Name: in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

Заочные гранты Дилипу Васудевану от Совета по научным и инженерным исследованиям правительства Индии [CRG/2018/000695/PS] и Департамента биотехнологии Министерства науки и технологий правительства Индии [BT/INF/22/SP33046/2019], а также внутренняя поддержка со стороны Института наук о жизни Бхубанешвара. Мы благодарим г-жу Судешну Сен и г-жу Аннапурну Саху за их помощь в приготовлении гистонов. Приветствуются также дискуссии с нашими коллегами д-ром Чинмайи Мохапатрой, г-ном Манасом Кумаром Джагдевым и д-ром Шейхом Наусадом Хоссейном.

1. Аналитическая размерно-эксклюзионная хроматография для выяснения олигомерного статуса и стабильности гистоновых шаперонов
<ol><li>Анализ олигомерного статуса гистоновых шаперонов<ol><li>Уравновешивайте колонку аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) объемом 24 мл с об?...

<ol>
	<li>H&#252;bner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+and+transcriptional+regulation.">Chromatin organization and transcriptional regulation.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).</li><li>Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nucleosome+dynamics+and+their+links+to+gene+expression+and+DNA+replication.">Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).</li><li>Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+histone+H4+depletion+on+the+cell+cycle+and+transcription+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).</li><li>Prado, F., Aguilera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+depletion+of+histone+H4+increases+homologous+recombination-mediated+genetic+instability.">Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).</li><li>Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stoichiometry+of+histone+dimer+sets+is+necessary+for+high+fidelity+of+mitotic+chromosome+transmission.">Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission.</a> Cell. 44 (1), 43-52 (1986).</li><li>Groth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Asf1+regulates+the+flow+of+S+phase+histones+during+replicational+stress.">Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress.</a> Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).</li><li>Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomes+are+assembled+by+an+acidic+protein+which+binds+histones+and+transfers+them+to+DNA.">Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA.</a> Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).</li><li>Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+shuffle:+histone+chaperones+in+an+energetic+dance.">The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).</li><li>Akey, C. W., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+and+nucleosome+assembly.">Histone chaperones and nucleosome assembly.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).</li><li>De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+An+escort+network+regulating+histone+traffic.">Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).</li><li>Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+30+years+from+isolation+to+elucidation+of+the+mechanisms+of+nucleosome+assembly+and+disassembly.">Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).</li><li>Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+largest+subunit+of+chromatin+assembly+factor+1:+importance+in+vitro+and+during+Xenopus+early+development.">Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development.</a> EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).</li><li>Ray-Gallet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIRA+is+critical+for+a+nucleosome+assembly+pathway+independent+of+DNA+synthesis.">HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).</li><li>Frehlick, L. J., Eir&#237;n-L&#243;pez, J. M., Ausi&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).</li><li>Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+NAP-1+is+a+core+histone+chaperone+that+functions+in+ATP-facilitated+assembly+of+regularly+spaced+nucleosomal+arrays.">Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).</li><li>Els&#228;sser, S. J., D'Arcy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+mechanism+for+histone+chaperones.">Towards a mechanism for histone chaperones.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).</li><li>Rodr&#237;guez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+competent+chromatin+assembled+with+exogenous+histones+in+a+yeast+whole+cell+extract.">Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract.</a> Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).</li><li>Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+chromatin+containing+recombinant+Drosophila+core+histones.">Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtt106p+is+a+histone+chaperone+involved+in+heterochromatin-mediated+silencing.">Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).