Name: in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

Las subvenciones extramuros a Dileep Vasudevan de la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería del Gobierno de la India [CRG/2018/000695/PS] y el Departamento de Biotecnología, Ministerio de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India [BT/INF/22/SP33046/2019], así como el apoyo intramuros del Instituto de Ciencias de la Vida, Bhubaneswar, son muy reconocidos. Agradecemos a la Sra. Sudeshna Sen y a la Sra. Annapurna Sahoo por su ayuda con la preparación de histonas. También se reconocen las conversaciones con nuestros colegas el Dr. Chinmayee Mohapatra, el Sr. Manas Kumar Jagdev y el Dr. Shaikh Nausad Hossain.

1. Cromatografía analítica de exclusión de tamaño para dilucidar el estado oligomérico y la estabilidad de las chaperonas de histonas
<ol><li>Análisis del estado oligomérico de las chaperonas de histonas<ol><li>Equilibrar una columna de cromatografía analítica de exclusión de tamaño (SEC) de 24 ml con 1,2 ml de volumen de columna (CV), es decir, 28,8 ml de tampón SEC desgasificado [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 300 de NaCl mM y 1 mM de β-mercaptoetanol (β-ME)] a 4 °C (ver Tabla de ...

<ol>
	<li>H&#252;bner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+and+transcriptional+regulation.">Chromatin organization and transcriptional regulation.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).</li><li>Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nucleosome+dynamics+and+their+links+to+gene+expression+and+DNA+replication.">Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).</li><li>Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+histone+H4+depletion+on+the+cell+cycle+and+transcription+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).</li><li>Prado, F., Aguilera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+depletion+of+histone+H4+increases+homologous+recombination-mediated+genetic+instability.">Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).</li><li>Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stoichiometry+of+histone+dimer+sets+is+necessary+for+high+fidelity+of+mitotic+chromosome+transmission.">Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission.</a> Cell. 44 (1), 43-52 (1986).</li><li>Groth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Asf1+regulates+the+flow+of+S+phase+histones+during+replicational+stress.">Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress.</a> Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).</li><li>Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomes+are+assembled+by+an+acidic+protein+which+binds+histones+and+transfers+them+to+DNA.">Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA.</a> Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).</li><li>Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+shuffle:+histone+chaperones+in+an+energetic+dance.">The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).</li><li>Akey, C. W., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+and+nucleosome+assembly.">Histone chaperones and nucleosome assembly.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).</li><li>De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+An+escort+network+regulating+histone+traffic.">Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).</li><li>Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+30+years+from+isolation+to+elucidation+of+the+mechanisms+of+nucleosome+assembly+and+disassembly.">Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).</li><li>Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+largest+subunit+of+chromatin+assembly+factor+1:+importance+in+vitro+and+during+Xenopus+early+development.">Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development.</a> EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).</li><li>Ray-Gallet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIRA+is+critical+for+a+nucleosome+assembly+pathway+independent+of+DNA+synthesis.">HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).</li><li>Frehlick, L. J., Eir&#237;n-L&#243;pez, J. M., Ausi&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).</li><li>Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+NAP-1+is+a+core+histone+chaperone+that+functions+in+ATP-facilitated+assembly+of+regularly+spaced+nucleosomal+arrays.">Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).</li><li>Els&#228;sser, S. J., D'Arcy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+mechanism+for+histone+chaperones.">Towards a mechanism for histone chaperones.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).</li><li>Rodr&#237;guez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+competent+chromatin+assembled+with+exogenous+histones+in+a+yeast+whole+cell+extract.">Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract.</a> Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).