Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

يشكر المؤلفون جميع أعضاء مختبرات Green و Pardee و Pena وكذلك جميع المؤلفين المشاركين للمخطوطات السابقة المتعلقة بالعمل الذي تم الكشف عنه في هذه المخطوطة. تم دعم S.J.R.D.S. من خلال زمالة الدكتوراه برعاية مؤسسة العلوم والتكنولوجيا في بيرنامبوكو (FACEPE) ، البرازيل ، الرقم المرجعي IBPG-1321-2.12 / 18 ، ويتم دعمه حاليا من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه برعاية جامعة تورنتو ، كندا. P.B. مدعوم بجائزة William Knapp Buckley من كلية الصيدلة بجامعة تورنتو. تم دعم M.K. من قبل مبادرة الطب الدقيق (PRiME) في رقم الزمالة الداخلية بجامعة تورنتو PRMF2019-002. تم دعم هذا العمل من خلال أموال إلى K.P من برنامج كراسي البحث الكندية (الملفات 950-231075 و 950-233107) ، وصندوق إدارة المشاريع البحثية الرئيسية بجامعة تورنتو ، وبرنامج منح مؤسسة CIHR (201610FDN-375469) ، و LP و A.A.G. و K.P من خلال منحة فريق CIHR / IDRC: برنامج فيروس زيكا الكندي اللاتيني / الأمريكي الكاريبي (FRN: 149783) ، وكذلك عن طريق الأموال المقدمة إلى K.P. من مركز أبحاث التنمية الدولية الكندي (المنحة 109434-001) من خلال فرصة التمويل السريع للبحوث الكندية لعام 2019 لفيروس كورونا الجديد (COVID-19). تم دعم هذا العمل أيضا بأموال إلى A.A.G. من جائزة الباحث الجديد للجنة البحوث الطبية الحيوية في أريزونا (ADHS16-162400) ، ومؤسسة غيتس (OPP1160667) ، وجائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية للصحة (1DP2GM126892) ، وجائزة NIH R21 (1R21AI136571-01A1) إلى K.P./A.A.G ، وزمالة Alfred P. Sloan (FG-2017-9108). تم إنشاء الشكل 1 مع Biorender.com بموجب ترخيص أكاديمي ل K.P.

<ol>
	<li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world.">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, 73-79 (2006).</li><li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+diagnostics+for+global+health.">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil.">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+Early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis.">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li><li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants.">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li><li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor.">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).</li><li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment.">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li><li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors.">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li><li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics.">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li><li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection.">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li><li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter.">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR&#946;-specific+endocrine+disruptors.">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTR&#946;-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine:+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach.">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li><li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors.">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li><li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis.">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li><li>Gr&#228;we, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper-based,+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs.">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).</li><li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toehold+Switches:+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression.">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li><li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics:+a+critical+review.">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li><li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification.">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers.">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li><li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples.">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li><li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information.">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li><li>. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022)</li><li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+(NASBA).">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li><li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization.">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).</li><li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+automated+DNA+assembly:+Best+practices,+metrics,+and+protocols+using+robots.">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).</li><li>Silva, S. J. R., de Magalh&#227;es, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+circulation+of+DENV,+CHIKV,+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil:+An+inconvenient+truth.">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205 (2021).</li><li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso.">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li><li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts.">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).</li><li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+(RT-LAMP)+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil.">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li></ol>

K.P. و A.A.G. هما مخترعان مشاركان للتقنيات المتعلقة بمستشعر إصبع القدم الورقي. Y.G.، S.C.، و K.P. هم مؤسسون مشاركون لشركة LSK Technologies، Inc. وهم مخترعون مشاركون للتقنيات المتعلقة ب PLUM. M.K. ، K.P. و A.A.G. هم مؤسسون مشاركون لشركة En Carta Diagnostics Ltd. المؤلفون الآخرون ليس لديهم تضارب في المصالح. براءات الاختراع: جهاز البرقوق: Y.G.، S.C.، و K.P. تم تقديم طلب براءة الاختراع من قبل جامعة تورنتو وتم تعيينه لشركة LSK Technologies Inc. طلب براءة الاختراع المؤقت الأمريكي رقم 62/982,323 المقدم في 27 فبراير 2020 ؛ براءة اختراع تبديل Toehold: A.A.G. ، P.Y. ، و J.J. C. "تركيبات Riboregulator وطرق الاستخدام" ، براءة اختراع. WO2014074648A3 قدم في 6 نوفمبر 2012 ؛ براءة اختراع تشخيصية ورقية: K.P. و J.J.C. "Paper-based genetic genetic networks" براءة اختراع أمريكية معلقة رقم. US15/963,831 تم إيداعه في 6 ديسمبر 2013; براءة اختراع زيكا 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., و J.J.C., "منصة محمولة منخفضة التكلفة للكشف عن الفيروسات وتحديد الإجهادات," U. S. Temporary Patent Request No. 62/403,778 المودع في 4 أكتوبر 2016; براءة اختراع زيكا 2: K.P.، A.G.، M.K.T.، D.B.، G.L.، T.F.، و J.J.C.، "منصة محمولة ومنخفضة التكلفة للكشف عن الفيروسات وتحديد الإجهاد" ، طلب براءة الاختراع المؤقت للولايات المتحدة رقم 62/341,221 المقدم في 25 مايو 2016.

