Name: in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays
Uploaded: 2021-12-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Hindistan Hükümeti [CRG / 2018 / 000695 / PS] ve Biyoteknoloji Bölümü, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Hindistan Hükümeti [BT / INF / 22 / SP33046 / 2019] 'dan Dileep Vasudevan'a yapılan ekstramural hibelerin yanı sıra Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Bhubaneswar'ın intramural desteği büyük ölçüde kabul edilmektedir. Bayan Sudeshna Sen ve Bayan Annapurna Sahoo'ya histon hazırlama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Meslektaşlarımız Dr. Chinmayee Mohapatra, Bay Manas Kumar Jagdev ve Dr. Shaikh Nausad Hossain ile yapılan görüşmeler de kabul edilmektedir.

1. Histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini aydınlatmak için analitik boyut dışlama kromatografisi
<ol><li>Histon şaperonların oligomerik durumunun analizi<ol><li>24 mL'lik bir analitik boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonunu 1,2 sütun hacmi (CV), yani 28,8 mL gazdan arındırılmış SEC tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-merkaptoetanol (β-ME)] ile 4 °C'de dengeleyin (bkz. NOT: Sütun tipi, tampon bileşimi ve tampon pH'ı, ilg...

<ol>
	<li>H&#252;bner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+and+transcriptional+regulation.">Chromatin organization and transcriptional regulation.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).</li><li>Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+nucleosome+dynamics+and+their+links+to+gene+expression+and+DNA+replication.">Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).</li><li>Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+histone+H4+depletion+on+the+cell+cycle+and+transcription+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).</li><li>Prado, F., Aguilera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+depletion+of+histone+H4+increases+homologous+recombination-mediated+genetic+instability.">Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).</li><li>Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stoichiometry+of+histone+dimer+sets+is+necessary+for+high+fidelity+of+mitotic+chromosome+transmission.">Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission.</a> Cell. 44 (1), 43-52 (1986).</li><li>Groth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Asf1+regulates+the+flow+of+S+phase+histones+during+replicational+stress.">Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress.</a> Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).</li><li>Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomes+are+assembled+by+an+acidic+protein+which+binds+histones+and+transfers+them+to+DNA.">Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA.</a> Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).</li><li>Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+shuffle:+histone+chaperones+in+an+energetic+dance.">The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).</li><li>Akey, C. W., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+and+nucleosome+assembly.">Histone chaperones and nucleosome assembly.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).</li><li>De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+An+escort+network+regulating+histone+traffic.">Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).</li><li>Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+30+years+from+isolation+to+elucidation+of+the+mechanisms+of+nucleosome+assembly+and+disassembly.">Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).</li><li>Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+largest+subunit+of+chromatin+assembly+factor+1:+importance+in+vitro+and+during+Xenopus+early+development.">Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development.</a> EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).</li><li>Ray-Gallet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIRA+is+critical+for+a+nucleosome+assembly+pathway+independent+of+DNA+synthesis.">HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).</li><li>Frehlick, L. J., Eir&#237;n-L&#243;pez, J. M., Ausi&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).</li><li>Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+NAP-1+is+a+core+histone+chaperone+that+functions+in+ATP-facilitated+assembly+of+regularly+spaced+nucleosomal+arrays.">Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).</li><li>Els&#228;sser, S. J., D'Arcy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+mechanism+for+histone+chaperones.">Towards a mechanism for histone chaperones.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).</li><li>Rodr&#237;guez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+competent+chromatin+assembled+with+exogenous+histones+in+a+yeast+whole+cell+extract.">Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract.</a> Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).