</li><li>Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+chromatin+containing+recombinant+Drosophila+core+histones.">Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtt106p+is+a+histone+chaperone+involved+in+heterochromatin-mediated+silencing.">Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).</li><li>Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+chaperone+nucleophosmin+enhances+acetylation-dependent+chromatin+transcription.">Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).</li><li>Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtFKBP53:+A+chimeric+histone+chaperone+with+functional+nucleoplasmin+and+PPIase+domains.">AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains.</a> Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).</li><li>Scofield, B. T. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Electrophoresis. , (2012).</li><li>Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialysis+and+concentration+of+protein+solutions.">Dialysis and concentration of protein solutions.</a> Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).</li><li>Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+analysis+of+recombinant+importin-histone+complexes+using+analytical+ultracentrifugation.">Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation.</a> Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).</li><li>Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+current+methods+in+sedimentation+velocity+and+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2013).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-distribution+analysis+of+macromolecules+by+sedimentation+velocity+ultracentrifugation+and+Lamm+equation+modelling.">Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+Arabidopsis+thaliana+NAP1-related+protein+2+(AtNRP2)+and+comparison+with+its+homolog+AtNRP1.">Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1.</a> Molecules. 24 (12), 2258 (2019).</li><li>Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAF-1-induced+oligomerization+of+histones+H3/H4+and+mutually+exclusive+interactions+with+Asf1+guide+H3/H4+transitions+among+histone+chaperones+and+DNA.">CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).</li><li>Bowman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+chaperones+Vps75+and+Nap1+form+ring-like,+tetrameric+structures+in+solution.">The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).</li><li>Newman, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+multimeric+assemblies+of+nucleosome+assembly+protein+and+histones+revealed+by+small-angle+X-ray+scattering+and+electron+microscopy.">Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).</li><li>Edlich-Muth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pentameric+nucleoplasmin+fold+is+present+in+Drosophila+FKBP39+and+a+large+number+of+chromatin-related+proteins.">The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).</li><li>Franco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+ability+of+nucleoplasmin+to+assemble+and+chaperone+histone+octamers+for+DNA+deposition.">Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).</li><li>Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FK506-binding+protein,+Fpr4,+is+an+acidic+histone+chaperone.">The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone.</a> FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).</li><li>Graziano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hydrophobic+effect+in+the+salt-induced+dimerization+of+bovine+beta-lactoglobulin+at+pH+3.">Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3.</a> Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).</li><li>Burgess, R. J., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+in+nucleosome+assembly+and+human+disease.">Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).</li><li>Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+histone+chaperone+yeast+Asf1+in+the+assembly+and+disassembly+of+histone+H3/H4-DNA+complexes.">The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).</li><li>Avvakumov, N., Nourani, A., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+Modulators+of+chromatin+marks.">Histone chaperones: Modulators of chromatin marks.</a> Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).</li><li>Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperoning+histones+during+DNA+replication+and+repair.">Chaperoning histones during DNA replication and repair.</a> Cell. 140 (2), 183-195 (2010).</li><li>Chu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+electrostatic+interactions+in+the+association+of+intrinsically+disordered+histone+chaperone+Chz1+and+histone+H2A.Z-H2B.">Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B.</a> PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).</li><li>Heidarsson, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+proteins+enable+histone+chaperoning+on+the+nucleosome.">Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

