Name: in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

インド政府科学技術研究委員会[CRG/2018/000695/PS]およびインド政府科学技術省バイオテクノロジー省[BT/INF/22/SP33046/2019]からのディリープ・ヴァスデヴァンへの学外助成金、およびブバネシュワール生命科学研究所からの壁内支援は大いに認められています。ヒストン調製にご協力いただいたスデシュナ・センさんとアンナプルナ・サフーさんに感謝します。同僚のチンマイ・モハパトラ博士、マナス・クマール・ジャグデフ氏、シェイク・ナウサド・ホセイン博士との議論も認められています。

1. ヒストンシャペロンのオリゴマー状態と安定性を解明するための分析サイズ排除クロマトグラフィー
<ol><li>ヒストンシャペロンのオリゴマー状態の解析<ol><li>24 mL 分析サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) カラムを 1.2 カラム容量 (CV)、すなわち 28.8 mL の脱気 SEC バッファー [20 mM の Tris-HCl (pH 7.5)、300 mM NaCl、および 1 mM の β-メルカプトエタノール (β-ME)] で 4 °C で平衡化します (...

<ol>
	<li>H&#252;bner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+and+transcriptional+regulation.">Chromatin organization and transcriptional regulation.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).</li><li>Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nucleosome+dynamics+and+their+links+to+gene+expression+and+DNA+replication.">Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).</li><li>Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+histone+H4+depletion+on+the+cell+cycle+and+transcription+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).</li><li>Prado, F., Aguilera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+depletion+of+histone+H4+increases+homologous+recombination-mediated+genetic+instability.">Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).</li><li>Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stoichiometry+of+histone+dimer+sets+is+necessary+for+high+fidelity+of+mitotic+chromosome+transmission.">Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission.</a> Cell. 44 (1), 43-52 (1986).</li><li>Groth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Asf1+regulates+the+flow+of+S+phase+histones+during+replicational+stress.">Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress.</a> Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).</li><li>Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomes+are+assembled+by+an+acidic+protein+which+binds+histones+and+transfers+them+to+DNA.">Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA.</a> Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).</li><li>Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+shuffle:+histone+chaperones+in+an+energetic+dance.">The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).</li><li>Akey, C. W., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+and+nucleosome+assembly.">Histone chaperones and nucleosome assembly.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).</li><li>De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+An+escort+network+regulating+histone+traffic.">Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).</li><li>Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+30+years+from+isolation+to+elucidation+of+the+mechanisms+of+nucleosome+assembly+and+disassembly.">Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).</li><li>Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+largest+subunit+of+chromatin+assembly+factor+1:+importance+in+vitro+and+during+Xenopus+early+development.">Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development.</a> EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).</li><li>Ray-Gallet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIRA+is+critical+for+a+nucleosome+assembly+pathway+independent+of+DNA+synthesis.">HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).</li><li>Frehlick, L. J., Eir&#237;n-L&#243;pez, J. M., Ausi&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).</li><li>Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+NAP-1+is+a+core+histone+chaperone+that+functions+in+ATP-facilitated+assembly+of+regularly+spaced+nucleosomal+arrays.">Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).</li><li>Els&#228;sser, S. J., D'Arcy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+mechanism+for+histone+chaperones.">Towards a mechanism for histone chaperones.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).</li><li>Rodr&#237;guez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+competent+chromatin+assembled+with+exogenous+histones+in+a+yeast+whole+cell+extract.">Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract.</a> Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).</li><li>Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+chromatin+containing+recombinant+Drosophila+core+histones.">Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtt106p+is+a+histone+chaperone+involved+in+heterochromatin-mediated+silencing.">Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).