</li><li>Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+chromatin+containing+recombinant+Drosophila+core+histones.">Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtt106p+is+a+histone+chaperone+involved+in+heterochromatin-mediated+silencing.">Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).</li><li>Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+histone+chaperone+nucleophosmin+enhances+acetylation-dependent+chromatin+transcription.">Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).</li><li>Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtFKBP53:+A+chimeric+histone+chaperone+with+functional+nucleoplasmin+and+PPIase+domains.">AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains.</a> Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).</li><li>Scofield, B. T. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Electrophoresis. , (2012).</li><li>Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dialysis+and+concentration+of+protein+solutions.">Dialysis and concentration of protein solutions.</a> Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).</li><li>Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+analysis+of+recombinant+importin-histone+complexes+using+analytical+ultracentrifugation.">Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation.</a> Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).</li><li>Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+current+methods+in+sedimentation+velocity+and+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2013).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-distribution+analysis+of+macromolecules+by+sedimentation+velocity+ultracentrifugation+and+Lamm+equation+modelling.">Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling.</a> Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+Arabidopsis+thaliana+NAP1-related+protein+2+(AtNRP2)+and+comparison+with+its+homolog+AtNRP1.">Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1.</a> Molecules. 24 (12), 2258 (2019).</li><li>Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAF-1-induced+oligomerization+of+histones+H3/H4+and+mutually+exclusive+interactions+with+Asf1+guide+H3/H4+transitions+among+histone+chaperones+and+DNA.">CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).</li><li>Bowman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+chaperones+Vps75+and+Nap1+form+ring-like,+tetrameric+structures+in+solution.">The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).</li><li>Newman, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+multimeric+assemblies+of+nucleosome+assembly+protein+and+histones+revealed+by+small-angle+X-ray+scattering+and+electron+microscopy.">Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).</li><li>Edlich-Muth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pentameric+nucleoplasmin+fold+is+present+in+Drosophila+FKBP39+and+a+large+number+of+chromatin-related+proteins.">The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).</li><li>Franco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+ability+of+nucleoplasmin+to+assemble+and+chaperone+histone+octamers+for+DNA+deposition.">Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).</li><li>Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FK506-binding+protein,+Fpr4,+is+an+acidic+histone+chaperone.">The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone.</a> FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).</li><li>Graziano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hydrophobic+effect+in+the+salt-induced+dimerization+of+bovine+beta-lactoglobulin+at+pH+3.">Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3.</a> Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).</li><li>Burgess, R. J., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones+in+nucleosome+assembly+and+human+disease.">Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).</li><li>Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+of+the+histone+chaperone+yeast+Asf1+in+the+assembly+and+disassembly+of+histone+H3/H4-DNA+complexes.">The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).</li><li>Avvakumov, N., Nourani, A., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+chaperones:+Modulators+of+chromatin+marks.">Histone chaperones: Modulators of chromatin marks.</a> Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).</li><li>Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperoning+histones+during+DNA+replication+and+repair.">Chaperoning histones during DNA replication and repair.</a> Cell. 140 (2), 183-195 (2010).</li><li>Chu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+electrostatic+interactions+in+the+association+of+intrinsically+disordered+histone+chaperone+Chz1+and+histone+H2A.Z-H2B.">Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B.</a> PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).</li><li>Heidarsson, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+proteins+enable+histone+chaperoning+on+the+nucleosome.">Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

