Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

De auteurs bedanken alle leden van de Green, Pardee en Pena labs, evenals alle co-auteurs van eerdere manuscripten met betrekking tot het werk dat in dit manuscript wordt onthuld. S.J.R.d.S. werd ondersteund door een PhD fellowship gesponsord door de Foundation for Science and Technology van Pernambuco (FACEPE), Brazilië, referentienummer IBPG-1321-2.12/18, en wordt momenteel ondersteund door een Postdoctoral Fellowship gesponsord door de Universiteit van Toronto, Canada. P.B. wordt ondersteund door de William Knapp Buckley Award van de Faculteit Farmacie, Universiteit van Toronto. M.K. werd ondersteund door het Precision Medicine Initiative (PRiME) aan het interne fellowshipnummer PRMF2019-002 van de Universiteit van Toronto. Dit werk werd ondersteund door fondsen aan K.P van het Canada Research Chairs Program (bestanden 950-231075 en 950-233107), het Major Research Project Management Fund van de Universiteit van Toronto, het CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469), en aan L.P, A.A.G. en K.P via de CIHR / IDRC Team Grant: Canada-Latin / America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), evenals door fondsen aan K.P. van het Canada's International Development Research Centre (subsidie 109434-001) via de Canadese 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Dit werk werd ook ondersteund door fondsen aan A.A.G. van een Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), de Gates Foundation (OPP1160667), een NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), een NIH R21 award (1R21AI136571-01A1) aan K.P./A.A.G, en een Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). Figuur 1 is gemaakt met Biorender.com onder academische licentie voor K.P.

<ol>
	<li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world.">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, 73-79 (2006).</li><li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+diagnostics+for+global+health.">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil.">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+Early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis.">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li><li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants.">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li><li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor.">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).</li><li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment.">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li><li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors.">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li><li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics.">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li><li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection.">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li><li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter.">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR&#946;-specific+endocrine+disruptors.">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTR&#946;-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine:+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach.">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li><li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors.">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li><li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis.">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li><li>Gr&#228;we, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper-based,+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs.">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).</li><li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toehold+Switches:+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression.">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li><li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics:+a+critical+review.">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li><li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification.">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers.">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li><li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples.">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li><li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information.">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li><li>. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022)</li><li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+(NASBA).">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li><li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization.">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).</li><li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+automated+DNA+assembly:+Best+practices,+metrics,+and+protocols+using+robots.">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).</li><li>Silva, S. J. R., de Magalh&#227;es, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+circulation+of+DENV,+CHIKV,+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil:+An+inconvenient+truth.">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205 (2021).</li><li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso.">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li><li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts.">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).</li><li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+(RT-LAMP)+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil.">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li></ol>

K.P. en A.A.G. zijn mede-uitvinders van op papier gebaseerde sensorgerelateerde technologieën. Y.G., S.C. en K.P. zijn mede-oprichters van LSK Technologies, Inc. en zijn mede-uitvinders van de PLUM-gerelateerde technologieën. M.K., K.P. en A.A.G. zijn mede-oprichters van En Carta Diagnostics Ltd. Andere auteurs hebben geen belangenconflicten. Patenten: PLUM-apparaat: Y.G., S.C. en K.P. patentaanvraag werd ingediend door de Universiteit van Toronto en toegewezen aan LSK Technologies Inc. U. S. Provisional Patent Application No. 62/982,323 ingediend op 27 februari 2020; Toehold switch patent: A.A.G., P.Y., and J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Patent. WO2014074648A3 ingediend op 6 november 2012; Op papier gebaseerd diagnostisch patent: K.P. en J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" U.S. patent pending No. US15/963,831 ingediend op 6 december 2013; Zika patent 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., en J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U.S. Provisional Patent Application No. 62/403,778 ingediend op 4 oktober 2016; Zika patent 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., en J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U.S. Provisional Patent Application No. 62/341,221 ingediend op 25 mei 2016.