</li><li>Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+chaperone+nucleophosmin+enhances+acetylation-dependent+chromatin+transcription.">Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).</li><li>Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtFKBP53:+A+chimeric+histone+chaperone+with+functional+nucleoplasmin+and+PPIase+domains.">AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains.</a> Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).</li><li>Scofield, B. T. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Electrophoresis. , (2012).</li><li>Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialysis+and+concentration+of+protein+solutions.">Dialysis and concentration of protein solutions.</a> Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).</li><li>Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+analysis+of+recombinant+importin-histone+complexes+using+analytical+ultracentrifugation.">Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation.</a> Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).</li><li>Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+current+methods+in+sedimentation+velocity+and+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2013).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-distribution+analysis+of+macromolecules+by+sedimentation+velocity+ultracentrifugation+and+Lamm+equation+modelling.">Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+Arabidopsis+thaliana+NAP1-related+protein+2+(AtNRP2)+and+comparison+with+its+homolog+AtNRP1.">Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1.</a> Molecules. 24 (12), 2258 (2019).</li><li>Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAF-1-induced+oligomerization+of+histones+H3/H4+and+mutually+exclusive+interactions+with+Asf1+guide+H3/H4+transitions+among+histone+chaperones+and+DNA.">CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).</li><li>Bowman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+chaperones+Vps75+and+Nap1+form+ring-like,+tetrameric+structures+in+solution.">The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).</li><li>Newman, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+multimeric+assemblies+of+nucleosome+assembly+protein+and+histones+revealed+by+small-angle+X-ray+scattering+and+electron+microscopy.">Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).</li><li>Edlich-Muth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pentameric+nucleoplasmin+fold+is+present+in+Drosophila+FKBP39+and+a+large+number+of+chromatin-related+proteins.">The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).</li><li>Franco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+ability+of+nucleoplasmin+to+assemble+and+chaperone+histone+octamers+for+DNA+deposition.">Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).</li><li>Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FK506-binding+protein,+Fpr4,+is+an+acidic+histone+chaperone.">The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone.</a> FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).</li><li>Graziano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hydrophobic+effect+in+the+salt-induced+dimerization+of+bovine+beta-lactoglobulin+at+pH+3.">Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3.</a> Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).</li><li>Burgess, R. J., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+in+nucleosome+assembly+and+human+disease.">Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).</li><li>Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+histone+chaperone+yeast+Asf1+in+the+assembly+and+disassembly+of+histone+H3/H4-DNA+complexes.">The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).</li><li>Avvakumov, N., Nourani, A., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+Modulators+of+chromatin+marks.">Histone chaperones: Modulators of chromatin marks.</a> Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).</li><li>Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperoning+histones+during+DNA+replication+and+repair.">Chaperoning histones during DNA replication and repair.</a> Cell. 140 (2), 183-195 (2010).</li><li>Chu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+electrostatic+interactions+in+the+association+of+intrinsically+disordered+histone+chaperone+Chz1+and+histone+H2A.Z-H2B.">Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B.</a> PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).</li><li>Heidarsson, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+proteins+enable+histone+chaperoning+on+the+nucleosome.">Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