يمكن للنظام الورقي المدمج الموصوف هنا أن يجلب التشخيص الجزيئي ذي الصلة سريريا ، مع أداء يمكن مقارنته وظيفيا ب RT-qPCR ، إلى نقطة الحاجة6. الأهم من ذلك ، بالنسبة للإعدادات عن بعد ، يمكن أن يؤدي توفر التشخيصات في الموقع إلى تقليل الوقت اللازم للنتائج من أيام إلى ساعات. تسليط الضوء على قابلية برمجة هذا النهج ، يمكن استخدام خط الأنابيب الذي تم وصفه للكشف عن أي هدف ممرض تقريبا. لقد قمنا بإقران الأدوات الجزيئية بقارئ لوحات محمول مصمم لهذا الغرض ، وهو مضغوط ومتوافق مع تشغيل البطارية (8-9 ساعات) ويوفر تحليلا للبيانات على متن الطائرة لتمكين التطبيقات الموزعة. في أعمال أخرى ، قمنا بالتحقق من صحة الأجهزة المدمجة ومنصة تشخيص فيروس زيكا مع 268 عينة من المرضى ، بالتوازي مع RT-qPCR ، ووجدنا دقة تشخيصية تبلغ 98.5٪ 24. هدفنا مجتمعة هو تمكين نقل التكنولوجيا لهذه المنصة إلى الباحثين بحيث يمكن إعادة توظيفها وتحسينها من قبل المجتمع لتلبية الاحتياجات التشخيصية غير الملباة.
تم دمج عملية تصميم مفتاح إصبع القدم في السيليكو وأتمتتها في خط أنابيب يمكن تقسيمه إلى ثلاث مراحل. تولد المرحلة الأولى مجموعة من تصميمات مفاتيح تثبيت القدم التي تهجن إلى التسلسل المستهدف بزيادات واحدة في النوكليوتيدات. تفحص المرحلة الثانية الهيكل الثانوي وتوافر مفتاح تثبيت القدم وتزيل المستشعرات ذات كودونات التوقف المبكر داخل الإطار. ثم يتم تنفيذ وظيفة التسجيل التي تأخذ في الاعتبار عوامل متعددة (على سبيل المثال ، مستوى العيب في مفتاح تثبيت إصبع القدم ، وتوافر مفتاح تثبيت القدم ، وإمكانية الوصول إلى الموقع المستهدف) لتحديد تصميمات مفتاح تثبيت إصبع القدم الأعلى بناء على الدرجات الإجمالية. في المرحلة النهائية ، يتم إنشاء قائمة بالتسلسلات لتصميمات مفتاح إصبع القدم العلوي ومشغلات الهدف المقابلة لها. يجب فحص تسلسلات أجهزة الاستشعار العلوية للتأكد من خصوصيتها مقابل النسخ البشري والجينومات الفيروسية ذات الصلة الوثيقة باستخدام NCBI / Primer-BLAST25. ومن أفضل الممارسات أيضا فحص المواقع المستهدفة لأجهزة الاستشعار لحفظ التسلسل في جينوم فيروس زيكا للتأكد من أن أجهزة الاستشعار ستوفر كشفا واسعا وقويا. تم تطوير عدة إصدارات من برنامج تصميم مفتاح تثبيت القدم وتسمح خوارزمية التصميم للمستخدمين بإنشاء نسختين ، إما السلسلة A 6 أو مفاتيح تثبيت إصبع القدممن السلسلة B6. في هذه المقالة ، كان التركيز على تصميم مفتاح إصبع القدم من السلسلة B.
بعد تخليق الحمض النووي التجاري ، يمكن تجميع مفاتيح إصبع القدم بسرعة ، ثم اختبارها عن طريق إجراء فحص أولي مقابل تسلسل الزناد المستهدف الاصطناعي الذي يتوافق مع مناطق قصيرة (200-300 nt) من الجينوم المستهدف. لفحص أداء المستشعرات القائمة على مفتاح تثبيت أصابع القدم ، من المثالي إضافة التسلسل المستهدف في شكل الحمض النووي الريبي. في هذه المقالة ، تم تحديد الخطوات المطلوبة لإضافة الحمض النووي الريبي المشغل المنسوخ في المختبر . ومع ذلك ، إذا كان ذلك متاحا ، يمكن استخدام قوالب الجينوم كاملة الطول مثل مستخلصات الحمض النووي الريبي الفيروسي الكمي أو جينومات أو معايير الحمض النووي الريبي الاصطناعية التجارية. يعد استخدام جينومات الحمض النووي الريبي كاملة الطول لفحص مفتاح إصبع القدم الأولي مفيدا لأنه يمكن أن يوضح ما إذا كانت العوامل الإضافية ، مثل البنية الثانوية للحمض النووي الريبي ، ستؤثر على أداء المستشعر. لتحسين نسبة التشغيل / الإيقاف للمفاتيح المرشحة ، يمكن معايرة الحمض النووي لمفتاح إصبع القدم في التفاعل الخالي من الخلايا. يمكن أن تعمل هذه الخطوة أيضا على تحديد مفاتيح تثبيت القدم عالية الأداء (تضخيم الطي ، أو نسبة تشغيل / إيقاف عالية) وحذف مفاتيح تثبيت القدم المتسربة (إشارة عالية في حالة عدم وجود الحمض النووي الريبي المستهدف) من خطوات توصيف المصب.
لتحسين حد الكشف عن مرشحي تبديل أصابع القدم الأفضل أداء ، يتم استخدام NASBA لزيادة التركيزات ذات الصلة سريريا من الحمض النووي الريبي الفيروسي Zika المستهدف إلى مستوى يمكن اكتشافه بواسطة مفاتيح إصبع القدم6. يتم فحص مجموعات مختلفة من مجموعات التمهيدي الأمامية والخلفية لتحديد أفضل مجموعات مفاتيح NASBA التمهيدي ومفاتيح تثبيت أصابع القدم لتمكين الكشف عند التركيزات ذات الصلة سريريا. بمجرد تحديد مجموعة التمهيدي المثالية ومجموعة مفاتيح تثبيت القدم ، يتم نقل الفحص إلى التحقق السريري. من المهم ملاحظة أن مفتاح تثبيت القدم ومراحل فحص NASBA يمكن أن تكون كثيفة العمالة والموارد ، وبالتالي فإن تطوير الاختبار هو الأنسب لمواقع البحث ذات الموارد الجيدة. على الرغم من أننا لم نطبق أتمتة العمليات ، فمن المحتمل أن يؤدي ذلك إلى تسريع دورة التصميم والبناء والاختبار التكرارية32. لحسن الحظ ، يمكن أن يكون وقت الاستجابة من تصميم المستشعر واختباره إلى النشر قصيرا بشكل ملحوظ (أقل من أسبوع) ، مما يجعل هذه الاستراتيجية مثالية للمواقف الحرجة من حيث الوقت ، مثل تفشي الأوبئة6.