Het gecombineerde op papier gebaseerde systeem dat hier wordt beschreven, kan klinisch relevante moleculaire diagnostiek, met prestaties die functioneel vergelijkbaar zijn met RT-qPCR, naar het punt-van-behoefte brengen6. Belangrijk is dat voor externe instellingen de beschikbaarheid van diagnose op locatie de tijd tot resultaten kan verkorten van dagen tot uren. Om de programmeerbaarheid van deze aanpak te benadrukken, kan de beschreven pijplijn worden gebruikt om vrijwel elk pathogeendoel te detecteren. We hebben de moleculaire gereedschappen gekoppeld aan een speciaal gebouwde draagbare plaatlezer, die compact is en compatibel met batterijwerking (8-9 uur) en on-board data-analyse biedt om gedistribueerde toepassingen mogelijk te maken. In ander werk hebben we de gecombineerde hardware en het diagnostische platform voor het Zika-virus gevalideerd met 268 patiëntmonsters, parallel aan RT-qPCR, en een diagnostische nauwkeurigheid van 98,5% 24 gevonden. Alles bij elkaar genomen is ons doel om de technologieoverdracht van dit platform aan onderzoekers mogelijk te maken, zodat het door de gemeenschap kan worden hergebruikt en verbeterd om onvervulde diagnostische behoeften aan te pakken.
Het ontwerpproces van de in silico toehold switch is geïntegreerd en geautomatiseerd in een pijplijn die in drie fasen kan worden verdeeld. De eerste fase genereert een pool van toehold switch-ontwerpen die hybridiseren naar de doelsequentie in één nucleotide-stappen. De tweede fase onderzoekt de secundaire structuur en de beschikbaarheid van de sleufschakelaar en elimineert sensoren met in-frame voortijdige stopcodons. Een scoringsfunctie die rekening houdt met meerdere factoren (bijv. defectniveau van de toehold-switch, beschikbaarheid van toehold-switch en toegankelijkheid van de doellocatie) wordt vervolgens geïmplementeerd om top toehold-switchontwerpen te selecteren op basis van algemene scores. In de laatste fase wordt een lijst met sequenties gegenereerd voor de top toehold switch-ontwerpen en de bijbehorende doeltriggers. De bovenste sensorsequenties moeten worden gescreend op specificiteit tegen het menselijke transcriptoom en nauw verwante virale genomen met behulp van NCBI/Primer-BLAST25. Het is ook de beste praktijk om de sensordoellocaties te screenen op sequentiebehoud in het Zika-virale genoom om ervoor te zorgen dat de sensoren een brede en robuuste detectie bieden. Er zijn verschillende versies van de ontwerpsoftware voor de toehold-schakelaar ontwikkeld en het ontwerpalgoritme stelt gebruikers in staat om twee versies te genereren, ofwel serie A6 of serie B-sleufschakelaars6. In dit artikel ligt de focus op het serie B-staartschakelaarontwerp.
Na commerciële DNA-synthese kunnen de toehold-schakelaars snel worden geassembleerd en vervolgens worden getest door een eerste screening uit te voeren tegen een synthetische doeltriggersequentie die overeenkomt met korte regio's (200-300 nt) van het doelgenoom. Voor het screenen van de prestaties van op toehold switch gebaseerde sensoren is het ideaal om de doelsequentie in de vorm van RNA toe te voegen. In dit artikel zijn de stappen beschreven die nodig zijn om in vitro getranscribeerd trigger-RNA toe te voegen. Indien beschikbaar, kunnen echter genoomsjablonen over de volledige lengte worden gebruikt, zoals gekwantificeerde virale RNA-extracten of commerciële synthetische RNA-genomen of -standaarden. Het gebruik van volledige RNA-genomen voor de eerste screening van de toehold-switch is gunstig omdat het kan informeren of aanvullende factoren, zoals de secundaire structuur van RNA, de sensorprestaties zullen beïnvloeden. Om de AAN/UIT-verhouding van kandidaatschakelaars te optimaliseren, kan het DNA van de grijpschakelaar worden getitreerd in de celvrije reactie. Deze stap kan ook dienen om goed presterende toehold-schakelaars te identificeren (vouwversterking of hoge AAN / UIT-ratio) en lekkende toehold-schakelaars (hoog signaal in afwezigheid van het doel-RNA) weg te laten uit downstream-karakteriseringsstappen.