Эта работа демонстрирует и подтверждает всеобъемлющий набор протоколов для биохимической и биофизической характеристики предполагаемого гистонового шаперона. При этом для демонстрации протоколов использовали рекомбинантно экспрессированные и очищенные белки семейства NAP, AtNRP1 и AtNR...

Нуклеосомы, состоящие из ДНК и гистоновых белков, образуют структурную единицу хроматина и регулируют несколько критических клеточных событий. Нуклеосомы динамически репозиционируются и реконструируются, чтобы сделать ДНК доступной для различных процессов, таких как репликация, транскрипция и трансляция 1,2. Гистоны, которые являются очень основными, либо имеют тенденцию взаимодействовать с кислыми белками в клеточной среде, либо подвергаются агрегации, что приводит к различным клеточным дефектам 3,4,5. Группа выделенных белков, называемых гистоновыми шаперонами, помогает транспорту гистонов из цитоплазмы в ядро и предотвращает аберрантные события агрегации гистон-ДНК 6,7. По сути, большинство гистоновых шаперонов хранят и переносят гистоны на ДНК с физиологической ионной силой, тем самым способствуя образованию нуклеосом 8,9. Некоторые гистоновые шапероны имеют определенное предпочтение гистоновым олигомерам H2A/H2B или H3/H410.
Гистоновые шапероны характеризуются на основе их способности собирать нуклеосомы, зависимые или независимые от синтеза ДНК11. Например, фактор сборки хроматина-1 (CAF-1) зависит, в то время как гистоновый регулятор A (HIRA) не зависит от синтеза ДНК12,13. Аналогичным образом, семейство нуклеоплазминов гистоновых шаперонов участвует в деконденсации хроматина сперматозоидов и сборке нуклеосом14. Члены семейства нуклеосомных сборочных белков (NAP) способствуют образованию нуклеосомоподобных структур in vitro и участвуют в перемещении гистонов между цитоплазмой и ядром15. Нуклеоплазмины и белки семейства NAP являются функциональными гистоновыми шаперонами, но не имеют общих структурных особенностей. По сути, ни одна структурная особенность не позволяет классифицировать белок как гистоновый шаперон16. Использование функциональных и биофизических анализов наряду со структурными исследованиями лучше всего подходит для характеристики гистоновых шаперонов.
В этой работе описываются биохимические и биофизические методы характеристики белка как гистонового шаперона, который помогает сборке нуклеосом. Сначала была проведена аналитическая размерно-эксклюзионная хроматография для анализа олигомерного статуса и стабильности гистоновых шаперонов. Затем был проведен вытягивающий анализ для определения движущих сил и конкурентного характера взаимодействий гистон-шаперон-гистон. Однако гидродинамические параметры этих взаимодействий не могут быть точно рассчитаны с помощью аналитической размерно-эксклюзионной хроматографии из-за формы белка и его комплексов, которые влияют на их миграцию через столб. Поэтому было использовано аналитическое ультрацентрифугирование, которое обеспечивает макромолекулярные свойства в растворе, которые включают точную молекулярную массу, стехиометрию взаимодействия и форму биологических молекул. В прошлых исследованиях широко использовался анализ гистонов in vitro для функциональной характеристики гистоновых шаперонов, таких как yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Анализ гистонового шаперонирования также использовался для функциональной характеристики белков как гистоновых шаперонов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>814326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>193983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25M FPLC</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Instrument for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An-60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361964</td>
			<td>Rotor for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.15444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (7 kDa cut-off)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>68700</td>
			<td>For dialysing protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ATX224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide (EtBr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12009077</td>
			<td>For imaging gels after staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704405</td>
			<td>Instrument for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683779</td>
			<td>For pipetting of micro-volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000</td>
			<td>Instrument for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>800172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano drop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For measurement of protein and DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>Resin beads for pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima AUC analytical ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B86437</td>
			<td>Instrument for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MT30130863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SD0061</td>
			<td>Plasmid for supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated high-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDFIT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDNTERP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPrep Spin Columns</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SC1000</td>
			<td>For pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.10732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topoisomerase I</td>
			<td>Inspiralis</td>
			<td>WGT102</td>
			<td>Enzyme used in plasmid supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>N&#252;ve</td>
			<td>NB 5</td>
			<td>For heat treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays

Гистоновые белки связываются с ДНК с образованием эукариотического хроматина. Основной единицей хроматина является нуклеосома, состоящая из гистонового октамера, состоящего из двух копий основных гистонов H2A, H2B, H3 и H4, обернутых вокруг ДНК. Октамер состоит из двух копий димера H2A/H2B и одной копии тетрамера H3/H4. Высокозаряженные гистоны ядра склонны к неспецифическим взаимодействиям с несколькими белками в клеточной цитоплазме и ядре. Гистоновые шапероны образуют разнообразный класс белков, которые переносят гистоны из цитоплазмы в ядро и помогают их отложению на ДНК, тем самым помогая процессу сборки нуклеосом. Некоторые гистоновые шапероны специфичны для H2A/H2B или H3/H4, а некоторые функционируют как шапероны для обоих. Этот протокол описывает, как лабораторные методы in vitro , такие как вытягивающие анализы, аналитическая хроматография с исключением размера, аналитическое ультрацентрифугирование и анализ гистонов, могут быть использованы в тандеме для подтверждения того, функционирует ли данный белок в качестве гистонового шаперона.