حتى بعد تطوير جهاز استشعار حيوي ذو حساسية ذات صلة سريريا ، هناك تحديات تقنية تحتاج إلى معالجة. نظرا لأن هذا البروتوكول يتضمن التشغيل اليدوي وهو إجراء متعدد الخطوات ، فهناك خطر التلوث المتبادل بين العينات. نحن نبذل قصارى جهدنا للحد من هذا الخطر من خلال الممارسة المعملية الدقيقة. في تجربة سريرية حديثة ل 268 عينة من المرضى ، لم نواجه أي مشاكل في التلوث. ومع ذلك ، فهو اعتبار مهم24. مع وضع ذلك في الاعتبار ، يظل البروتوكول مقايسة مختبرية ويتطلب مستخدما ماهرا يتقن تقنيات البيولوجيا الجزيئية المناسبة. هناك اعتبار إضافي للنشر وهو عزل الحمض النووي الريبي من عينات المرضى. هنا نصف عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات استخراج الحمض النووي القائمة على العمود. ومع ذلك ، في أعمال أخرى ، أظهرنا طريقة تحلل الغليان الفعالة والبسيطة (95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة) لمعالجة عينات المرضى منخفضة العبء6. تقضي هذه الاستراتيجية تقريبا على التكلفة المرتبطة باستخراج الحمض النووي الريبي وتتجنب استخدام مجموعات استخراج الحمض النووي القائمة على العمود ، والتي يمكن أن تشكل تحديا لوجستيا في البيئات منخفضة الموارد أو مشكلات سلسلة التوريد أثناء الأزمات ، مثل جائحة COVID-1933.
كما رأينا خلال جائحة COVID-19 ، يمكن أن تكون الأدوات المستخدمة لإجراء RT-qPCR نفسها بمثابة عنق الزجاجة وتحد من وصول المريض إلى الاختبار. يؤدي هذا العامل ، وهو أيضا مالي إلى حد كبير ، إلى وضع اختبار مركزي يمكن أن يحد من الوصول إلى التشخيص. فعلى سبيل المثال، خلال فاشية زيكا في 2015/2016، لم يكن هناك سوى خمسة مختبرات مرجعية وطنية متاحة في البرازيل، مما تسبب في تأخير اختبار المرضى. دون النظر في الفائدة المحتملة من وفورات الحجم ، فإن التكلفة الحالية للسلع لقارئ اللوحات المحمولة هي ~ 500 دولار أمريكي ، والتي حتى لو زادت خمسة أضعاف لحساب العمالة والهامش التجاري ، لا تزال توفر أداة ميسورة التكلفة. يقارن هذا جيدا بأدوات RT-qPCR التي تتراوح تكلفتها من 15,000 دولار إلى 90,000 دولار أمريكي34 دولارا أمريكيا. علاوة على ذلك ، تبلغ التكلفة المقدرة لكل اختبار للاختبار الخالي من الخلايا في أمريكا اللاتينية حوالي 5.48 دولارا أمريكيا ، في حين أن تكلفة اختبار RT-qPCR في البرازيل كانت ~ 10-11 دولارا أمريكيا في وقت تفشي زيكا36. بالإضافة إلى تكلفة المعدات ، فإن قارئ الألواح المحمول له بصمة صغيرة (20 سم3) ، وتحليل تلقائي ، وتحميل البيانات إلى السحابة عبر الإنترنت ، ويمكن تشغيله على طاقة البطارية. تعمل هذه الميزات على توسيع الإعدادات المحتملة بشكل كبير حيث يمكن نشر الاختبار وتوسع في الوقت نفسه عدد المرضى الذين يمكن خدمتهم.
حتى الآن ، فإن منصات E. coli CFPS التجارية الأكثر شيوعا هي أنظمة S30 و PURE37. ومع ذلك، فإن أحد الاعتبارات الرئيسية في تحسين فرص الحصول على وسائل التشخيص في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل هو التوافر المحلي المحدود لهذه الكواشف. خطوة مهمة نحو حل هذا التحدي هي تطوير إنتاج CFPS المحلي. حقق مختبر Federici مؤخرا تقدما كبيرا نحو تطوير منصة غير تجارية لتنفيذ أجهزة استشعار قائمة على مفتاح تثبيت القدم في الأنظمة الخالية من الخلايا القائمة على المحللة ، حيث وصلت إلى 2.7 fM LOD مع فيروس زيكا RNA14. لا يسمح هذا الإنجاز فقط بصنع الكواشف في بلد الاستخدام ، وتجنب التعريفات الجمركية على الواردات والتأخير ، ولكن تكاليف العمالة تتدرج أيضا إلى المعدلات المحلية وبالتالي يمكن تخفيض التكلفة الإجمالية بشكل كبير. في العمل الذي حددته مجموعة Federici ، كانت تكلفة إنتاج تفاعل تعبير CFPS (5 ميكرولتر) في تشيلي 6.9 سنتا (دولارا أمريكيا)35,38 ، مما يوفر حافزا مزدوجا (تحسين الخدمات اللوجستية والتكلفة) لتنفيذ الأنظمة القائمة على المحللين 35,38.
ويمكن أن يحقق وضع الاختبار المقارن بتفاعل البوليميراز المتسلسل بالتحليل العكسي في شبكات التشخيص الموزعة مزايا كبيرة مقارنة بالممارسات الحالية التي تعتمد على نقل العينات إلى مرافق مركزية للتفاعل متعدد التسلسلات بالتفاعل مع تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتكرار. وفي المناطق المحيطة بالمدن، حيث تتركز حالات زيكا، تؤدي المسافة المادية بين المريض ومرفق التشخيص إلى إبطاء التشخيص وزيادة خطر عدم وصول النتائج إلى المريض في الوقت المناسب سريريا. ويحدونا الأمل في أن يسهم العمل المقدم هنا في تمكين مجتمع البحوث، من خلال نقل المعرفة، من إنشاء تكنولوجيات حيوية لا مركزية وأجهزة محمولة لصحة الإنسان والزراعة والرصد البيئي.