</li><li>Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+chaperone+nucleophosmin+enhances+acetylation-dependent+chromatin+transcription.">Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).</li><li>Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtFKBP53:+A+chimeric+histone+chaperone+with+functional+nucleoplasmin+and+PPIase+domains.">AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains.</a> Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).</li><li>Scofield, B. T. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Electrophoresis. , (2012).</li><li>Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialysis+and+concentration+of+protein+solutions.">Dialysis and concentration of protein solutions.</a> Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).</li><li>Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+analysis+of+recombinant+importin-histone+complexes+using+analytical+ultracentrifugation.">Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation.</a> Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).</li><li>Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+current+methods+in+sedimentation+velocity+and+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2013).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-distribution+analysis+of+macromolecules+by+sedimentation+velocity+ultracentrifugation+and+Lamm+equation+modelling.">Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+Arabidopsis+thaliana+NAP1-related+protein+2+(AtNRP2)+and+comparison+with+its+homolog+AtNRP1.">Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1.</a> Molecules. 24 (12), 2258 (2019).</li><li>Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAF-1-induced+oligomerization+of+histones+H3/H4+and+mutually+exclusive+interactions+with+Asf1+guide+H3/H4+transitions+among+histone+chaperones+and+DNA.">CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).</li><li>Bowman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+chaperones+Vps75+and+Nap1+form+ring-like,+tetrameric+structures+in+solution.">The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).</li><li>Newman, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+multimeric+assemblies+of+nucleosome+assembly+protein+and+histones+revealed+by+small-angle+X-ray+scattering+and+electron+microscopy.">Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).</li><li>Edlich-Muth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pentameric+nucleoplasmin+fold+is+present+in+Drosophila+FKBP39+and+a+large+number+of+chromatin-related+proteins.">The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).</li><li>Franco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+ability+of+nucleoplasmin+to+assemble+and+chaperone+histone+octamers+for+DNA+deposition.">Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).</li><li>Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FK506-binding+protein,+Fpr4,+is+an+acidic+histone+chaperone.">The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone.</a> FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).</li><li>Graziano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hydrophobic+effect+in+the+salt-induced+dimerization+of+bovine+beta-lactoglobulin+at+pH+3.">Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3.</a> Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).</li><li>Burgess, R. J., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+in+nucleosome+assembly+and+human+disease.">Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).</li><li>Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+histone+chaperone+yeast+Asf1+in+the+assembly+and+disassembly+of+histone+H3/H4-DNA+complexes.">The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).</li><li>Avvakumov, N., Nourani, A., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+Modulators+of+chromatin+marks.">Histone chaperones: Modulators of chromatin marks.</a> Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).</li><li>Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperoning+histones+during+DNA+replication+and+repair.">Chaperoning histones during DNA replication and repair.</a> Cell. 140 (2), 183-195 (2010).</li><li>Chu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+electrostatic+interactions+in+the+association+of+intrinsically+disordered+histone+chaperone+Chz1+and+histone+H2A.Z-H2B.">Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B.</a> PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).</li><li>Heidarsson, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+proteins+enable+histone+chaperoning+on+the+nucleosome.">Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