Рекомбинантный N-концевой нуклеоплазминовый домен белка FKBP53 из Arabidopsis thaliana был подвергнут аналитическому SEC. Пиковый объем элюирования был построен против стандартной кривой, чтобы определить его олигомерное состояние. Результаты анализа SEC показали, что домен существует в виде п?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Этот протокол описывает набор методов, которые включают аналитическую хроматографию с исключением размера для изучения олигомеризации и стабильности гистонов-шаперонов, анализ вытягивания для разгадки взаимодействий гистон-шаперон-гистон, AUC для анализа стехиометрии белковых комплексов и анализ гистонового шаперонирования для функциональной характеристики предполагаемого гистонового шаперона in vitro.

В пробирке Характеристика гистоновых шаперонов с использованием аналитических, вытягивающих и шаперонных анализов

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Наш протокол описывает, как такие методы, как вытягивающие анализы аналитической хроматографии исключения размера, аналитическое ультрацентрифугирование и анализ гистонового шаперонирования, могут быть использованы для подтверждения того, является ли белок гистоновым шапероном. Методы, описанные здесь, при использовании тандема, могут быть применены непосредственно для характеристики предполагаемого шаперона. он мог бы согласиться с техникой структурной биологии.Методики применимы в области исследования хроматина. Тем не менее, отдельные методы могут быть применены к любому другому белку, представляющему интерес, по мере необходимости. Продемонстрировать эту процедуру будет г-н Сураджит Ганди, аспирант из моей лаборатории, для сложного анализа вытягивания;Арчана Самал, аспирант, вместе с г-ном Руширом К. Бобде за аналитический эксперимент по ультрацентрифугированию; г-н Соманат Барал, аспирант; вместе с г-ном Кетулом Сахараном для плазмидного суперспирального анализа Во-первых, смешайте пятимикромолярные гистоновые шапероны с 20-микромолярными димерами H2A / H2B в 300 микролитрах буфера равновесия. Центрифугируйте комплекс гистонового шаперона H2A/H2B для удаления любого осадка.Загрузите образец в спиновой столбец, предварительно уравновешенный буфером равновесия. Вымойте колонну объемом 100 колонн или четырьмя миллилитрами промывочного буфера, чтобы удалить лишний димер H2A/H2B. Затем смешайте комплекс гистонового шаперона H2A/H2B с 20-60-микромолярным тетрамером H3/H4.Перемойте колонну объемом 100 колонн или четырьмя миллилитрами промывочного буфера, чтобы удалить любой несвязанный тетрамер H3/H4, а затем элюируйте образцы буфером элюирования. Подвергайте элюированные образцы 18%SDS-PAGE. Затем окрашиваем Coomassie блестящим синим R250 и визуализируем гель.Очистите димер H2A/H2B, тетрамер H3/H4 в гистоновом шапероне индивидуально с помощью диализного буфера с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии. Сохраните буфер от запуска, чтобы подготовить дальнейшие разведения в дальнейшем и использовать в качестве эталона в ячейке AUC. Для образцов AUC смешайте очищенные шапероны с димером или тетрамером в отдельных пробирках до конечного объема 450 микролитров, используя сохраненный диализный буфер, чтобы достичь OD280 от 0,3 до 0,6.Соберите ячейку с двухсекторным центральным элементом и кварцевыми окнами, снабженными аналитической ультрацентрифугой с детектором поглощения. Заполните 400 микролитров раствора образца и 420 микролитров диализного буфера в эталонный и образец секторов ячейки соответственно. Взвешивайте и точно балансируйте ячейки и загружайте их в титановый ротор с четырьмя отверстиями.Выровняйте ячейки, используя метки в нижней части ячеек и ротора. Загрузите ротор в центрифугу, закройте крышку и начните работу, что позволит создать вакуум и стабилизировать температуру. Для анализа данных рассчитать плотность и вязкость для буферных компонентов белков и частичный удельный объем на основе аминокислотного состава белка с помощью программы SEDNTERP.Загрузите данные с машины AUC в программу SEDFIT. Определите мениск, красную линию, нижнюю часть ячейки, синюю линию и зеленые границы анализа данных. Выберите Непрерывное распределение CS в качестве модели.