Name: in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

दिलीप वासुदेवन को विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड, भारत सरकार [सीआरजी/2018/000695/पीएस] और जैव प्रौद्योगिकी विभाग, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, भारत सरकार [बीटी/आईएनएफ/22/एसपी33046/2019] से अतिरिक्त अनुदान के साथ-साथ इंस्टीट्यूट ऑफ लाइफ साइंसेज, भुवनेश्वर से इंट्राम्यूरल समर्थन को बहुत स्वीकार किया जाता है। हम सुश्री सुदेशना सेन और सुश्री अन्नपूर्णा साहू को हिस्टोन तैयारी में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। हमारे सहयोगियों डॉ चिन्मयी महापात्र, श्री मानस कुमार जगदेव और डॉ शेख नौसाद हुसैन के साथ चर्चा को भी स्वीकार किया जाता है।

1. हिस्टोन चैपरोन की ऑलिगोमेरिक स्थिति और स्थिरता को स्पष्ट करने के लिए विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी
<ol><li>हिस्टोन चैपरोन की ओलिगोमेरिक स्थिति का विश्लेषण<ol><li>24 एमएल विश्लेषणात्मक...

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	<li>H&#252;bner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+and+transcriptional+regulation.">Chromatin organization and transcriptional regulation.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).</li><li>Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nucleosome+dynamics+and+their+links+to+gene+expression+and+DNA+replication.">Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).</li><li>Kim, U. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+chromatin+containing+recombinant+Drosophila+core+histones.">Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtt106p+is+a+histone+chaperone+involved+in+heterochromatin-mediated+silencing.">Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).</li><li>Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+multimeric+assemblies+of+nucleosome+assembly+protein+and+histones+revealed+by+small-angle+X-ray+scattering+and+electron+microscopy.">Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).</li><li>Edlich-Muth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pentameric+nucleoplasmin+fold+is+present+in+Drosophila+FKBP39+and+a+large+number+of+chromatin-related+proteins.">The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).</li><li>Franco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+ability+of+nucleoplasmin+to+assemble+and+chaperone+histone+octamers+for+DNA+deposition.">Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).</li><li>Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FK506-binding+protein,+Fpr4,+is+an+acidic+histone+chaperone.">The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone.</a> FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).</li><li>Graziano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hydrophobic+effect+in+the+salt-induced+dimerization+of+bovine+beta-lactoglobulin+at+pH+3.">Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3.</a> Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).</li><li>Burgess, R. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+proteins+enable+histone+chaperoning+on+the+nucleosome.">Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

यह काम एक कथित हिस्टोन चैपरोन के जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल के एक व्यापक सेट को प्रदर्शित और मान्य करता है। इसमें, प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए पुनः संयोजक रूप से व?...