Este trabajo demuestra y valida un conjunto completo de protocolos para la caracterización bioquímica y biofísica de una chaperona de histonas putativa. En esta invención, se utilizaron proteínas de la familia NAP expresadas y purificadas recombinantemente, AtNRP1 y AtNRP2, y el dominio de nucleoplasmina N-terminal de AtFKBP53 para demostrar los protocolos. El mismo conjunto de experimentos podría muy bien usarse para delinear los atributos funcionales de las chaperonas de histonas previamente no caracterizadas de ...

Los nucleosomas compuestos de ADN y proteínas histonas forman la unidad estructural de la cromatina y regulan varios eventos celulares críticos. Los nucleosomas se reposicionan y remodelan dinámicamente para hacer que el ADN sea accesible a diversos procesos como la replicación, la transcripción y la traducción 1,2. Las histonas que son altamente básicas tienden a interactuar con proteínas ácidas en el medio celular o sufren agregación, lo que lleva a varios defectos celulares 3,4,5. Un grupo de proteínas dedicadas llamadas chaperonas histonas ayudan al transporte de histonas desde el citoplasma hasta el núcleo y previenen eventos aberrantes de agregación histona-ADN 6,7. Fundamentalmente, la mayoría de las chaperonas de histonas almacenan y transfieren histonas al ADN con fuerza iónica fisiológica, ayudando así a la formación de nucleosomas 8,9. Algunas chaperonas de histonas tienen una preferencia definida por los oligómeros de histonas H2A/H2B o H3/H410.
Las chaperonas de histonas se caracterizan por su capacidad para ensamblar nucleosomas dependientes o independientes de la síntesis de ADN11. Por ejemplo, el factor de ensamblaje de la cromatina-1 (CAF-1) es dependiente, mientras que el regulador de histonas A (HIRA) es independiente de la síntesis de ADN12,13. Del mismo modo, la familia de nucleoplasminas de las chaperonas histonas está involucrada en la descondensación de la cromatina espermática y el ensamblaje de nucleosomas14. Los miembros de la familia de proteínas de ensamblaje de nucleosomas (NAP) facilitan la formación de estructuras similares a nucleosomas in vitro y están involucrados en el transporte de histonas entre el citoplasma y el núcleo15. Las nucleoplasminas y las proteínas de la familia NAP son chaperonas de histonas funcionales, pero no comparten ninguna característica estructural. Esencialmente, ninguna característica estructural única permite la clasificación de una proteína como una chaperona de histonas16. El uso de ensayos funcionales y biofísicos junto con estudios estructurales funcionan mejor para caracterizar las chaperonas de histonas.
Este trabajo describe métodos bioquímicos y biofísicos para caracterizar una proteína como una chaperona de histonas que ayuda al ensamblaje de nucleosomas. En primer lugar, se realizó cromatografía analítica de exclusión de tamaño para analizar el estado oligomérico y la estabilidad de las chaperonas de histonas. A continuación, se realizó un ensayo pull-down para determinar las fuerzas impulsoras y la naturaleza competitiva de las interacciones chaperona-histona de histonas. Sin embargo, los parámetros hidrodinámicos de estas interacciones no pudieron calcularse con precisión utilizando cromatografía analítica de exclusión de tamaño debido a la forma de la proteína y sus complejos que afectan su migración a través de la columna. Por lo tanto, se utilizó la ultracentrifugación analítica, que proporciona propiedades macromoleculares en solución que incluyen el peso molecular preciso, la estequiometría de interacción y la forma de las moléculas biológicas. Estudios anteriores han utilizado ampliamente el ensayo de acompañamiento de histonas in vitro para caracterizar funcionalmente las chaperonas de histonas como yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. El ensayo de acompañamiento de histonas también se utilizó para caracterizar funcionalmente las proteínas como chaperonas de histonas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>814326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>193983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25M FPLC</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Instrument for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An-60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361964</td>
			<td>Rotor for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.15444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (7 kDa cut-off)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>68700</td>
			<td>For dialysing protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ATX224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide (EtBr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12009077</td>
			<td>For imaging gels after staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704405</td>
			<td>Instrument for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683779</td>
			<td>For pipetting of micro-volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000</td>
			<td>Instrument for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>800172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano drop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For measurement of protein and DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>Resin beads for pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima AUC analytical ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B86437</td>
			<td>Instrument for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MT30130863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SD0061</td>
			<td>Plasmid for supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated high-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDFIT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDNTERP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPrep Spin Columns</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SC1000</td>
			<td>For pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.10732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topoisomerase I</td>
			<td>Inspiralis</td>
			<td>WGT102</td>
			<td>Enzyme used in plasmid supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>N&#252;ve</td>
			<td>NB 5</td>
			<td>For heat treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays

Las proteínas histonas se asocian con el ADN para formar la cromatina eucariota. La unidad básica de la cromatina es un nucleosoma, formado por un octámero de histonas que consiste en dos copias de las histonas centrales H2A, H2B, H3 y H4, envueltas por el ADN. El octámero está compuesto por dos copias de un dímero H2A/H2B y una sola copia de un tetrámero H3/H4. Las histonas centrales altamente cargadas son propensas a interacciones no específicas con varias proteínas en el citoplasma celular y el núcleo. Las chaperonas de histonas forman una clase diversa de proteínas que transportan histonas desde el citoplasma al núcleo y ayudan a su deposición en el ADN, ayudando así al proceso de ensamblaje de nucleosomas. Algunas chaperonas de histonas son específicas para H2A/H2B o H3/H4, y algunas funcionan como chaperonas para ambas. Este protocolo describe cómo las técnicas de laboratorio in vitro , como los ensayos pull-down, la cromatografía analítica de exclusión de tamaño, la ultracentrifugación analítica y el ensayo de acompañamiento de histonas, podrían usarse en conjunto para confirmar si una proteína dada es funcional como una chaperona de histonas.