この研究は、推定ヒストンシャペロンの生化学的および生物物理学的特性評価のための包括的なプロトコルセットを実証および検証します。本明細書では、組換え発現および精製されたNAPファミリータンパク質、AtNRP1およびAtNRP2、ならびにAtFKBP53のN末端ヌクレオプラスミンドメインを用いて、プロトコルを実証した。同じ一連の実験は、これまで特徴付けられていなかったあらゆる生物から?...

DNAとヒストンタンパク質からなるヌクレオソームは、クロマチンの構造単位を形成し、いくつかの重要な細胞イベントを調節します。ヌクレオソームは動的に再配置および再構築され、複製、転写、翻訳などのさまざまなプロセスからDNAにアクセスできるようにします1,2。塩基性の高いヒストンは、細胞環境中の酸性タンパク質と相互作用するか、または凝集を受ける傾向があり、したがって様々な細胞欠陥をもたらす3,4,5。ヒストンシャペロンと呼ばれる専用タンパク質のグループは、細胞質から核へのヒストンの輸送を助け、異常なヒストン-DNA凝集イベントを防ぎます6,7。基本的に、ほとんどのヒストンシャペロンは、生理的イオン強度でヒストンをDNA上に貯蔵および伝達し、それによってヌクレオソームの形成を助けます8,9。一部のヒストンシャペロンは、ヒストンオリゴマーH2A / H2BまたはH3 / H410に対して明確な好みを持っています。
ヒストンシャペロンは、DNA合成に依存しない、または独立にヌクレオソームを組み立てる能力に基づいて特徴付けられる11。例えば、クロマチン集合因子-1(CAF-1)は依存的であるが、ヒストン調節因子A(HIRA)はDNA合成に依存しない12,13。同様に、ヒストンシャペロンのヌクレオプラスミンファミリーは、精子クロマチン脱凝縮およびヌクレオソーム集合に関与している14。ヌクレオソーム集合タンパク質(NAP)ファミリーのメンバーは、in vitroでのヌクレオソーム様構造の形成を促進し、細胞質と核の間のヒストンの往復に関与しています15。ヌクレオプラスミンとNAPファミリータンパク質はどちらも機能的なヒストンシャペロンですが、構造的特徴を共有していません。本質的に、単一の構造的特徴は、タンパク質をヒストンシャペロンとして分類することを可能にしない16。機能的および生物物理学的アッセイの使用と構造研究は、ヒストンシャペロンの特性評価に最適です。
この研究では、タンパク質をヌクレオソームの組み立てを助けるヒストンシャペロンとして特徴付けるための生化学的および生物物理学的方法について説明しています。まず、ヒストンシャペロンのオリゴマー状態と安定性を分析するために、分析サイズ排除クロマトグラフィーを実施しました。次に、プルダウンアッセイを実施して、ヒストンシャペロン-ヒストン相互作用の駆動力と競合性を決定しました。しかし、これらの相互作用の流体力学的パラメータは、カラム内の移動に影響を与えるタンパク質の形状とその複合体のために、分析サイズ排除クロマトグラフィーを使用して正確に計算することができませんでした。したがって、正確な分子量、相互作用の化学量論、および生体分子の形状を含む溶液中の高分子特性を提供する分析超遠心分離が使用されました。過去の研究では、yScS11617、DmACF 18、ScRTT106p19、HsNPM120などのヒストンシャペロンを機能的に特徴付けるために、in vitroヒストンシャペロンアッセイが広く使用されています。ヒストンシャペロンアッセイは、タンパク質をヒストンシャペロンとして機能的に特徴付けるためにも使用されました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>814326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>193983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25M FPLC</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Instrument for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An-60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361964</td>
			<td>Rotor for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.15444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (7 kDa cut-off)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>68700</td>
			<td>For dialysing protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ATX224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide (EtBr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12009077</td>
			<td>For imaging gels after staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704405</td>
			<td>Instrument for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683779</td>
			<td>For pipetting of micro-volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000</td>
			<td>Instrument for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>800172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano drop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For measurement of protein and DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>Resin beads for pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima AUC analytical ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B86437</td>
			<td>Instrument for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MT30130863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SD0061</td>
			<td>Plasmid for supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated high-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDFIT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDNTERP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPrep Spin Columns</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SC1000</td>
			<td>For pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.10732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topoisomerase I</td>
			<td>Inspiralis</td>
			<td>WGT102</td>
			<td>Enzyme used in plasmid supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>N&#252;ve</td>
			<td>NB 5</td>
			<td>For heat treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays

ヒストンタンパク質はDNAと会合して真核生物のクロマチンを形成します。クロマチンの基本単位はヌクレオソームであり、コアヒストンH2A、H2B、H3、およびH4の2つのコピーからなるヒストン八量体で構成され、DNAに包まれています。八量体は、H2A/H2B二量体の2コピーとH3/H4四量体の1コピーからなる。高荷電コアヒストンは、細胞質および核内のいくつかのタンパク質と非特異的相互作用を起こしやすい。ヒストンシャペロンは、ヒストンを細胞質から核にシャトルし、DNAへの沈着を助け、ヌクレオソームの組み立てプロセスを支援する多様なクラスのタンパク質を形成します。一部のヒストンシャペロンは、H2A / H2BまたはH3 / H4のいずれかに特異的であり、一部は両方のシャペロンとして機能します。このプロトコルでは、プルダウンアッセイ、分析サイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心分離、ヒストンシャペロンアッセイなどの in vitro ラボ技術を組み合わせて使用して、特定のタンパク質がヒストンシャペロンとして機能するかどうかを確認する方法について説明します。

シロイヌナズナ由来のタンパク質FKBP53の組換えN末端ヌクレオプラスミンドメインをSECの分析に供した。溶出ピーク体積を標準曲線に対してプロットし、そのオリゴマー状態を同定した。SECの分析結果から、ドメインは溶液中に五量体として存在し、分子量は約58 kDaであることが明らかになりました(図1A、B)。さらに、ヌクレオプラスミンドメインを?...