Bu çalışma, varsayılan bir histon şaperonun biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu için kapsamlı bir protokol setini göstermekte ve doğrulamaktadır. Burada, protokolleri göstermek için rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan NAP ailesi proteinleri, AtNRP1 ve AtNRP2 ve AtFKBP53'ün N-terminal nükleoplazman alanı kullanılmıştır. Aynı deney seti, herhangi bir organizmadan daha önce karakterize edilmemiş histon şaperonların fonksiyonel özelliklerini tanımlamak için çok iyi kul...

DNA ve histon proteinlerinden oluşan nükleozomlar, kromatinin yapısal birimini oluşturur ve birkaç kritik hücresel olayı düzenler. Nükleozomlar, DNA'yı replikasyon, transkripsiyon ve çeviri 1,2 gibi çeşitli süreçlere erişilebilir kılmak için dinamik olarak yeniden konumlandırılır ve yeniden şekillendirilir. Son derece bazik olan histonlar ya hücresel ortamdaki asidik proteinlerle etkileşime girme eğilimindedir ya da kümelenmeye uğrar, böylece çeşitli hücresel kusurlara yol açar 3,4,5. Histon şaperonları adı verilen bir grup özel protein, histonların sitoplazmadan çekirdeğe taşınmasına yardımcı olur ve anormal histon-DNA agregasyon olaylarını önler 6,7. Temel olarak, çoğu histon şaperonu, histonları fizyolojik iyonik güçte DNA üzerine depolar ve aktarır, böylece nükleozomların oluşumuna yardımcı olur 8,9. Bazı histon şaperonların histon oligomerleri H2A/H2B veya H3/H410 için kesin bir tercihi vardır.
Histon şaperonları, DNA sentezine bağımlı veya bağımsız nükleozomları birleştirme yeteneklerine dayanarak karakterize edilir11. Örneğin, kromatin montaj faktörü-1 (CAF-1) bağımlıyken, histon regülatörü A (HIRA) DNA sentezi 12,13'ten bağımsızdır. Benzer şekilde, histon şaperonların nükleoplazman ailesi, sperm kromatin dekondensasyonu ve nükleozom montajı14'te rol oynar. Nükleozom montaj proteini (NAP) ailesi üyeleri, in vitro nükleozom benzeri yapıların oluşumunu kolaylaştırır ve sitoplazma ile çekirdek15 arasındaki histonların kesilmesinde rol oynar. Nükleoplazminler ve NAP ailesi proteinlerin her ikisi de fonksiyonel histon şaperonlarıdır, ancak herhangi bir yapısal özelliği paylaşmaz. Temel olarak, tek bir yapısal özellik, bir proteinin histon şaperon16 olarak sınıflandırılmasına izin vermez. Fonksiyonel ve biyofiziksel testlerin yapısal çalışmalarla birlikte kullanımı, histon şaperonları karakterize etmede en iyi sonucu verir.
Bu çalışma, bir proteini nükleozom montajına yardımcı olan bir histon şaperonu olarak karakterize etmek için biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemleri açıklamaktadır. İlk olarak, histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini analiz etmek için analitik boyut dışlama kromatografisi yapıldı. Daha sonra, histon şaperon-histon etkileşimlerinin itici güçlerini ve rekabetçi doğasını belirlemek için bir pull-down testi yapıldı. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin hidrodinamik parametreleri, proteinin şekli ve kolon boyunca göçlerini etkileyen kompleksleri nedeniyle analitik boyut dışlama kromatografisi kullanılarak doğru bir şekilde hesaplanamamıştır. Bu nedenle, doğru moleküler ağırlık, etkileşimin stokiyometrisi ve biyolojik moleküllerin şeklini içeren çözelti içi makromoleküler özellikler sağlayan analitik ultrasantrifüjleme kullanılmıştır. Geçmiş çalışmalar, yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120 gibi histon şaperonları fonksiyonel olarak karakterize etmek için in vitro histon chaperoning testini yaygın olarak kullanmıştır. Histon chaperoning testi, proteinleri histon şaperonlar olarak fonksiyonel olarak karakterize etmek için de kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>814326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>193983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25M FPLC</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Instrument for protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>An-60Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361964</td>
			<td>Rotor for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.15444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing (7 kDa cut-off)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>68700</td>
			<td>For dialysing protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>100597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>ATX224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide (EtBr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12009077</td>
			<td>For imaging gels after staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704405</td>
			<td>Instrument for agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683779</td>
			<td>For pipetting of micro-volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000</td>
			<td>Instrument for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>800172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano drop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>For measurement of protein and DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R901-15</td>
			<td>Resin beads for pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima AUC analytical ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B86437</td>
			<td>Instrument for analytical ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MT30130863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SD0061</td>
			<td>Plasmid for supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated high-speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDFIT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEDNTERP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPrep Spin Columns</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SC1000</td>
			<td>For pull-down assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 Increase 10/300 GL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29148721</td>
			<td>Column for analytical size-exclusion chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.10732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topoisomerase I</td>
			<td>Inspiralis</td>
			<td>WGT102</td>
			<td>Enzyme used in plasmid supercoiling assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>191450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>N&#252;ve</td>
			<td>NB 5</td>
			<td>For heat treatment of protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (&#946;-ME)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays

Histon proteinleri, ökaryotik kromatini oluşturmak için DNA ile birleşir. Kromatinin temel birimi, DNA tarafından sarılmış çekirdek histonları H2A, H2B, H3 ve H4'ün iki kopyasından oluşan bir histon oktamerden oluşan bir nükleozomdur. Oktamer, bir H2A / H2B dimerinin iki kopyasından ve bir H3 / H4 tetramerinin tek bir kopyasından oluşur. Yüksek yüklü çekirdek histonları, hücresel sitoplazma ve çekirdekteki çeşitli proteinlerle spesifik olmayan etkileşimlere eğilimlidir. Histon şaperonları, histonlardan çekirdeğe histonları taşıyan ve DNA üzerinde birikmelerine yardımcı olan, böylece nükleozom montaj sürecine yardımcı olan çeşitli bir protein sınıfı oluşturur. Bazı histon şaperonları H2A / H2B veya H3 / H4 için spesifiktir ve bazıları her ikisi için de şaperon olarak işlev görür. Bu protokol, pull-down testleri, analitik boyut dışlama kromatografisi, analitik ultra santrifüjleme ve histon chaperoning testi gibi in vitro laboratuvar tekniklerinin, belirli bir proteinin histon şaperonu olarak işlevsel olup olmadığını doğrulamak için birlikte nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.