ظل RT-qPCR التكنولوجيا القياسية الذهبية للتشخيص السريري نظرا لحساسيته وخصوصيته الممتازة. على الرغم من قوتها العالية ، إلا أن الطريقة تعتمد على معدات وكواشف باهظة الثمن ومتخصصة تتطلب توزيعا وتخزينا يتم التحكم في درجة حرارتهما. وهذا يشكل حواجز كبيرة أمام إمكانية الوصول إلى وسائل التشخيص الجيدة على الصعيد العالمي، لا سيما في أوقات تفشي الأمراض وفي المناطق التي يكون فيها الوصول إلى المختبرات المجهزة تجهيزا جيدا محدودا 1,2. وقد لوحظ ذلك خلال فاشية فيروس زيكا 2015/2016 في البرازيل. مع توفر خمسة مختبرات مركزية فقط لتوفير اختبار RT-qPCR ، نتج عن ذلك اختناقات كبيرة ، مما حد من الوصول إلى التشخيص. كان هذا تحديا خاصا للأفراد في المناطق شبه الحضرية ، الذين تأثروا بشدة بالفاشية 3,4. في محاولة لتحسين الوصول إلى التشخيصات ، يظهر البروتوكول منصة تم تطويرها مع إمكانية توفير تشخيصات لامركزية ومنخفضة التكلفة وعالية السعة في البيئات منخفضة الموارد. كجزء من هذا ، تم إنشاء خط أنابيب اكتشاف تشخيصي ، يقترن بالتضخيم متساوي الحرارة وأجهزة استشعار اصطناعية قائمة على مفتاح الحمض النووي الريبي مع أنظمة التعبير الخالية من الخلايا الورقية 5,6.
تعد أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) ، ولا سيما الأنظمة الخالية من الخلايا القائمة على الإشريكية القولونية ، منصة جذابة لمجموعة واسعة من تطبيقات الاستشعار الحيوي من المراقبة البيئية 7,8 إلى تشخيص مسببات الأمراض5،6،9،10،11،12 . تتألف أنظمة CFPS من المكونات اللازمة للنسخ والترجمة ، ولها مزايا كبيرة على أجهزة الاستشعار الحيوية للخلية الكاملة. على وجه التحديد ، لا يقتصر الاستشعار على جدار الخلية ، وبشكل عام ، فهي معيارية في التصميم ، وآمنة بيولوجيا ، وغير مكلفة ، ويمكن تجفيفها بالتجميد للاستخدام المحمول. تتيح القدرة على تجميد التفاعلات القائمة على دائرة الجينات الجافة على ركائز مثل الورق أو المنسوجات النقل والتخزين طويل الأجل في درجة حرارة الغرفة5 وحتى دمجها في التكنولوجيا القابلة للارتداء13.
وقد أظهرت الأعمال السابقة أنه يمكن استخدام النظم الخالية من خلايا الإشريكية القولونية للكشف عن العديد من التحليلات، على سبيل المثال، المعادن السامة مثل الزئبق، والمضادات الحيوية مثل التتراسيكلين7،14، والمواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء 15،16، والمؤشرات الحيوية مثل حمض الهيبوريك 17، وجزيئات استشعار النصاب المرتبطة بمسببات الأمراض9،18 والمواد غير المشروعة مثل الكوكايين17، وغاما هيدروكسي بوتيرات (GHB)19 . بالنسبة للكشف عن الأحماض النووية الخاصة بالتسلسل ، اعتمدت الاستراتيجيات في معظمها على استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على التبديل إلى جانب تقنيات التضخيم متساوي الحرارة. مفاتيح Toehold هي منظمات ريبو اصطناعية (يشار إليها أيضا باسم "المفاتيح" ببساطة في بقية النص) تحتوي على بنية دبوس شعر تمنع الترجمة النهائية عن طريق عزل موقع ربط الريبوسوم (RBS) وكودون البداية. عند التفاعل مع الحمض النووي الريبي المحفز المستهدف ، يتم تخفيف بنية دبوس الشعر ويتم تمكين الترجمة اللاحقة لإطار القراءة المفتوحللمراسل 20.
يمكن أيضا استخدام التضخيم متساوي الحرارة كتشخيص جزيئي21 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه الطرق عرضة للتضخيم غير النوعي ، مما قد يقلل من خصوصية الاختبار وبالتالي دقته إلى أقل من RT-qPCR 22. في العمل الذي تم الإبلاغ عنه هنا ، تم استخدام التضخيم متساوي الحرارة في المنبع لأجهزة الاستشعار القائمة على التبديل لتوفير تضخيم إشارة مشترك يتيح الكشف عن الأحماض النووية ذات الصلة سريريا (الفيمتومولار إلى الأتومولار). يوفر هذا الاقتران بين الطريقتين أيضا نقطتي تفتيش خاصة بالتسلسل توفران معا مستوى عال من الخصوصية. باستخدام هذا النهج ، أظهر العمل السابق الكشف عن فيروسات مثل Zika6 و Ebola5 و Norovirus10 ، وكذلك البكتيريا المسببة للأمراض مثل المطثية العسيرة23 والتيفوئيد12 المقاوم للمضادات الحيوية. في الآونة الأخيرة ، تم عرض مفاتيح تثبيت القدم الخالية من الخلايا للكشف عن SARS-CoV-2 في الجهود المبذولة لتوفير تشخيصات يمكن الوصول إليها لوباء COVID-1911،12،13.
يحدد البروتوكول التالي تطوير والتحقق من صحة مقايسة مفتاح تثبيت القدم الاصطناعية الخالية من الخلايا والورقية للكشف عن فيروس زيكا ، من تصميم أجهزة الاستشعار الحيوية السيليكو ، من خلال خطوات التجميع والتحسين ، إلى التحقق الميداني مع عينات المرضى. يبدأ البروتوكول بتصميم السيليكو لأجهزة الاستشعار القائمة على مفتاح تثبيت إصبع القدم RNA وبادئات التضخيم متساوي الحرارة الخاصة بالحمض النووي الريبي الفيروسي Zika. على الرغم من وجود العديد من طرق التضخيم متساوي الحرارة ، إلا أن استخدام التضخيم القائم على تسلسل الحمض النووي (NASBA) لزيادة تركيز هدف الحمض النووي الريبي الفيروسي الموجود في التفاعل ، مما يتيح حساسية كبيرة سريريا تم إثباته. من الناحية العملية ، تتمتع طرق التضخيم متساوي الحرارة بميزة العمل عند درجة حرارة ثابتة ، مما يلغي الحاجة إلى معدات متخصصة ، مثل الدراجات الحرارية ، والتي تقتصر عموما على المواقع المركزية.
بعد ذلك ، تم وصف عملية تجميع مستشعرات مفتاح إصبع القدم الاصطناعية مع تسلسلات ترميز المراسل من خلال PCR الامتداد المتداخل ، وفحص مستشعرات تبديل إصبع القدم الاصطناعية للحصول على الأداء الأمثل في الأنظمة الخالية من الخلايا باستخدام الحمض النووي الريبي الاصطناعي. بالنسبة لهذه المجموعة من مستشعرات فيروس زيكا، اخترنا جين lacZ الذي يشفر إنزيم β-galactosidase، القادر على شق ركيزة لونية، كلوروفينول ريد-β-D-galactopyranoside (CPRG)، لإحداث تغير في اللون الأصفر إلى الأرجواني يمكن اكتشافه بالعين أو باستخدام قارئ لوحة. بمجرد تحديد المفاتيح الاصطناعية عالية الأداء ، يتم وصف عملية فحص البادئات للتضخيم متساوي الحرارة القائم على تسلسل الحمض النووي للتسلسل المستهدف المقابل باستخدام الحمض النووي الريبي الاصطناعي للعثور على المجموعات التي توفر أفضل حساسية.
أخيرا ، يتم التحقق من أداء منصة التشخيص في الموقع في أمريكا اللاتينية (الشكل 1). لتحديد دقة التشخيص السريري ، يتم إجراء الفحص الورقي الخالي من الخلايا باستخدام عينات فيروس زيكا من المرضى. بالتوازي مع ذلك ، يتم إجراء فحص RT-qPCR القياسي الذهبي للمقارنة. لمراقبة المقايسات الخالية من الخلايا اللونية ، نقوم بتمكين القياس الكمي للنتائج في الموقع في المناطق التي لا تتوفر فيها الدراجات الحرارية. يتم أيضا تقديم قارئ الألواح المجمع يدويا المسمى محمول ، منخفض التكلفة ، سهل الاستخدام ، متعدد الوسائط (بلوم ؛ يشار إليه فيما يلي باسم قارئ الألواح المحمولة) هنا24. تم تطوير قارئ الألواح المحمول في البداية كجهاز مصاحب لتشخيص مفتاح تثبيت القدم الاصطناعي الخالي من الخلايا ، ويوفر طريقة يسهل الوصول إليها لاحتضان النتائج وقراءتها بطريقة عالية الإنتاجية ، مما يوفر تحليلا برمجيا متكاملا قائما على رؤية الكمبيوتر للمستخدمين.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> الشكل 1: سير العمل لاختبار عينات المرضى باستخدام تفاعلات مفتاح تثبيت القدم الورقية الخالية من الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