डीएनए और हिस्टोन प्रोटीन से बने न्यूक्लियोसोम क्रोमैटिन की संरचनात्मक इकाई बनाते हैं और कई महत्वपूर्ण सेलुलर घटनाओं को नियंत्रित करते हैं। न्यूक्लियोसोम को गतिशील रूप से पुनर्स्थापित किया जाता है और डीएनए को प्रतिकृति, प्रतिलेखन और अनुवाद 1,2 जैसी विभिन्न प्रक्रियाओं के लिए सुलभ बनाने के लिए फिर से तैयार किया जाता है। हिस्टोन जो अत्यधिक बुनियादी हैं, वे या तो सेलुलर परिवेश में अम्लीय प्रोटीन के साथ बातचीत करते हैं या एकत्रीकरण से गुजरते हैं, इस प्रकार विभिन्न सेलुलर दोष 3,4,5 होते हैं। हिस्टोन चैपरोन नामक समर्पित प्रोटीन का एक समूह साइटोप्लाज्म से नाभिक तक हिस्टोन के परिवहन में सहायता करता है और असामान्य हिस्टोन-डीएनए एकत्रीकरण घटनाओं को रोकता है। मौलिक रूप से, अधिकांश हिस्टोन चैपरोन शारीरिक आयनिक शक्ति पर डीएनए पर हिस्टोन को स्टोर और स्थानांतरित करते हैं, जिससे न्यूक्लियोसोम 8,9 के गठन में सहायता मिलती है। कुछ हिस्टोन चैपरोन में हिस्टोन ऑलिगोमर्स एच 2 ए / एच 2 बी या एच 3 / एच 410 के लिए एक निश्चित प्राथमिकता है।
हिस्टोन चैपरोन को डीएनए संश्लेषण11 पर निर्भर या स्वतंत्र न्यूक्लियोसोम को इकट्ठा करने की उनकी क्षमता के आधार पर विशेषता है। उदाहरण के लिए, क्रोमैटिन असेंबली फैक्टर -1 (सीएएफ -1) निर्भर है जबकि हिस्टोन नियामक ए (हीरा) डीएनए संश्लेषण12,13 से स्वतंत्र है। इसी तरह, हिस्टोन चैपरोन का न्यूक्लियोप्लाज्मिन परिवार शुक्राणु क्रोमैटिन डीकंडेनसेशन और न्यूक्लियोसोम असेंबली14 में शामिल है। न्यूक्लियोसोम असेंबली प्रोटीन (एनएपी) परिवार के सदस्य विट्रो में न्यूक्लियोसोम जैसी संरचनाओं के गठन की सुविधा प्रदान करते हैं और साइटोप्लाज्म और न्यूक्लियस15 के बीच हिस्टोन के शटलिंग में शामिल होते हैं। न्यूक्लियोप्लाज्मिन और एनएपी परिवार प्रोटीन दोनों कार्यात्मक हिस्टोन चैपरोन हैं लेकिन किसी भी संरचनात्मक विशेषताओं को साझा नहीं करते हैं। अनिवार्य रूप से, कोई भी एकल संरचनात्मक विशेषता एक प्रोटीन को हिस्टोन चैपरोन16 के रूप में वर्गीकृत करने की अनुमति नहीं देती है। संरचनात्मक अध्ययनों के साथ कार्यात्मक और बायोफिज़िकल परख का उपयोग हिस्टोन चैपरोन को चिह्नित करने में सबसे अच्छा काम करता है।
यह काम एक प्रोटीन को हिस्टोन चैपरोन के रूप में चिह्नित करने के लिए जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल तरीकों का वर्णन करता है जो न्यूक्लियोसोम असेंबली में सहायता करता है। सबसे पहले, हिस्टोन चैपरोन की ऑलिगोमेरिक स्थिति और स्थिरता का विश्लेषण करने के लिए विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी की गई थी। इसके बाद, ड्राइविंग बलों और हिस्टोन चैपरोन-हिस्टोन इंटरैक्शन की प्रतिस्पर्धी प्रकृति को निर्धारित करने के लिए एक पुल-डाउन परख का प्रदर्शन किया गया था। हालांकि, प्रोटीन के आकार और इसके परिसरों के कारण विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके इन इंटरैक्शन के हाइड्रोडायनामिक मापदंडों की सटीक गणना नहीं की जा सकी जो कॉलम के माध्यम से उनके प्रवास को प्रभावित करते हैं। इसलिए, विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग किया गया था, जो इन-सॉल्यूशन मैक्रोमोलेक्यूलर गुण प्रदान करता है जिसमें सटीक आणविक भार, बातचीत का स्टोइकोमेट्री और जैविक अणुओं का आकार शामिल है। पिछले अध्ययनों ने बड़े पैमाने पर इन विट्रो हिस्टोन चैपरोनिंग परख का उपयोग किया है ताकि एचएससीएस 116 17, डीएमएसीएफ18, एससीआरटीटी106 पी 19, एचएसएनपीएम1 20 जैसे हिस्टोन चैपरोन को कार्यात्मक रूप से चिह्नित किया जा सके। हिस्टोन चैपरोनिंग परख का उपयोग प्रोटीन को कार्यात्मक रूप से हिस्टोन चैपरोन के रूप में चिह्नित करने के लिए भी किया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>814326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>193983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25M FPLC</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Instrument for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An-60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361964</td>
			<td>Rotor for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.15444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (7 kDa cut-off)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>68700</td>
			<td>For dialysing protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ATX224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide (EtBr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12009077</td>
			<td>For imaging gels after staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704405</td>
			<td>Instrument for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683779</td>
			<td>For pipetting of micro-volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000</td>
			<td>Instrument for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>800172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano drop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For measurement of protein and DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>Resin beads for pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima AUC analytical ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B86437</td>
			<td>Instrument for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MT30130863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SD0061</td>
			<td>Plasmid for supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated high-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDFIT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDNTERP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPrep Spin Columns</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SC1000</td>
			<td>For pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.10732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topoisomerase I</td>
			<td>Inspiralis</td>
			<td>WGT102</td>
			<td>Enzyme used in plasmid supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>N&#252;ve</td>
			<td>NB 5</td>
			<td>For heat treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays

हिस्टोन प्रोटीन यूकेरियोटिक क्रोमैटिन बनाने के लिए डीएनए के साथ जुड़ते हैं। क्रोमैटिन की मूल इकाई एक न्यूक्लियोसोम है, जो एक हिस्टोन ऑक्टामर से बना होता है जिसमें डीएनए द्वारा लपेटे गए कोर हिस्टोन एच 2 ए, एच 2 बी, एच 3 और एच 4 की दो प्रतियां होती हैं। ऑक्टेमर एक एच 2 ए / एच 2 बी डिमर की दो प्रतियों और एच 3 / एच 4 टेट्रामर की एक एकल प्रति से बना है। अत्यधिक चार्ज किए गए कोर हिस्टोन सेलुलर साइटोप्लाज्म और नाभिक में कई प्रोटीनों के साथ गैर-विशिष्ट बातचीत के लिए प्रवण होते हैं। हिस्टोन चैपरोन प्रोटीन का एक विविध वर्ग बनाते हैं जो साइटोप्लाज्म से नाभिक में हिस्टोन को शटल करते हैं और डीएनए पर उनके जमाव में सहायता करते हैं, इस प्रकार न्यूक्लियोसोम असेंबली प्रक्रिया में सहायता करते हैं। कुछ हिस्टोन चैपरोन या तो H2A / H2B या H3 / H4 के लिए विशिष्ट हैं, और कुछ दोनों के लिए चैपरोन के रूप में कार्य करते हैं। यह प्रोटोकॉल बताता है कि इन विट्रो प्रयोगशाला तकनीकों जैसे कि पुल-डाउन परख, विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, विश्लेषणात्मक अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन और हिस्टोन चैपरोनिंग परख का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है कि कोई प्रोटीन हिस्टोन चैपरोन के रूप में कार्यात्मक है या नहीं।

एराबिडोप्सिस थैलियाना से प्रोटीन एफकेबीपी 53 के पुनः संयोजक एन-टर्मिनल न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन को विश्लेषणात्मक एसईसी के अधीन किया गया था। क्षालन शिखर की मात्रा को इसकी ओलिगोमेरिक स्थिति की प?...

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In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

यह प्रोटोकॉल उन तरीकों की एक बैटरी का वर्णन करता है जिसमें हिस्टोन चैपरोन ऑलिगोमेराइजेशन और स्थिरता का अध्ययन करने के लिए विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, हिस्टोन चैपरोन-हिस्टोन इंटरैक्शन को उजागर करने के लिए पुल-डाउन परख, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के स्टोइकोमेट्री का विश्लेषण करने के लिए एयूसी, और विट्रो में एक कथित हिस्टोन चैपरोन को कार्यात्मक रूप से चिह्नित करने के लिए हिस्टोन चैपरोनिंग परख शामिल है।

इन विट्रो विश्लेषणात्मक, पुल-डाउन और चैपरोनिंग परख का उपयोग करके हिस्टोन चैपरोन का लक्षण वर्णन