Arabidopsis thaliana'dan FKBP53 proteininin rekombinant N-terminal nükleoplazmin alanı analitik SEC'e tabi tutuldu. Elüsyon tepe hacmi, oligomerik durumunu tanımlamak için standart eğriye karşı çizildi. Analitik SEC sonuçları, alanın çözelti içinde yaklaşık 58 kDa'lık bir moleküler kütleye sahip bir pentamer olarak var olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 1A, B). Ayrıca, nükleoplazmin alanı, analitik SEC ile birlikte termal ve kimyasal stabilit...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays at JoVE.com

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC'yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.

İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Protokolümüz, bir proteinin histon şaperon olup olmadığını doğrulamak için pull-down tahlilleri analitik boyut dışlama kromatografisi, analitik ultra santrifüjleme ve histon chaperoning testi gibi tekniklerin nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Burada ele alınan teknikler, tandem kullanıldığında, varsayılan bir şaperonu karakterize etmek için doğrudan uygulanabilir. yapısal biyoloji tekniği ile birlikte gidebilirdi.Teknikler kromatin araştırması alanına uygulanabilir. Bununla birlikte, bireysel yöntemler, gerektiği gibi, ilgilenilen diğer proteinlere uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Bay Surajit Gandhi, karmaşık pull-down testi için; Bayan olacak.Doktora öğrencisi Archana Samal, analitik ultra santrifüjleme deneyi için Bay Ruchir C.Bobde ile birlikte; Doktora öğrencisi Bay Somanath Baral; plazmid süper sarmal testi için Bay Ketul Saharan ile birlikte İlk olarak, beş mikromolar histon şaperonları 300 mikrolitre denge tamponunda 20 mikromolar H2A / H2B dimerlerle karıştırın. Herhangi bir çökeltiyi gidermek için histon şaperon H2A / H2B kompleksini santrifüj edin.Numuneyi, denge arabelleği ile önceden dengelenmiş spin sütununa yükleyin. Fazla H2A/H2B dimerini gidermek için kolonu 100 kolon hacmi veya dört mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Daha sonra, histon şaperon H2A / H2B kompleksini 20 ila 60 mikromolar H3 / H4 tetramer ile karıştırın.Kolonu 100 kolon hacmi veya dört mililitre yıkama tamponu ile yeniden yıkayarak bağlanmamış H3/H4 tetramerini çıkarın, ardından numuneleri elüsyon tamponu ile süzün. Salınan örnekleri %18 SDS-PAGE'e tabi tutun. Ardından, Coomassie parlak mavi R250 ile lekeleyin ve jeli görselleştirin.Histon şaperondaki H2A/H2B dimer, H3/H4 tetramerini analitik boyut dışlama kromatografisini kullanarak diyaliz tamponu ile ayrı ayrı saflaştırın. Daha sonra daha fazla seyreltme hazırlamak ve AUC hücresinde referans olarak kullanmak için arabelleği çalıştırmadan kaydedin. AUC numuneleri için, saflaştırılmış şaperonları ayrı tüplerde dimer veya tetramer ile karıştırarak kaydedilen diyaliz tamponunu kullanarak 0,3 ila 0,6 OD280'e ulaşmak için 450 mikrolitrelik son hacme kadar karıştırın.Hücreyi, absorbans dedektörlü analitik bir ultra santrifüj ile donatılmış çift sektörlü bir merkez parçası ve kuvars pencerelerle birleştirin. Sırasıyla 400 mikrolitre numune çözeltisini ve 420 mikrolitre diyaliz tamponunu hücrenin referans ve numune sektörlerine doldurun. Hücreleri tartın ve doğru şekilde dengeleyin ve dört delikli titanyum rotora yükleyin.Hücrelerin ve rotorun altındaki işaretleri kullanarak hücreleri hizalayın. Rotoru santrifüje yükleyin, kapağı kapatın ve bir vakumun gelişmesine ve sıcaklığın dengelenmesine izin veren çalıştırmayı başlatın. Veri analizi için, SEDNTERP programını kullanarak proteinin tampon bileşenlerinin yoğunluğunu ve viskozitesini ve proteinin amino asit bileşimine dayanan kısmi spesifik hacmi hesaplayın.Verileri AUC makinesinden SEDFIT programına yükleyin. Menisküs, kırmızı çizgi, hücre altı, mavi çizgi ve veri analizi sınırları yeşil çizgileri tanımlayın. Model olarak Sürekli CS dağıtımı'nı seçin.Parametreler bölümünde, çözünürlüğü en fazla 100'e kadar ayarlayın. Ardından, çökeltme