إن الوصول إلى التشخيصات الجزيئية منخفضة العبء التي يمكن نشرها في المجتمع للاختبار أمر متزايد الأهمية وله آثار أوسع ذات مغزى على رفاهية المجتمعات والاستقرار الاقتصادي. شهدت السنوات الأخيرة ظهور العديد من طرق التشخيص الجديدة متساوية الحرارة لتلبية الحاجة إلى التشخيص الجزيئي السريع والمنخفض التكلفة. لقد ساهمنا في هذا الجهد من خلال تطوير التشخيصات القائمة على تبديل أصابع القدم والتحقق من صحتها ، بما في ذلك تشخيص فيروسات زيكا وشيكونغونيا التي ينقلها البعوض ، والتي قدمت أداء مشابها للمقايسات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (RT-qPCR) المعياري الذهبي. هذه التشخيصات غير مكلفة لتطويرها وتصنيعها ، ولديها القدرة على توفير القدرة التشخيصية للبيئات منخفضة الموارد. هنا يوفر البروتوكول جميع الخطوات اللازمة لتطوير مقايسة قائمة على التبديل للكشف عن فيروس زيكا. تأخذ المقالة القراء خلال عملية تطوير التشخيص التدريجي. أولا، تعمل التسلسلات الجينومية لفيروس زيكا كمدخلات للتصميم الحسابي للمفاتيح المرشحة باستخدام برمجيات مفتوحة المصدر. بعد ذلك ، يتم عرض تجميع أجهزة الاستشعار للفحص التجريبي مع تسلسل الحمض النووي الريبي الاصطناعي وتحسين الحساسية التشخيصية. بمجرد الانتهاء ، يتم إجراء التحقق من الصحة مع عينات المرضى بالتوازي مع RT-qPCR ، وقارئ بصري مصمم لهذا الغرض ، PLUM. يوفر هذا العمل خارطة طريق تقنية للباحثين لتطوير أجهزة استشعار منخفضة التكلفة قائمة على مفتاح تثبيت القدم للتطبيقات في صحة الإنسان والزراعة والرصد البيئي.