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

हमारा प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे विश्लेषणात्मक आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, विश्लेषणात्मक अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन और हिस्टोन चैपरोनिंग परख जैसी तकनीकों का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है कि प्रोटीन हिस्टोन चैपरोन है या नहीं। अग्रानुक्रम का उपयोग करते समय यहां शामिल तकनीकों को सीधे एक कथित चैपरोन को चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकता है। वह संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक के साथ जा सकता है।तकनीक क्रोमैटिन अनुसंधान के क्षेत्र में लागू होती हैं। हालांकि, व्यक्तिगत तरीकों को आवश्यकतानुसार रुचि के किसी भी अन्य प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है। इस प्रक्रिया का प्रदर्शन श्री सुरजीत गांधी करेंगे, जो मेरी प्रयोगशाला के पीएचडी छात्र हैं।पीएचडी की छात्रा अर्चना सामल, विश्लेषणात्मक अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन प्रयोग के लिए श्री रुचिर सी. बोबडे के साथ; श्री सोमनाथ बराल, एक पीएचडी छात्र; प्लास्मिड सुपर-कॉइलिंग परख के लिए श्री केतुल सहारण के साथ सबसे पहले, पांच-माइक्रोमोलर हिस्टोन चैपरोन को 20-माइक्रोमोलर एच 2 ए / एच 2 बी डिमर के साथ 300 माइक्रोलीटर इक्विलिब्रेशन बफर में मिलाएं। किसी भी अवक्षेप को हटाने के लिए हिस्टोन चैपरोन एच 2 ए / एच 2 बी कॉम्प्लेक्स को सेंट्रीफ्यूज करें।नमूने को स्पिन कॉलम पर लोड करें जो संतुलन बफर के साथ पूर्व-समतुल्य है। अतिरिक्त H2A/H2B डिमर को हटाने के लिए कॉलम को 100 कॉलम वॉल्यूम या चार मिलीलीटर वॉश बफर से धोएं। इसके बाद, हिस्टोन चैपरोन एच 2 ए / एच 2 बी कॉम्प्लेक्स को 20-से 60-माइक्रोमोलर एच 3 / एच 4 टेट्रामर के साथ मिलाएं।किसी भी अनबाउंड एच 3 / एच 4 टेट्रामर को हटाने के लिए कॉलम को 100 कॉलम वॉल्यूम या चार मिलीलीटर वॉश बफर के साथ फिर से धोएं, फिर नमूनों को क्षालन बफर के साथ मिलाएं। इल्यूटेड नमूनों को 18% एसडीएस-पेज पर अधीन करें। फिर, कूमासी शानदार नीले आर 250 के साथ दाग लगाएं और जेल की कल्पना करें।विश्लेषणात्मक आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके डायलिसिस बफर के साथ हिस्टोन चैपरोन में एच 2 ए / एच 2 बी डिमर, एच 3 / एच 4 टेट्रामर को व्यक्तिगत रूप से शुद्ध करें। बाद में आगे कमजोर पड़ने की तैयारी करने और एयूसी सेल में संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए बफर को रन से सहेजें। एयूसी नमूनों के लिए, 0.3 से 0.6 के ओडी 280 तक पहुंचने के लिए सहेजे गए डायलिसिस बफर का उपयोग करके अलग-अलग ट्यूबों में डिमर या टेट्रामर के साथ शुद्ध चैपरोन को 450 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में मिलाएं।सेल को डबल-सेक्टर सेंटरपीस और क्वार्ट्ज खिड़कियों के साथ इकट्ठा करें जो एक अवशोषण डिटेक्टर के साथ एक विश्लेषणात्मक अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूज के साथ प्रदान की जाती हैं। नमूना समाधान के 400 माइक्रोलीटर और डायलिसिस बफर के 420 माइक्रोलीटर क्रमशः सेल के संदर्भ और नमूना क्षेत्रों में भरें। कोशिकाओं का वजन और सटीक संतुलन करें और उन्हें चार-छेद टाइटेनियम रोटर में लोड करें।कोशिकाओं और रोटर के निचले भाग में निशान का उपयोग करके कोशिकाओं को संरेखित करें। सेंट्रीफ्यूज में रोटर लोड करें, ढक्कन बंद करें, और रन शुरू करें, जो वैक्यूम को विकसित करने और तापमान को स्थिर करने की अनुमति देता है। डेटा विश्लेषण के लिए, प्रोग्राम SEDNTERP का उपयोग करके प्रोटीन की अमीनो एसिड संरचना के आधार पर प्रोटीन बफर घटकों और आंशिक विशिष्ट मात्रा के लिए घनत्व और चिपचिपाहट की गणना करें।एयूसी मशीन से डेटा को प्रोग्राम SEDFIT में लोड करें। मेनिस्कस, लाल रेखा, सेल बॉटम, ब्लू लाइन और डेटा विश्लेषण सीमाओं को हरी रेखाओं को परिभाषित करें। एक मॉडल के रूप में निरंतर सीएस वितरण चुनें।पैरामीटर अनुभाग में, रिज़ॉल्यूशन अधिकतम 100 तक सेट करें। इसके बाद, अवसादन गुणांक न्यूनतम से शून्य और अधिकतम 10 से 15 तक सेट करें। घर्षण अनुपात को शुरू में 1.2 पर सेट करें और डेटा से अनुपात प्राप्त करने के लिए फ्लोट करने का विकल्प चुनें।