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In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

このプロトコルは、ヒストンシャペロンのオリゴマー化と安定性を研究するための分析サイズ排除クロマトグラフィー、ヒストンシャペロンとヒストンの相互作用を解明するためのプルダウンアッセイ、タンパク質複合体の化学量論を分析するAUC、および推定ヒストンシャペロンをin vitroで機能的に特徴付けるためのヒストンシャペロンアッセイを含む一連の方法について説明しています。

インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

私たちのプロトコルは、プルダウンアッセイ、分析サイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心分離、ヒストンシャペロニングアッセイなどの技術を使用して、タンパク質がヒストンシャペロンであるかどうかを確認する方法を示しています。ここで取り上げる手法は、タンデムを使用する場合、推定シャペロンを特徴付けるために直接適用できます。彼は構造生物学のテクニックと一緒に行くことができます。この技術はクロマチン研究の分野に適用できます。ただし、個々の方法は、必要に応じて、目的の他のタンパク質に適用できます。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるスラジット・ガンジー氏で、複雑なプルダウンアッセイを行います。博士課程の学生であるアルカナ・サマル氏と分析用超遠心分離実験用のRuchir C.Bobde氏、博士課程の学生であるSomanath Baral氏、プラスミドスーパーコイリングアッセイ用のKetul Saharan氏とともに まず、300マイクロリットルの平衡化バッファー中で、5マイクロモルのヒストンシャペロンと20マイクロモルのH2A/H2Bダイマーを混合します。ヒストンシャペロンH2A/H2B複合体を遠心分離して沈殿物を除去します。平衡化バッファーで事前に平衡化したスピンカラムにサンプルをロードします。100カラム容量または4ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを洗浄し、余分なH2A/H2B二量体を除去します。次に、ヒストンシャペロンH2A/H2B複合体を20〜60マイクロモルのH3/H4四量体と混合します。100カラム容量または4ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを再洗浄して、結合していないH3/H4四量体を除去してから、溶出バッファーでサンプルを溶出します。溶出したサンプルを18%SDS-PAGEにかけます。次に、クマシーブリリアントブルーR250で染色し、ゲルを視覚化します。ヒストンシャペロン中のH2A/H2B二量体、H3/H4四量体を透析バッファーで個別に精製するには、分析サイズ排除クロマトグラフィーを使用します。ランのバッファーを保存して、後でさらに希釈を準備し、AUC セルで参照として使用します。AUCサンプルの場合、精製したシャペロンを別々のチューブで二量体または四量体と混合し、保存した透析バッファーを使用して最終容量450マイクロリットルにし、OD280が0.3〜0.6になります。ダブルセクターのセンターピースと、吸光度検出器を備えた分析用超遠心分離機を備えた石英窓でセルを組み立てます。400マイクロリットルのサンプル溶液と420マイクロリットルの透析バッファーを、それぞれセルの参照セクターとサンプルセクターに充填します。セルの重量を量り、正確にバランスを取り、4穴のチタンローターにロードします。セルとローターの下部にあるマークを使用してセルを整列させます。ローターを遠心分離機にロードし、蓋を閉めて運転を開始すると、真空が発生し、温度が安定します。データ解析のために、プログラムSEDNTERPを使用して、タンパク質のアミノ酸組成に基づいて、タンパク質バッファー成分および部分比容積の密度および粘度を計算する。AUC マシンからプログラム SEDFIT にデータをロードします。メニスカス、赤の線、セルの下部、青い線、およびデータ分析境界の緑の線を定義します。モデルとして連続 CS 配布を選択します。パラメーター セクションで、最大解像度を 100 に設定します。次に、沈降係数の最小値をゼロに設定し、最大値を10〜15に設定します。最初に摩擦比を1.2に設定し、データから摩擦比を導き出すために浮動小数点を選択します。1シグマ正則化のF比を0.68に設定します。