بعد خط أنابيب التصميم الحسابي ، تم تنفيذ بناء ثلاثة مفاتيح تثبيت بواسطة PCR. تم تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز (الشكل 2). يشير وجود شريط واضح يبلغ حوالي 3000 نقطة أساس ، وهو ما يقرب من حجم جين lacZ المقترن بمفتاح تثبيت القدم ، عادة إلى رد فعل ناجح. بدلا من ذلك ، يشير الممر بدون نطاق أو نطاقات متعددة أو نطاق بحجم غير صحيح إلى فشل PCR. في حالة فشل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب تحسين ظروف التفاعل و / أو تسلسل التمهيدي.
تم فحص مفاتيح تثبيت القدم المجمعة لتقييم كل مستشعر مقابل الحمض النووي الريبي المشغل المنسوخ في المختبر (الشكل 3). بينما أظهرت جميع المستشعرات الثلاثة امتصاصا متزايدا ل OD570 ، كان للمفتاح 27B (الشكل 3A) أسرع معدل في المعدل. أظهرت المفاتيح 33B ، وبدرجة أقل ، 47B زيادة في امتصاص OD570 في غياب الحمض النووي الريبي المستهدف ، مما يشير إلى أن هذه المفاتيح تمتلك بعض النشاط أو التسرب في الخلفية (الشكل 3B ، C) - وهي سمة غير مرغوب فيها في مستشعر مرشح لأنها يمكن أن تقلل من النوعية. لتحديد المستشعر الذي يحتوي على أعلى نسبة إشارة تشغيل / إيقاف بشكل أكثر وضوحا ، تم حساب تغيير الطي لامتصاص OD570 (انظر قسم المعلومات التكميلية 5) ورسمه (الشكل 4). من هذا التحليل ، من الواضح أن المفتاح 27B هو المستشعر الذي يتمتع بأفضل أداء مع نسبة تشغيل / إيقاف تبلغ حوالي 60.
ثم تم تقييم حساسية مفتاح تثبيت إصبع القدم الأعلى أداء (27B) من خلال تحديد أقل تركيز للحمض النووي الريبي المطلوب لتنشيط مفتاح تثبيت إصبع القدم عندما يقترن بتفاعل NASBA. يوضح الرسم البياني أن مستشعرات زيكا الأفضل أداء يمكنها اكتشاف الحمض النووي الريبي بتركيزات منخفضة تصل إلى 1.24 جزيء لكل ميكرولتر (أي ما يعادل ~ 2 aM; الشكل 5).
بعد تحديد المفتاح 27B والتحقق من صحته ، تم توزيع مواد المستشعر على أعضاء الفريق في ريسيفي في ولاية بيرنامبوكو في البرازيل. وفي البرازيل، تم تقييم دقة التشخيص السريري لمنصة تشخيص فيروس زيكا باستخدام عينات من مرضى فيروس زيكا، بالتوازي مع RT-qPCR للمقارنة. للتحقق من صحة منصة تشخيص Zika الورقية ، تم استخدام قارئ الألواح المحمول ، وهو قادر على احتضان وقراءة الإخراج اللوني لأجهزة الاستشعار الورقية. يستخدم تغير اللون من الأصفر إلى الأرجواني لتحديد عينة إيجابية ، بينما تظل العينة السالبة صفراء (الشكل 6). هناك خيار إضافي لتصور النتائج الناتجة عن قارئ اللوحة المحمول (الشكل 8) وهو رسم الاستجابة اللونية لكل تفاعل ورقي بمرور الوقت. تم اختبار العينات في ثلاث نسخ واعتبرت العينات التي تجاوزت العتبة (الخط الأحمر المحدد على 1) إيجابية ، بينما اعتبرت العينات التي تقل عن العتبة سلبية (الشكل 6 والشكل 7).
وأخيرا، لتقييم ومقارنة الأداء السريري لمستشعر مفتاح تثبيت إصبع القدم Zika مع الطريقة القياسية الذهبية الحالية لتشخيص عدوى فيروس زيكا، تم اختبار جميع عينات المرضى بالتوازي مع RT-qPCR. واختبر مخطط التضخيم لعينتين تمثيليتين من المرضى في ثلاث نسخ للكشف عن فيروس زيكا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (الشكل 9). تعتبر العينات إيجابية عندما تكون قيمة عتبة الدورة (Ct) ≤38 ؛ يشير الخط الأحمر إلى عينة إيجابية ويشير الخط الأزرق إلى عينة سلبية لفيروس زيكا.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> الشكل 2: رحلان كهربائي جل Agarose لتقييم جودة منتجات PCR. يتم تحليل منتجات PCR على هلام أغاروز 1٪ في 1X TAE ، يعمل عند 80 فولت لمدة 90 دقيقة. يشير النطاق الواضح الواحد عادة إلى رد فعل ناجح. حارة 1: 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي ؛ الممرات 2-4: 27B تبديل الحمض النووي ، 33B الزناد الحمض النووي ، و 47B الزناد الحمض النووي ، على التوالي. تمثل الأرقام الموجودة على الجانب الأيسر حجم النطاق بالبت bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> الشكل 3: النماذج الأولية لثلاثة مفاتيح تثبيت لمستشعرات زيكا الورقية. تم قياس أداء ثلاثة مستشعرات لمفتاح تثبيت إصبع القدم RNA الورقي عند 37 درجة مئوية لأكثر من 130 دقيقة. يحتوي كل رسم بياني على مسارين ، أحدهما يمثل التحكم في التبديل فقط ، بينما يمثل الآخر المفتاح والمشغل. تمثل الرسوم البيانية الثلاثة البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام مستشعرات مفتاح تثبيت القدم 27B (A) و 33B (B) و 47B (C). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) من ثلاث نسخ متماثلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> الشكل 4: يتم تحديد المستشعرات عالية الأداء عن طريق حساب تغير الطي في الامتصاص عند 570 نانومتر. يتم حساب تغيير الطي (أو الحد الأقصى لنسبة التشغيل / الإيقاف) عن طريق قياس نسبة الامتصاص (OD570) عند 130 دقيقة بين التحكم في المفتاح فقط ، والمفتاح بالإضافة إلى فحص CFPS للتشغيل. تمثل أشرطة الخطأ SEM من ثلاث نسخ متماثلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> الشكل 5: تقييم حساسية المفتاح الأفضل أداء. في المختبر يتم معايرة الحمض النووي الريبي Zika المنسوخ في تفاعلات NASBA. بعد حضانة 1 ساعة ، تمت إضافة التفاعلات إلى تفاعلات PURExpress الخالية من الخلايا على الأقراص الورقية بنسبة 1: 7. يتم رسم تغيير الطي بعد 130 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وقد استنسخ هذا الرقم من24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> الشكل 6: صفحة التقاط قارئ لوحة محمولة محملة ببيانات الصورة الملتقطة. يوضح هذا الشكل صورة نموذجية للصورة النهائية التي تم التقاطها بواسطة قارئ الألواح المحمول أثناء عملية جمع البيانات. يظهر طابع التاريخ/الوقت الأصلي في أعلى الصورة. يشير اللون الأصفر إلى التحكم أو ردود الفعل السلبية ، ويشير اللون الأرجواني إلى رد فعل إيجابي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> الشكل 7: وضع تحليل البيانات. على اليسار ، يختار المستخدمون مجموعات البيانات التي يرغبون في رسمها ؛ ثم يتم عرض الرسوم البيانية على اليمين بألوان فريدة لكل عينة أو مجموعة تحكم. يعمل الخط الأحمر المتقطع كعتبة لتحديد العينات الإيجابية والسلبية. تعتبر العينات التي تم اختبارها في ثلاث نسخ والتي تتجاوز العتبة إيجابية ، بينما تعتبر العينات التي تقل عن العتبة سلبية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD) من ثلاث نسخ متماثلة. يشير Ctrl 1 إلى Ctrl 5 إلى عناصر التحكم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> الشكل 8. بلوم ، قارئ لوحة محمول. يعمل قارئ الألواح المحمول هذا كمختبر في صندوق ويعمل كقارئ لوحة يتم التحكم في درجة حرارته لاحتضان التفاعلات اللونية ومراقبتها. يمكن أن يوفر هذا الجهاز المحمول قياسات كمية وعالية الإنتاجية لأجهزة استشعار زيكا الورقية في الموقع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> الشكل 9: مخطط RT-qPCR لتضخيم عينتين من المرضى تم اختبارهما في ثلاث نسخ للكشف عن فيروس زيكا. تعتبر العينات موجبة عندما تكون قيمة عتبة الدورة (Ct) ≤38. يعمل الخط الأحمر المنقط كعتبة لتحديد العينات الإيجابية والسلبية. يشير التتبع الأحمر إلى عينة موجبة ، ويشير التتبع الأزرق إلى عينة سالبة. تمثل قيمة ΔRn (دلتا Rn) الحجم الطبيعي لإشارة التألق المكتشفة بواسطة أداة RT-qPCR لجميع العينات التي تم اختبارها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
ملف البروتوكول التكميلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الأرقام التكميلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذه الأرقام.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