एक सिग्मा नियमितीकरण के लिए एफ-अनुपात को 0.68 पर सेट करें। SEDNTURP से प्राप्त आंशिक विशिष्ट मात्रा, बफर घनत्व और चिपचिपाहट सेट करें। लैम समीकरण को हल करने के लिए सॉफ़्टवेयर को अनुमति देने के लिए रन दबाएं।परिशोधित करने के लिए फिट दबाएँ. आणविक द्रव्यमान का अनुमान लगाने के लिए मुख्य टूलबार के प्रदर्शन फ़ंक्शन में सीएस में पीक एमडब्ल्यू दिखाएं। दो-माइक्रोमोलर एच 3 / एच 4 टेट्रामर और चार-माइक्रोमोलर एच 2 ए / एच 2 बी डिमर को हिस्टोन चैपरोन की बढ़ती सांद्रता के साथ मिलाएं, जो एक असेंबली बफर में 50 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा तक होता है।मिश्रण को 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके साथ ही, 50 माइक्रोलीटर पर अंतिम मात्रा में असेंबली बफर में एक माइक्रोग्राम टोपोइसोमेरेज आई एंजाइम के साथ नकारात्मक सुपर-कॉइल्ड पीयूसी -19 प्लास्मिड के 500 नैनोग्राम का इलाज करें। इसके बाद, टेट्रामर, डिमर और हिस्टोन चैपरोन युक्त पूर्व-मिश्रित समाधान को शिथिल प्लाज्मा डीएनए के साथ मिलाएं।2एक्स स्टॉप बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्लास्मिड डीएनए को डीप्रोटीन करके असेंबली प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया मिश्रण वाली ट्यूब में ट्राइस-संतृप्त फिनोल की समान मात्रा जोड़ें और प्रतिक्रिया मिश्रण की सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं। फिर, नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।धीरे से एक माइक्रोपिपेट के साथ प्लास्मिड डीएनए युक्त ऊपरी जलीय चरण को इकट्ठा करें और क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा मिलाएं। भंवर मिश्रण। इसके बाद, ऊपरी जलीय चरण एकत्र करें, पीएच 5.5 के तीन-मोलर सोडियम एसीटेट की 1/10 मात्रा जोड़ें, और बर्फ-ठंडे इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम जोड़ें।ट्यूब को तीन से चार बार मोड़कर घोल को अच्छी तरह मिलाएं। नमूने को 10 मिनट के लिए 16, 200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और धीरे से सुपरनैटेंट को छोड़ दें। ट्यूबों को कमरे के तापमान पर खुला रखें जब तक कि इथेनॉल की मात्रा का पता न लग जाए, जिससे ट्यूब में अवक्षेपित प्लास्मिड डीएनए रह जाए।विश्लेषणात्मक एसईसी परिणामों से पता चला है कि एराबिडोप्सिस थैलियाना प्रोटीन एफकेबीपी 53 का पुनः संयोजक एन-टर्मिनल न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन समाधान में 65 किलोडाल्टन का एक पेंटामर है। गर्मी उपचार के अधीन न्यूक्लियोप्लाज्मिन नमूने से पता चला कि डोमेन अत्यधिक थर्मो-स्थिर है। न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन ने सोडियम क्लोराइड के दो मोलर तक नमक स्थिरता और चार मोलर तक यूरिया स्थिरता प्रदर्शित की।एक पुल-डाउन परख से पता चला कि एच 2 ए / एच 2 बी डिमर के साथ न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन की बातचीत 0.4-मोलर सोडियम क्लोराइड तक स्थिर थी, जबकि एच 3 / एच 4 के साथ संबंध 0.7 मोलर तक स्थिर था। चैपरोन एच 2 ए / एच 2 बी डिमर और एच 3 / एच 4 टेट्रामर को एक साथ बांधता है, भले ही उन्हें चैपरोन में जोड़ा गया हो, जो ओलिगोमर्स के लिए अलग-अलग इंटरैक्शन साइटों को दर्शाता है। एयूसी-एसवी के माध्यम से अनुमानित आणविक द्रव्यमान हिस्टोन ऑलिगोमर्स के साथ न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन के 1: 1 स्टोइकोमेट्री को प्रकट करते हैं।प्लास्मिड सुपर-कॉइलिंग परख में, पुनः संयोजक पौधे हिस्टोन चैपरोन एटीएनआरपी 1 और एटीएनआरपी 2 ने सुपर-कॉइल्ड प्लास्मिड की मात्रा में वृद्धि की, यह सुझाव देते हुए कि यह न्यूक्लियोसोम बनाने के लिए डीएनए पर हिस्टोन जमा कर सकता है, जिससे डीएनए सुपर कॉइलिंग हो सकती है। प्लास्मिड सुपर-कॉइलिंग परख को हिस्टोन डीएनए और चैपरोन लक्षण वर्णन के लिए विशेष देखभाल और संभावित अनुकूलन की आवश्यकता होती है। बाध्यकारी स्थिरता की पुष्टि करने के लिए आइसोमेरिक लक्षण वर्णन टेलीमेट्री का उपयोग विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण प्रयोगों के अनुवर्ती के रूप में किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

