין N-terminal של AtFKBP53 שימשו להדגמת הפרוטוקולים. אותה קבוצה של ניסויים יכולה בהחלט לשמש כדי להגדיר את התכונות הפו...

נוקלאוזומים המורכבים מחלבוני דנ"א והיסטון יוצרים את היחידה המבנית של הכרומטין ומווסתים מספר אירועים תאיים קריטיים. נוקלאוזומים ממוקמים מחדש באופן דינמי ומעוצבים מחדש כדי להנגיש את הדנ"א לתהליכים שונים כגון שכפול, שעתוק ותרגום 1,2. אבנים שהן בסיסיות מאוד נוטות לתקשר עם חלבונים חומציים בסביבה התאית או לעבור צבירה, ובכך מובילות לפגמים תאיים שונים 3,4,5. קבוצה של חלבונים ייעודיים הנקראים מלווים היסטון מסייעים בהעברת היסטונים מהציטופלסמה אל הגרעין ומונעיםאירועי צבירה של היסטון-DNA 6,7. ביסודו של דבר, רוב המלווים של היסטון מאחסנים ומעבירים היסטונים לדנ"א בעוצמה יונית פיזיולוגית, ובכך מסייעים להיווצרות נוקלאוזומים 8,9. לחלק מהמלווים של היסטון יש העדפה ברורה לאוליגומרים של היסטון H2A/H2B או H3/H410.
מלווים של היסטון מאופיינים על סמך יכולתם להרכיב נוקלאוזומים התלויים או בלתי תלויים בסינתזת DNA11. לדוגמה, גורם הרכבת הכרומטין-1 (CAF-1) תלוי בעוד מווסת היסטון A (HIRA) אינו תלוי בסינתזת DNA12,13. באופן דומה, משפחת הנוקלאופלסמין של מלווים היסטון מעורבת בפירוק כרומטין זרע ובהרכבת נוקלאוזום14. בני משפחת חלבון הרכבת הנוקלאוזומים (NAP) מאפשרים היווצרות מבנים דמויי נוקלאוזומים במבחנה ומעורבים בהסתרת היסטונים בין ציטופלסמה לגרעין15. נוקלאופלסמינים וחלבונים ממשפחת NAP הם שניהם מלווים פונקציונליים של היסטון, אך אינם חולקים תכונות מבניות כלשהן. למעשה, אין תכונה מבנית אחת המאפשרת סיווג של חלבון כמלווה היסטון16. השימוש במבחנים פונקציונליים וביופיזיים יחד עם מחקרים מבניים פועלים בצורה הטובה ביותר באפיון מלווים של היסטון.
עבודה זו מתארת שיטות ביוכימיות וביופיזיות לאפיון חלבון כמלווה היסטון המסייע להרכבת נוקלאוזומים. ראשית, כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל בוצעה כדי לנתח את המצב האוליגומרי והיציבות של מלווים היסטון. לאחר מכן, בוצעה בדיקה נשלפת כדי לקבוע את הכוחות המניעים ואת האופי התחרותי של אינטראקציות histone chaperone-histone. עם זאת, לא ניתן היה לחשב במדויק את הפרמטרים ההידרודינמיים של אינטראקציות אלה באמצעות כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל בגלל צורת החלבון והקומפלקסים שלו המשפיעים על נדידתם דרך העמודה. לכן, נעשה שימוש באולטרה-צנטריפוגציה אנליטית, המספקת תכונות מקרומולקולריות בתמיסה הכוללות משקל מולקולרי מדויק, סטויכיומטריה של אינטראקציה וצורת המולקולות הביולוגיות. מחקרים קודמים עשו שימוש נרחב במבחן מלווה היסטון במבחנה כדי לאפיין באופן פונקציונלי מלווים היסטון כגון yScS11617, DmACF 18, ScRTT106p19, HsNPM120. מבחן הליווי של היסטון שימש גם לאפיון פונקציונלי של החלבונים כמלווים היסטון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>814326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>193983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25M FPLC</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Instrument for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An-60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361964</td>
			<td>Rotor for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.15444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (7 kDa cut-off)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>68700</td>
			<td>For dialysing protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ATX224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide (EtBr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12009077</td>
			<td>For imaging gels after staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704405</td>
			<td>Instrument for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683779</td>
			<td>For pipetting of micro-volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000</td>
			<td>Instrument for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>800172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano drop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For measurement of protein and DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>Resin beads for pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima AUC analytical ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B86437</td>
			<td>Instrument for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MT30130863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SD0061</td>
			<td>Plasmid for supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated high-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDFIT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDNTERP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPrep Spin Columns</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SC1000</td>
			<td>For pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.10732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topoisomerase I</td>
			<td>Inspiralis</td>
			<td>WGT102</td>
			<td>Enzyme used in plasmid supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>N&#252;ve</td>
			<td>NB 5</td>
			<td>For heat treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays

חלבוני היסטון נקשרים לדנ"א ויוצרים את הכרומטין האאוקריוטי. היחידה הבסיסית של הכרומטין היא נוקלאוזום, המורכב מאוקטמר היסטון המורכב משני עותקים של ליבת ההיסטונים H2A, H2B, H3 ו-H4, העטופים על ידי הדנ"א. האוקטמר מורכב משני עותקים של דימר H2A/H2B ועותק יחיד של טטרמר H3/H4. היסטונים הליבה הטעונים מאוד נוטים לאינטראקציות לא ספציפיות עם מספר חלבונים בציטופלסמה התאית ובגרעין. מלווים של היסטון יוצרים קבוצה מגוונת של חלבונים שמעבירים היסטונים מהציטופלסמה אל תוך הגרעין ומסייעים לתצהיר שלהם על הדנ"א, ובכך מסייעים לתהליך הרכבת הנוקלאוזום. חלק ממלווים היסטון הם ספציפיים עבור H2A / H2B או H3 / H4, וחלקם מתפקדים כמלווים עבור שניהם. פרוטוקול זה מתאר כיצד טכניקות מעבדה במבחנה כגון מבחני משיכה כלפי מטה, כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית ובדיקת מלווה היסטון יכולות לשמש במקביל כדי לאשר אם חלבון נתון מתפקד כמלווה היסטון.

תחום הנוקלאופלסמין הרקומביננטי N-terminal של החלבון FKBP53 מאראבידופסיס תליאנה היה נתון ל- SEC אנליטי. נפח השיא של האלוציה הותווה כנגד העקומה הסטנדרטית כדי לזהות את מצבה האוליגומרי. תוצאות ה-SEC האנליטיות גילו שהתחום קיים כפנטמר בתמיסה, עם מסה מולקולרית משוערת של 58 kDa (איור 1A,B<stro...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

פרוטוקול זה מתאר סוללה של שיטות הכוללות כרומטוגרפיה אנליטית של אי-הכללת גודל כדי לחקור אוליגומריזציה ויציבות של מלווה היסטון, בדיקת משיכה למטה כדי לפענח אינטראקציות של מלווה היסטון-היסטון, AUC כדי לנתח את הסטויכיומטריה של קומפלקסי החלבונים, ומבחן מלווה היסטון כדי לאפיין באופן פונקציונלי מלווה היסטון במבחנה.

במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד ניתן להשתמש בטכניקות כמו כרומטוגרפיית אי-הכללה של גודל אנליטי של מבחנים, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית ובדיקת מלווה היסטון כדי לאשר אם חלבון הוא מלווה היסטון. הטכניקות המכוסות כאן, בעת שימוש בטנדם, יכולות להיות מיושמות ישירות כדי לאפיין מלווה פוטטיבי. שלו יכול ללכת יחד עם טכניקת הביולוגיה המבנית.הטכניקות ישימות לתחום חקר הכרומטין. עם זאת, ניתן ליישם את השיטות האינדיבידואליות על כל חלבון אחר בעל עניין, לפי הצורך. מי שידגים את ההליך יהיה מר סוראג'יט גנדי, דוקטורנט מהמעבדה שלי, על הבדיקה המסובכת של הנסיגה;גב'.ארכאנה סמאל, סטודנטית לדוקטורט, יחד עם מר רוצ'יר ק.בודה על ניסוי האולטרה-צנטריפוגה האנליטית;מר סומנאת בראל, סטודנט לדוקטורט;יחד עם מר קטול סהרה למבחן הסופר-סליל הפלסמיד ראשית, ערבבו מלווים היסטון של חמישה מיקרומולרים עם דימרים H2A/H2B של 20 מיקרומולרים ב-300 מיקרוליטרים של חיץ שיווי משקל. צנטריפוגה של קומפלקס H2A/H2B מלווה היסטון כדי להסיר כל זריז.טען את הדגימה על עמודת הספין שקודמה מראש בשיווי משקל עם מאגר שיווי משקל. שטפו את העמוד בנפחים של 100 עמודים או ארבעה מיליליטר של מאגר כביסה כדי להסיר עודפי H2A/H2B דימר. לאחר מכן, יש לערבב את קומפלקס H2A/H2B של מלווה היסטון עם טטרמר H3/H4 של 20 עד 60 מיקרומולר.שטפו מחדש את העמודה בנפחים של 100 עמודים או ארבעה מיליליטרים של מאגר שטיפה כדי להסיר כל טטרמר H3/H4 לא מאוגד, ולאחר מכן חמקו את הדגימות עם מאגר אלוטיון. הכפיפו את הדוגמאות המועלות ל-18% SDS-PAGE. לאחר מכן, כתם עם Coomassie כחול מבריק R250 ולדמיין את הג'ל.לטהר את הדימר H2A/H2B, טטרמר H3/H4 במלווה היסטון בנפרד עם מאגר הדיאליזה באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל אנליטי. שמור את המאגר מהריצה כדי להכין דילולים נוספים בהמשך ולהשתמש בו כהפניה בתא AUC. עבור דגימות AUC, ערבבו את המלווים המטוהרים עם דימר או טטרמר בצינורות נפרדים לנפח סופי של 450 מיקרוליטרים באמצעות מאגר הדיאליזה שנשמר כדי להגיע ל-OD280 של 0.3 עד 0.6.הרכיבו את התא עם מרכז דו-מגזרי וחלונות קוורץ המסופקים עם צנטריפוגה אולטרה אנליטית עם גלאי ספיגה. מלא 400 מיקרוליטרים של תמיסת הדגימה ו -420 מיקרוליטרים של מאגר דיאליזה לתוך מגזרי הייחוס והדגימה של התא, בהתאמה. שוקלים ומאזנים במדויק את התאים וטוענים אותם לרוטור טיטניום בעל ארבעה חורים.יישר את התאים באמצעות הסימנים בתחתית התאים והרוטור. טען את הרוטור בצנטריפוגה, סגור את המכסה והתחל את הריצה, המאפשרת לוואקום להתפתח ולטמפרטורה להתייצב. לצורך ניתוח נתונים, חשב את הצפיפות והצמיגות של רכיבי מאגר החלבונים ואת הנפח הספציפי החלקי בהתבסס על הרכב חומצות האמינו של החלבון באמצעות התוכנית SEDNTERP.טען את הנתונים ממכונת AUC לתוכנית SEDFIT. הגדר את המניסקוס, הקו האדום, תחתית התא, הקו הכחול וגבולות ניתוח הנתונים קווים ירוקים. בחר הפצת CS רציפה כמודל.בקטע הפרמטרים, הגדר רזולוציה מקסימלית עד 100. לאחר מכן, הגדר מקדם משקעים מינימלי לאפס ומקסימום ל 10 עד 15. הגדר את יחס החיכוך ל-1.2 בתחילה ובחר לצוף כדי לגזור את היחס מהנתונים.הגדר את יחס F ל- 0.68 עבור רגולציית סיגמא אחת. הגדר נפח ספציפי חלקי, צפיפות חיץ וצמיגות כפי שהתקבלו מה- SEDNTURP. לחץ על הפעל כדי לאפשר לתוכנה לפתור את משוואת lam.