يعد الوصول إلى التشخيصات اللامركزية ومنخفضة التكلفة وعالية السعة التي يمكن نشرها في المجتمع للاختبار اللامركزي أمرا بالغ الأهمية لمكافحة الأزمات الصحية العالمية. تصف هذه المخطوطة كيفية بناء تشخيصات ورقية لتسلسلات الحمض النووي الريبي الفيروسي التي يمكن اكتشافها باستخدام قارئ بصري محمول.

تصميم إلى دراسة التنفيذ من أجل التطوير والتحقق من صحة المريض لتشخيصات مفتاح تثبيت إصبع القدم الورقية

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

يصف بروتوكولنا تصميم التشخيصات القائمة على الدوائر الجينية وتجميعها والتحقق من صحتها. هذه التشخيصات الجزيئية الورقية منخفضة التكلفة وحساسة ، حيث تكون قادرة على اكتشاف تركيزات الأحماض النووية ذات الصلة سريريا ويمكن تصميمها للكشف عن أي تسلسل تقريبا. هذه تقنية منصة يمكن تصميمها من قبل المستخدمين لتلبية احتياجاتهم ولديها القدرة على جلب التشخيصات السريرية إلى إعدادات موارد الأسنان اللامركزية.يمكن تصميم مستشعر مفتاح تثبيت القدم الخالي من الخلايا لأي هدف قائم على الحمض النووي تقريبا. أظهرت الأعمال الأخيرة تشخيصات خالية من الخلايا للإيبولا والنوروفيروس و SARS-CoV-2 و C.difficile والبكتيريا المسببة للتيفوئيد. سيوضح الإجراء سيفيرينو جيفرسون ريفيرو دا سيلفا ، زميل ما بعد الدكتوراه ، وبوريا بايات ، طالبة دكتوراه من مختبري.لتصميم مفتاح تثبيت القدم، حدد التسلسلات المستهدفة من جينوم فيروس زيكا واختر التسلسلات المستهدفة لفيروس زيكا من الأمبليكونات كما هو موضح في البروتوكول النصي. قم بتنزيل حزمة برامج تصميم مفتاح تثبيت القدم. افتح MATLAB وانتقل إلى مجلد برنامج التصميم.أدخل التسلسلات الهدف في ملف csv لملف إدخال التصميم الموجود في مجلد الإدخال الفرعي. حدد المعلمات لاستخدامها في وظيفة التصميم. قم بتشغيل وظيفة التصميم لإنشاء تصميمات مفتاح تثبيت القدم للأهداف ذات الاهتمام.عند الانتهاء ، انتقل إلى المجلد final_designs وحدد موقع تسلسلات تصميم مفتاح إصبع القدم العلوي والتسلسلات المستهدفة المقابلة في جداول بيانات بتنسيق csv. تأكد من أن تسلسل الحمض النووي لمفتاح تثبيت القدم الذي تم إنشاؤه بواسطة الخوارزمية يحتوي على تسلسلات المروج T7 في النهاية الأولية الخمسة وتسلسل رابط النوكليوتيدات 21 المحفوظ في النهاية الثلاثة الأولية. استخدم NCBI BLAST لفحص تسلسلات تصميم مفتاح تثبيت إصبع القدم العلوي مقابل الفيروسات الشائعة الأخرى عن طريق التحقق من تماثل التسلسل.قبول التسلسلات مع أقل من 40٪ من الدم. تحضير حلول لمفتاح تثبيت إصبع القدم و hypolegos DNA وبادئات التضخيم العكسي بتركيز 10 ميكرومولار في ماء خال من النيوكلياز. قم بتجميع التفاعلات في أنابيب PCR على الجليد وفقا لهذا الجدول.ضع أنابيب التفاعل في دراجة حرارية ، باتباع ظروف الدورة المدرجة في هذا الجدول. تحليل منتجات PCR على هلام agarose. تنقية منتجات PCR وتخفيف الحمض النووي في الحد الأدنى من حجم المياه الخالية من النيوكلياز لضمان تركيز عال بما فيه الكفاية.تحديد كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تحضير محلول مخزون CPRG عن طريق إذابة 25 ملليغرام من المسحوق في ملليلتر واحد من الماء الخالي من النيوكلياز. قم بإعداد مزيج رئيسي على الجليد وفقا للبروتوكول القياسي الموضح هنا.قم بتوزيع المزيج الرئيسي الخالي من الخلايا في أنابيب PCR. بالنسبة لعناصر التحكم الخالية من الخلايا وأدوات التحكم بالتبديل الفردي ، أضف الماء الخالي من النيوكلياز إلى حجم 5.94 ميكرولتر. وبالنسبة للتفاعل ، أضف PCR المنقى لمفتاح إصبع القدم DNA للحصول على تركيز نهائي قدره 33 نانومولار.لاختبار مفتاح تثبيت القدم وتركيبة الحمض النووي الريبي المستهدف ، أضف الحمض النووي الريبي المستهدف المنسوخ في المختبر إلى التركيز النهائي لواحد ميكرومولار واحد. امزج جميع ردود الفعل جيدا عن طريق السحب والطرد المركزي لفترة وجيزة. على صفيحة سوداء شفافة القاع مكونة من 384 بئرا ، أضف 30 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز إلى الآبار المحيطة بآبار التفاعل.ثم باستخدام لكمة خزعة 2 ملم وملاقط ، قطع أقراص ورق الترشيح المحظورة BSA ووضعها في آبار التفاعل. قم بتوزيع 1.8 ميكرولتر من كل أنبوب تفاعل على أقراص ورق الترشيح في لوحة البئر 384 في ثلاث نسخ. قم بتغطية اللوحة بفيلم PCR شفاف وضعها في قارئ الأطباق.قم بقياس الامتصاص عند 570 نانومتر عند 37 درجة مئوية كل دقيقة لمدة 130 دقيقة. قم بإعداد محلول مخزون 25 ميكرومولار لجميع مجموعات التمهيدي الأمامية والخلفية في ماء خال من النيوكلياز. أعد تفاعل خمسة ميكرولتر باستخدام المزيج الرئيسي الموضح هنا.