El dominio nucleoplasmina N-terminal recombinante de la proteína FKBP53 de Arabidopsis thaliana se sometió a SEC analítico. El volumen pico de elución se trazó contra la curva estándar para identificar su estado oligomérico. Los resultados analíticos de la SEC revelaron que el dominio existe como un pentámero en solución, con una masa molecular aproximada de 58 kDa (Figura 1A, B). Además, el dominio de nucleoplasmina se analizó para determinar la estabil...

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In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Este protocolo describe una batería de métodos que incluye cromatografía analítica de exclusión de tamaño para estudiar la oligomerización y estabilidad de la chaperona de histonas, ensayo de extracción hacia abajo para desentrañar las interacciones chaperona-histona de histonas, AUC para analizar la estequiometría de los complejos de proteínas y ensayo de acompañamiento de histonas para caracterizar funcionalmente una chaperona de histonas putativa in vitro.

In vitro Caracterización de chaperonas de histonas mediante ensayos analíticos, pull-down y acompañantes

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Nuestro protocolo describe cómo las técnicas como los ensayos pull-down, la cromatografía analítica de exclusión de tamaño, la ultracentrifugación analítica y el ensayo de acompañamiento de histonas podrían usarse para confirmar si una proteína es una chaperona de histonas. Las técnicas cubiertas aquí, cuando se usa tándem, podrían aplicarse directamente para caracterizar a un chaperona putativo. El suyo podría ir de acuerdo con la técnica de biología estructural.Las técnicas son aplicables al campo de la investigación de la cromatina. Sin embargo, los métodos individuales podrían aplicarse a cualquier otra proteína de interés, según sea necesario. Demostrando el procedimiento estará el Sr. Surajit Gandhi, un estudiante de doctorado de mi laboratorio, para el complicado ensayo desplegable;Archana Samal, estudiante de doctorado, junto con el Sr. Ruchir C. Bobde para el experimento analítico de ultracentrifugación; el Sr. Somanath Baral, estudiante de doctorado; junto con el Sr. Ketul Saharan para el ensayo de superenrollamiento de plásmidos Primero, mezcle chaperonas de histonas de cinco micromolares con dímeros H2A / H2B de 20 micromolares en 300 microlitros de tampón de equilibrio. Centrifugar el complejo H2A/H2B de chaperona de histonas para eliminar cualquier precipitado.Cargue la muestra en la columna de espín preequilibrada con búfer de equilibrio. Lave la columna con volúmenes de 100 columnas o cuatro mililitros de tampón de lavado para eliminar el exceso de dímero H2A / H2B. A continuación, mezcle el complejo H2A/H2B de chaperona de histonas con tetrámero H3/H4 de 20 a 60 micromolares.Vuelva a lavar la columna con volúmenes de 100 columnas o cuatro mililitros de tampón de lavado para eliminar cualquier tetrámero H3/H4 no unido, luego eluya las muestras con tampón de elución. Sujete las muestras eluyentes al 18% SDS-PAGE. Luego, tiñe con Coomassie azul brillante R250 y visualiza el gel.Purificar el dímero H2A/H2B, tetrámero H3/H4 en la chaperona de histonas individualmente con el tampón de diálisis mediante cromatografía analítica de exclusión de tamaño. Guarde el tampón de la ejecución para preparar diluciones adicionales más adelante y para usarlo como referencia en la celda AUC. Para muestras de AUC, mezclar las chaperonas purificadas con dímero o tetrámero en tubos separados hasta un volumen final de 450 microlitros utilizando el tampón de diálisis guardado para alcanzar un OD280 de 0.3 a 0.6.Ensamble la celda con una pieza central de doble sector y ventanas de cuarzo provistas de una ultracentrífuga analítica con un detector de absorbancia. Llene 400 microlitros de la solución de muestra y 420 microlitros de tampón de diálisis en los sectores de referencia y muestra de la célula, respectivamente. Pese y equilibre con precisión las células y cárguelas en un rotor de titanio de cuatro orificios.Alinee las celdas utilizando las marcas en la parte inferior de las celdas y el rotor. Cargue el rotor en la centrífuga, cierre la tapa y comience la carrera, lo que permite que se desarrolle un vacío y la temperatura se estabilice. Para el análisis de los datos, calcule la densidad y viscosidad de los componentes del tampón de proteínas y el volumen específico parcial basado en la