לחץ על Fit כדי לחדד. בחרו 'הצג שיא Mw ב-CS' בפונקציית התצוגה של סרגל הכלים הראשי כדי להעריך את המסות המולקולריות. ערבבו טטרמר H3/H4 עם שני מיקרומולרים ודימר H2A/H2B בעל ארבעה מיקרומולרים עם ריכוזים הולכים וגדלים של מלווה היסטון, החל ממיקרו-מולר אחד ועד שישה מיקרו-מולר, במאגר הרכבה ועד לנפח סופי של 50 מיקרוליטרים.לדגור את התערובת בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בו זמנית, יש לבצע pretreat 500 nanograms של פלסמיד PUC-19 בעל סליל שלילי עם מיקרוגרם אחד של אנזים טופואיזומראז I במאגר ההרכבה בנפח סופי של 50 מיקרוליטרים. לאחר מכן, שלבו את התמיסה המעורבת מראש המכילה טטרמר, דימר ומלווה היסטון עם הדנ"א הרגוע של הפלזמה.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מאגר עצירה 2X ודגירה כדי לסיים את תגובת ההרכבה על ידי דה-פרוטאינזציה של הדנ"א הפלסמיד. מוסיפים נפח שווה של פנול רווי טריס בצינור המכיל את תערובת התגובה ומערבבים היטב את תוכן תערובת התגובה. לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימה.אוספים בעדינות את הפאזה המימית העליונה המכילה את הדנ"א הפלסמיד עם מיקרופיפטה ומערבבים נפח שווה של כלורופורם. מערבבים את התערובת. לאחר מכן, לאסוף את השלב מימי העליון, להוסיף 1/10 נפח של שלושה טוחנת נתרן אצטט של pH 5.5, ו 2.5 כרכים של אתנול קר כקרח.מערבבים היטב את התמיסה על ידי היפוך הצינור שלוש עד ארבע פעמים. צנטריפוגה את הדגימה ב 16, 200 גרם במשך 10 דקות ולהשליך בעדינות את supernatant. השאירו את הצינורות פתוחים בטמפרטורת החדר עד שאפילו כמויות זעירות של אתנול יתאדו, וישאירו את הדנ"א הפלסמיד המשופע בצינור.תוצאות ה- SEC האנליטיות גילו כי תחום הנוקלאופלסמין הרקומביננטי N-terminal של החלבון Arabidopsis thaliana FKBP53 הוא פנטמר של 65 קילודלטון בתמיסה. דגימת הנוקלאופלסמין שהייתה נתונה לטיפול בחום הראתה כי התחום יציב מאוד מבחינה תרמית. תחום הנוקלאופלסמין הציג יציבות מלח עד שתי טוחנות של נתרן כלורי ויציבות אוריאה עד ארבע טוחנות.בדיקה נשלפת גילתה כי האינטראקציה של תחום הנוקלאופלסמין עם דימר H2A/H2B הייתה יציבה עד 0.4-טוחנת נתרן כלורי, בעוד שהקשר עם H3/H4 היה יציב עד 0.7 טוחנות. המלווה קושר דימר H2A/H2B וטטרמר H3/H4 בו-זמנית, ללא קשר לסדר שבו הם מתווספים למלווה, מה שמצביע על אתרי אינטראקציה נפרדים עבור האוליגומרים. המסות המולקולריות המשוערות דרך AUC-SV חושפות סטויכיומטריה ביחס של 1:1 בתחום הנוקלאופלסמין עם אוליגומרים היסטון.בבדיקת הסופר-סליל של פלסמיד, מלווים רקומביננטיים של היסטון צמחי AtNRP1 ו-AtNRP2 הגדילו את כמות הפלסמיד הסופר-סליל, מה שמרמז על כך שהוא יכול להפקיד היסטונים על הדנ"א כדי ליצור נוקלאוזומים, מה שגורם לסליל-על של הדנ"א. בדיקת סליל-על פלסמיד זקוקה לטיפול מיוחד ואופטימיזציה אפשרית לדנ"א היסטון ולאפיון מלווה. טלמטריה של אפיון איזומרי יכולה לשמש כהמשך לניסויים אנליטיים של אי-הכללת גודל כדי לאשר את יציבות הכריכה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

נחישות כימות המינים בשנת תערובות שימוש ספקטרומטריית מסה MRM של פפטידים יישומית כדי אימות בשר

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

אפיון פונקציונלי של מסוג הטבעת E3 ליגטיות בתוך מבחנה ובפלאנטה

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...