В разделе параметров установите максимальное разрешение до 100. Затем установите минимальный коэффициент осаждения равным нулю и максимальным от 10 до 15. Установите коэффициент трения равным 1,2 изначально и выберите float, чтобы получить соотношение из данных.Установите коэффициент F равным 0,68 для регуляризации одной сигмы. Задайте частичный удельный объем, плотность буфера и вязкость, полученные из SEDNTURP. Нажмите Выполнить, чтобы позволить программному обеспечению решить уравнение лама.Нажмите Fit для уточнения. Выберите Show Peak Mw в CS в функции отображения главной панели инструментов для оценки молекулярных масс. Смешайте двухмикромолярный тетрамер H3/H4 и четырехмикромолярный димер H2A/H2B с возрастающими концентрациями гистонового шаперона, варьирующиеся от одного до шести микромолярного, в сборочном буфере до конечного объема 50 микролитров.Инкубировать смесь при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. Одновременно предварительно обрабатывают 500 нанограммов отрицательно перекрученной плазмиды PUC-19 одним микрограммом фермента топоизомеразы I в сборочном буфере в конечном объеме в 50 микролитров. Затем соедините предварительно смешанный раствор, содержащий тетрамер, димер и гистоновый шаперон, с расслабленной плазменной ДНК.Добавьте 100 микролитров 2X стоп-буфера и инкубируйте, чтобы завершить реакцию сборки путем депротеинизации плазмидной ДНК. Добавьте равный объем насыщенного трисом фенола в пробирку, содержащую реакционную смесь, и хорошо перемешайте содержимое реакционной смеси. Затем центрифугируйте образец.Аккуратно соберите верхнюю водную фазу, содержащую плазмидную ДНК, с помощью микропипетки и смешайте равный объем хлороформа. Вихрь смеси. Далее собирают верхнюю водную фазу, добавляют 1/10 объема трехмолярного ацетата натрия рН 5,5 и 2,5 объема ледяного этанола.Хорошо перемешайте раствор, перевернув трубку три-четыре раза. Центрифугируйте образец при 16, 200 г в течение 10 минут и осторожно выбросьте супернатант. Держите трубки открытыми при комнатной температуре, пока даже следовые количества этанола не испарятся, оставляя осажденную плазмидную ДНК в трубке.Результаты анализа SEC показали, что рекомбинантный N-концевой нуклеоплазминовый домен белка Arabidopsis thaliana FKBP53 представляет собой пентамер из 65 килодалтон в растворе. Образец нуклеоплазмина, подвергнутый термической обработке, показал, что домен является высокотермостабильным. Нуклеоплазминовый домен проявлял соляную стабильность до двух моляров хлорида натрия и стабильность мочевины до четырех моляров.Анализ показал, что взаимодействие нуклеоплазминового домена с димером H2A/H2B было стабильным до 0,4-молярного хлорида натрия, тогда как связь с H3/H4 была стабильной до 0,7 моляров. Шаперон связывает димер H2A/H2B и тетрамер H3/H4 одновременно, независимо от порядка, в котором они добавляются к шаперону, указывая на отдельные места взаимодействия для олигомеров. Расчетные молекулярные массы через AUC-SV показывают стехиометрию нуклеоплазминового домена 1:1 с гистоновыми олигомерами.В плазмидном суперспирали, рекомбинантные растительные гистоновые шапероны AtNRP1 и AtNRP2 увеличили количество суперспирализованной плазмиды, предполагая, что она может откладывать гистоны на ДНК с образованием нуклеосом, вызывая суперспирализацию ДНК. Плазмидный суперспиральный анализ нуждается в особом уходе и возможной оптимизации для характеристики ДНК гистонов и шаперонов. Телеметрия изомерных характеристик может использоваться в качестве продолжения аналитических экспериментов по исключению размеров для подтверждения стабильности связывания.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Определение и виды Количественное в смесях с помощью масс-спектрометрии MRM пептидов прикладной к мясу аутентификации

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Дифференциальная сканирующая калориметрия - метод оценки термической устойчивости и конформации белка антигена

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Функциональная характеристика РИНГ-типа E3 Ubiquitin Ligases in Vitro и В Планте

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Протокол поэтапного дозирования для увеличения пропускной записи в label-Free Impedance основе GPCR анализы

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...