katsayısını minimum sıfıra ve maksimum 10 ila 15'e ayarlayın. Sürtünme oranını başlangıçta 1,2 olarak ayarlayın ve oranın verilerden türetilmesi için kaydırmayı tercih edin.Bir sigma düzenlileştirmesi için F oranını 0,68 olarak ayarlayın. SEDNTURP'tan elde edilen kısmi spesifik hacmi, tampon yoğunluğunu ve viskoziteyi ayarlayın. Yazılımın lam denklemini çözmesine izin vermek için Çalıştır'a basın.Hassaslaştırmak için Sığdır'a basın. Moleküler kütleleri tahmin etmek için ana araç çubuğunun görüntüleme işlevinde CS'de Peak Mw'yi Göster'i seçin. İki mikromolar H3/H4 tetramer ve dört mikromolar H2A/H2B dimerini, bir ila altı mikromolar arasında değişen artan histon şaperon konsantrasyonları ile bir montaj tamponunda 50 mikrolitrelik son hacme kadar karıştırın.Karışımı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Aynı zamanda, negatif süper sarmal PUC-19 plazmidinin 500 nanogramını, montaj tamponunda bir mikrogram topoizomeraz I enzimi ile 50 mikrolitrede son bir hacimde ön işlemden geçirin. Daha sonra, tetramer, dimer ve histon şaperon içeren önceden karıştırılmış çözeltiyi gevşemiş plazma DNA'sı ile birleştirin.100 mikrolitre 2X durdurma tamponu ekleyin ve plazmid DNA'sını deproteinize ederek montaj reaksiyonunu sonlandırmak için inkübe edin. Reaksiyon karışımını içeren tüpe eşit miktarda Tris doymuş fenol ekleyin ve reaksiyon karışımının içeriğini iyice karıştırın. Ardından, numuneyi santrifüj edin.Plazmid DNA'sını içeren üst sulu fazı bir mikropipetle nazikçe toplayın ve eşit miktarda kloroform karıştırın. Karışımı vorteks. Daha sonra, üst sulu fazı toplayın, 1/10 hacimli üç molar sodyum asetat pH 5.5 ve 2.5 hacim buz gibi soğuk etanol ekleyin.Tüpü üç ila dört kez ters çevirerek çözeltiyi iyice karıştırın. Numuneyi 10 dakika boyunca 16, 200 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı yavaşça atın. Tüpleri, eser miktarda etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında açık tutun ve çökelmiş plazmid DNA'sını tüpte bırakın.Analitik SEC sonuçları, Arabidopsis thaliana proteini FKBP53'ün rekombinant N-terminal nükleoplazman alanının, çözelti içinde 65 kilodaltonluk bir pentamer olduğunu ortaya koymuştur. Isıl işleme tabi tutulan nükleoplazmin örneği, alanın oldukça ısıl stabil olduğunu göstermiştir. Nükleoplazmin alanı, iki azı dişine kadar sodyum klorür tuz stabilitesi ve dört azı dişine kadar üre stabilitesi göstermiştir.Bir pull-down testi, nükleoplazman alanının H2A / H2B dimer ile etkileşiminin 0.4-molar sodyum klorüre kadar stabil olduğunu, H3 / H4 ile ilişkinin ise 0.7 molara kadar stabil olduğunu ortaya koymuştur. Şaperon, H2A / H2B dimer ve H3 / H4 tetramerini, şaperona eklenme sırasına bakılmaksızın, oligomerler için ayrı etkileşim bölgeleri göstererek aynı anda bağlar. AUC-SV yoluyla tahmin edilen moleküler kütleler, histon oligomerleri ile nükleoplazmazmin alanının 1: 1 stokiyometrisini ortaya koymaktadır.Plazmid süper sarmal testinde, rekombinant bitki histon şaperonları AtNRP1 ve AtNRP2, süper sarmal plazmid miktarını arttırdı, bu da nükleozomları oluşturmak için DNA üzerine histonlar biriktirebileceğini ve DNA süper sarmalına neden olabileceğini düşündürdü. Plazmid süper sarmal testi, histon DNA ve şaperon karakterizasyonu için özel dikkat ve olası optimizasyona ihtiyaç duyar. İzomerik karakterizasyon telemetrisi, bağlanma kararlılığını doğrulamak için analitik boyut dışlama deneylerinin bir takibi olarak kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication

Et kimlik doğrulaması için peptidler Uygulanan MRM Kütle Spektrometresi kullanarak karışımlar türlerin belirlenmesi ve miktar tayini

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ring Tipi E3 Ubiquitin Ligases In Vitro ve Planta Fonksiyonel Karakterizasyonu

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

İn vitro Floresan Mikroskopi Bazlı Hareketlilik Testlerinin Miyosin'e Özgü Uyarlamaları

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...