composición de aminoácidos de la proteína utilizando el programa SEDNTERP.Cargue los datos de la máquina AUC en el programa SEDFIT. Defina el menisco, la línea roja, la parte inferior de la celda, la línea azul y los límites del análisis de datos las líneas verdes. Elija Distribución continua de CS como modelo.En la sección de parámetros, establezca la resolución máxima en 100. A continuación, establezca el coeficiente de sedimentación mínimo en cero y máximo en 10 a 15. Establezca la relación de fricción en 1.2 inicialmente y opte por flotar para derivar la relación de los datos.Establezca la relación F en 0.68 para la regularización de un sigma. Establezca el volumen específico parcial, la densidad del tampón y la viscosidad obtenidos del SEDNTURP. Presione Ejecutar para permitir que el software resuelva la ecuación lam.Pulse Ajustar para refinar. Seleccione Mostrar Mw máximo en CS en la función de visualización de la barra de herramientas principal para estimar masas moleculares. Mezcle el tetrámero H3/H4 de dos micromolares y el dímero H2A/H2B de cuatro micromolares con concentraciones crecientes de chaperona de histonas, que van de uno a seis micromolares, en un tampón de ensamblaje hasta un volumen final de 50 microlitros.Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Simultáneamente, pretratar 500 nanogramos del plásmido PUC-19 superenrollado negativamente con un microgramo de enzima topoisomerasa I en el tampón de ensamblaje en un volumen final a 50 microlitros. A continuación, combine la solución premezclada que contiene tetrámero, dímero y chaperona de histonas con el ADN plasmático relajado.Agregue 100 microlitros de amortiguador de parada 2X e incube para finalizar la reacción de ensamblaje desproteinizando el ADN plásmido. Agregue un volumen igual de fenol saturado de Tris en el tubo que contiene la mezcla de reacción y mezcle bien el contenido de la mezcla de reacción. Luego, centrifuga la muestra.Recoger suavemente la fase acuosa superior que contiene el ADN plásmido con una micropipeta y mezclar un volumen igual de cloroformo. Vórtice la mezcla. A continuación, recoja la fase acuosa superior, agregue un volumen de 1/10 de acetato de sodio trimolar de pH 5.5 y 2.5 volúmenes de etanol helado.Mezcle bien la solución invirtiendo el tubo de tres a cuatro veces. Centrifugar la muestra a 16, 200 g durante 10 minutos y desechar suavemente el sobrenadante. Mantenga los tubos abiertos a temperatura ambiente hasta que incluso pequeñas cantidades de etanol se evaporen, dejando el ADN plásmido precipitado en el tubo.Los resultados analíticos de la SEC revelaron que el dominio de nucleoplasmina N-terminal recombinante de la proteína FKBP53 de Arabidopsis thaliana es un pentámero de 65 kilodaltons en solución. La muestra de nucleoplasmina sometida a tratamiento térmico mostró que el dominio es altamente termoestable. El dominio nucleoplasmina mostró estabilidad salina hasta dos molares de cloruro de sodio y estabilidad de urea hasta cuatro molares.Un ensayo pull-down reveló que la interacción del dominio nucleoplasmina con el dímero H2A/H2B era estable hasta cloruro de sodio 0,4 molar, mientras que la asociación con H3/H4 era estable hasta 0,7 molares. La chaperona se une simultáneamente al dímero H2A/H2B y al tetrámero H3/H4, independientemente del orden en que se añadan a la chaperona, lo que indica sitios de interacción separados para los oligómeros. Las masas moleculares estimadas a través del AUC-SV revelan una estequiometría 1:1 del dominio de nucleoplasmina con los oligómeros de histonas.En el ensayo de superenrollamiento de plásmidos, las chaperonas de histonas de plantas recombinantes AtNRP1 y AtNRP2 aumentaron la cantidad de plásmido superenrollado, lo que sugiere que podría depositar histonas en el ADN para formar nucleosomas, causando un súper enrollamiento del ADN. El ensayo de superenrollamiento de plásmidos necesita un cuidado especial y una posible optimización para la caracterización del ADN de histonas y chaperonas. La telemetría de caracterización isomérica se puede utilizar como seguimiento de los experimentos analíticos de exclusión de tamaño para confirmar la estabilidad de unión.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

La determinación de las especies y cuantificación de mezclas Uso de MRM espectrometría de masas de los péptidos Aplicada a la autenticación de carne

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