部分比容積、バッファー密度、および粘度をSEDNTURPから取得するように設定します。[実行]を押して、ソフトウェアがラム方程式を解くようにします。[フィット] を押して絞り込みます。メインツールバーの表示機能でCSにピークMwを表示を選択して、分子量を推定します。2マイクロモルのH3/H4四量体と4マイクロモルのH2A/H2B二量体を、1マイクロモルから6マイクロモルの範囲のヒストンシャペロンの濃度を上げて、アセンブリバッファー中で最終容量50マイクロリットルまで混合します。混合物を摂氏4度で30分間インキュベートします。同時に、500ナノグラムの負のスーパーコイルPUC-19プラスミドを、アセンブリバッファー中の1マイクログラムのトポイソメラーゼI酵素で50マイクロリットルの最終容量で前処理します。次に、四量体、二量体、およびヒストンシャペロンを含む予備混合溶液を、弛緩した血漿DNAと組み合わせます。100マイクロリットルの2Xストップバッファーを加えてインキュベートし、プラスミドDNAを除タンパクしてアセンブリ反応を終了します。反応混合物を含むチューブに等量のトリス飽和フェノールを加え、反応混合物の内容物をよく混合する。その後、試料を遠心分離する。プラスミドDNAを含む上水相をマイクロピペットで穏やかに回収し、等量のクロロホルムを混合します。混合物を渦巻きます。次に、上部水相を収集し、pH 5.5の1/10容量の3モル酢酸ナトリウム、および2.5容量の氷冷エタノールを加える。チューブを3〜4回反転させて、溶液をよく混ぜます。サンプルを16, 200 Gで10分間遠心分離し、上清を静かに捨てます。微量のエタノールが蒸発するまでチューブを開いたままにし、沈殿したプラスミドDNAをチューブ内に残します。SECの分析結果から、シロイヌナズナタンパク質FKBP53の組換えN末端ヌクレオプラスミンドメインは、溶液中で65キロダルトンの五量体であることが明らかになりました。熱処理を施したヌクレオプラスミン試料は、ドメインが非常に熱安定性であることを示した。ヌクレオプラスミンドメインは、塩化ナトリウム2モルまでの塩安定性と最大4モルの尿素安定性を示しました。プルダウンアッセイにより、ヌクレオプラスミンドメインとH2A/H2Bダイマーとの相互作用は0.4モル塩化ナトリウムまで安定しているのに対し、H3/H4との会合は0.7モルまで安定であることが明らかになりました。シャペロンは、シャペロンに付加される順序に関係なく、H2A/H2B二量体とH3/H4四量体を同時に結合し、オリゴマーの別々の相互作用部位を示します。AUC-SVによる推定分子量は、ヒストンオリゴマーによるヌクレオプラスミンドメインの1:1の化学量論を明らかにしました。プラスミドスーパーコイリングアッセイでは、組換え植物ヒストンシャペロンAtNRP1およびAtNRP2がスーパーコイルプラスミドの量を増加させ、ヒストンをDNA上に沈着させてヌクレオソームを形成し、DNAスーパーコイリングを引き起こす可能性があることを示唆しました。プラスミドスーパーコイリングアッセイには、ヒストンDNAとシャペロンの特性評価のために特別な注意と可能な最適化が必要です。異性体特性評価テレメトリは、結合安定性を確認するための分析サイズ排除実験のフォローアップとして使用できます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

肉認証にペプチド応用のMRM質量分析法を用いて混合物中の種の決意と定量

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

示差走査熱量測定 - タンパク質抗原の熱安定性および立体配座を評価するための方法

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

インビトロとプランタにおけるRING型E3ユビキチンリガーゼの機能特性評価

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

ラベルフリーインピーダンスベースのGPCRアッセイにおけるスループット向上のためのステップワイズドージングプロトコル

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

蛍光生涯イメージングを用いたエージングC.エレガンスにおけるアミロイド構造の特徴

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

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