تخلط عن طريق ماصة حتى يذوب الراسب الأبيض ثم الاستغناء في أنابيب PCR. أضف البادئات الأمامية والخلفية إلى الأنابيب المناسبة ، متبوعة بإضافة ميكرولتر واحد من الماء الخالي من النيوكلياز أو اثنين من بيكومولار من الحمض النووي الريبي المستهدف. تخلط عن طريق ماصة لطيفة وتدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب.قم بإعداد بروتوكول الحضانة على دراجة حرارية كما هو موضح هنا. بعد 12 دقيقة ، قم بإزالة الأنابيب وإضافة 1.25 ميكرولتر من مزيج الإنزيم إلى كل أنبوب ، متبوعا بالخلط والطرد المركزي. أعد الأنابيب إلى العجلة الحرارية بعد تخطي خطوة الانتظار البالغة 41 درجة مئوية لبدء حضانة التفاعل لمدة ساعة واحدة.ثم لتقييم أداء التمهيدي ، قم بتجميع تفاعلات مفتاح تثبيت القدم الخالية من الخلايا الورقية وتحليل البيانات. لتحليل الحساسية ، حدد أزواج التمهيدي المرشحة وقم بإعداد التخفيفات التسلسلية للحمض النووي الريبي المستهدف في الماء الخالي من النيوكلياز. كرر تفاعلات NASBA والخلايا الخالية مع مجموعات التمهيدي المحددة في ثلاث نسخ بيولوجية.باستخدام ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي المستخرج للمريض ، قم بإجراء تضخيم NASBA والتفاعلات الخالية من الخلايا الورقية كما هو موضح في القسم الخامس. بعد التفاعلات ، قم بإعداد لوحة التفاعل المكونة من 384 بئرا وقم بتشغيل الفحص في قارئ لوحة محمول عند 37 درجة مئوية. ثم قم بتجميع مكونات RT-qPCR وإضافة الكواشف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر وفقا لهذا الجدول.خلط رد الفعل عن طريق ماصة العينات. قم بتوزيع 6.5 ميكرولتر في كل بئر من لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل المكونة من 96 بئرا أو 384 بئرا ، متبوعا ب 3.5 ميكرولتر من كل قالب RNA في ثلاث نسخ. ضع فيلم PCR فوق الجزء العلوي من اللوحة.جهاز طرد مركزي للوحة 384 بئرا عند 600 مرة G لمدة دقيقتين. ضع اللوحة في جهاز RT-qPCR وقم بتشغيل ظروف ركوب الدراجات كما هو موضح هنا. بعد التصميم الحسابي ، تم إنشاء ثلاثة مفاتيح لأصابع القدم وتحليلها باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز.يشير النطاق حول 3،000 زوج أساسي إلى رد فعل ناجح. تم تقييم مفاتيح تثبيت القدم مقابل الحمض النووي الريبي المحفز المنسوخ في المختبر. في حين أظهرت جميع أجهزة الاستشعار الثلاثة زيادة في الامتصاص ، كان المستشعر 27B هو الأسرع في المعدل ، في حين أن المفتاحين 33B و 47B كان لهما نسبة تشغيل / إيقاف أقل تشير إلى نشاط الخلفية وخصوصية منخفضة.أظهر تغيير أضعاف الامتصاص عند 570 نانومتر أن المفتاح 27B لديه أفضل أداء مع نسبة إشارة تشغيل / إيقاف. علاوة على ذلك ، عندما يقترن ب NASBA ، يمكنه اكتشاف الحمض النووي الريبي بتركيزات منخفضة تصل إلى 124 جزيئا لكل ميكرولتر مما يشير إلى حساسية عالية. واختبرت عينات من مرضى فيروس زيكا من البرازيل لتقييم دقة التشخيص السريري لأجهزة الاستشعار باستخدام قارئ لوحات محمول.أدى تغير اللون من الأصفر إلى الأرجواني إلى تحديد عينة إيجابية. تم رسم الاستجابة اللونية لكل تفاعل ورقي بمرور الوقت بواسطة البرنامج المدمج على قارئ الألواح المحمولة PLUM. واعتبرت العينات التي تجاوزت العتبة إيجابية.تم تحديد الأداء السريري للمستشعر بالمقارنة مع RT-qPCR. اعتبرت العينات موجبة عندما كانت قيمة عتبة الدورة تساوي أو تقل عن 38. من المهم التأكد من أن النتائج من شاشات تبديل أصابع القدم وحساسية NASBA التمهيدي قابلة للتكرار ومحسنة قبل المضي قدما في تجارب المرضى.ونظرا لبساطتها وقدرتها على التكيف، مهدت منصة التشخيص الموصوفة هنا الطريق لتطوير أدوات جديدة لنقاط الرعاية يمكن أن تعود بالنفع على النظام الصحي، لا سيما بالنسبة للبلدان المنخفضة الدخل.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

توصيف النظم المعقدة باستخدام تصميم التجارب النهج: عابر التعبير البروتين في التبغ كدراسة حالة

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

المغنطيسى إلى جانب التصوير المحمولة وتحليل لتشخيص الأمراض

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

تصنيع أجهزة ميكروفلويديك ثلاثي الأبعاد على الورق ليمونواسايس

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

تلفيق والتحقق من صحة نظام الجهاز على رقاقة مع أقطاب متكاملة لقياس المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال مباشرة

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

نموذج القلب الولدان تشريحيا واقعية لاستخدامها في أجهزة محاكاة المرضى حديثي الولادة

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors للكشف عن حوزتي النشاط في فيفو لتشخيص موسع

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...