प्रजाति निर्धारण और मिश्रण में Quantitation मांस प्रमाणीकरण करने के लिए पेप्टाइड्स एप्लाइड के एमआरएम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

अंतर स्कैनिंग उष्मामिति - थर्मल स्थिरता और प्रोटीन एंटीजन की रचना का आकलन के लिए एक विधि

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

बढ़ी नमूना संयुक्त पूर्वगामी समस्थानिक लेबलिंग और समदाब रेखीय टैगिंग का उपयोग ऊतकों की Multiplexing (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

पौधों में Mannan कोशिका दीवार Polysaccharides के संरचनात्मक लक्षण का उपयोग कर गति

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

एक्स-रे क्रि और भौतिक तकनीकों द्वारा Immunoglobulin गुना के साथ नच का लक्षण वर्णन

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

इन विट्रो Ubicuitination और न्यूक्लिओसोमल हिस्टोन्स के Deubiquitination परख

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

रिंग-टाइप E3 सर्वव्यापी लिगैसइन विट्रो और प्लांटा में कार्यात्मक लक्षण वर्णन

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

लेबल-फ्री बाधा-आधारित जीपीसीआर अखस में वृद्धि थ्रूपुट के लिए स्टेपवाइज डोजिंग प्रोटोकॉल

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग का उपयोग करके एजिंग सी एलिगेंस में एमीलॉयड संरचनाओं का लक्षण वर्णन

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

इन विट्रो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित गतिशीलता परख के मायोसिन-विशिष्ट अनुकूलन

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...