Om de detectiegrens van de best presterende toehold switch-kandidaten te verbeteren, wordt NASBA gebruikt om klinisch relevante concentraties van doel-Zika viraal RNA te verhogen tot een niveau dat kan worden gedetecteerd door toehold switches6. Verschillende combinaties van voorwaartse en omgekeerde primersets worden gescreend om de beste NASBA-primer- en toehold-switchcombinaties te bepalen om detectie bij klinisch relevante concentraties mogelijk te maken. Zodra een ideale primer set en toehold switch combinatie is geïdentificeerd, wordt de assay verder gebracht naar klinische validatie. Het is belangrijk op te merken dat de teengreepschakelaar en NASBA-screeningsfasen arbeids- en resource-intensief kunnen zijn en daarom is testontwikkeling het meest geschikt voor goed uitgeruste onderzoekslocaties. Hoewel we geen procesautomatisering hebben toegepast, is het waarschijnlijk dat dit de iteratieve ontwerp-, bouw- en testcyclus32 kan versnellen. Gelukkig kan de doorlooptijd van sensorontwerp en testen tot implementatie opmerkelijk kort zijn (minder dan een week), waardoor deze strategie ideaal is voor tijdkritische situaties, zoals epidemische uitbraken6.
Zelfs nadat een biosensor met klinisch relevante gevoeligheid is ontwikkeld, zijn er technische uitdagingen die moeten worden aangepakt. Aangezien dit protocol handmatige bediening omvat en een procedure met meerdere stappen is, bestaat het risico op kruisbesmetting tussen monsters. We doen ons best om dit risico te verminderen door zorgvuldige laboratoriumpraktijken. In een recente klinische studie van 268 patiëntenmonsters ondervonden we geen besmettingsproblemen; het is echter een belangrijke overweging24. Met dit in gedachten blijft het protocol een laboratoriumtest en vereist het een bekwame gebruiker met de juiste moleculaire biologietechnieken. Een extra overweging voor de inzet is de RNA-isolatie van patiëntmonsters. Hier beschrijven we RNA-isolatie met behulp van kolomgebaseerde nucleïnezuurextractiekits. In ander werk hebben we echter een effectieve en eenvoudige kooklysemethode gedemonstreerd (95 °C gedurende 2 minuten) voor de verwerking van patiëntmonsters met lage belasting6. Deze strategie elimineert bijna de kosten die gepaard gaan met RNA-extractie en vermijdt het gebruik van kolomgebaseerde nucleïnezuurextractiekits, die een logistieke uitdaging kunnen vormen in omgevingen met weinig middelen of problemen met de toeleveringsketen tijdens crises, zoals de COVID-19-pandemie33.
Zoals we tijdens de COVID-19-pandemie hebben gezien, kunnen de instrumenten die worden gebruikt om RT-qPCR uit te voeren zelf als een knelpunt dienen en de toegang van patiënten tot testen beperken. Deze factor, die ook grotendeels financieel is, leidt tot een gecentraliseerde testmodus die de diagnostische toegang kan beperken. Tijdens de Zika-uitbraak van 2015/2016 waren bijvoorbeeld slechts vijf nationale referentielaboratoria beschikbaar in Brazilië, wat vertragingen veroorzaakte bij het testen van patiënten. Zonder rekening te houden met het potentiële voordeel van schaalvoordelen, zijn de huidige kosten van goederen voor de draagbare plaatlezer ~ $ 500 USD, die zelfs als deze vervijfvoudigd is om rekening te houden met arbeid en commerciële marge, nog steeds een betaalbaar instrument biedt. Dit is goed te vergelijken met RT-qPCR-instrumenten die variëren in kosten van $ 15.000 - $ 90.000 USD34. Bovendien zijn de geschatte kosten per test voor de celvrije test in Latijns-Amerika ongeveer $ 5,48 USD, terwijl de kosten per test van RT-qPCR in Brazilië ~ $ 10-11 USD waren ten tijde van de Zika-uitbraak36. Naast de kosten van apparatuur, heeft de draagbare plaatlezer een kleine voetafdruk (20 cm3), automatische analyse, gegevensupload naar de cloud via internet en kan deze op batterijvoeding worden uitgevoerd. Deze functies breiden de potentiële instellingen waar testen kan worden ingezet drastisch uit en breiden tegelijkertijd de patiëntenpopulatie uit die kan worden bediend.
Tot op heden zijn de meest voorkomende commerciële E. coli CFPS-platforms de S30- en PURE-systemen37; een belangrijke overweging bij het verbeteren van de toegang tot diagnostiek in lage- en middeninkomenslanden is echter de beperkte binnenlandse beschikbaarheid van deze reagentia. Een belangrijke stap in de richting van het oplossen van deze uitdaging is de ontwikkeling van lokale CFPS-productie. Het Federici-lab heeft onlangs aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van een niet-commercieel platform om op lysaat gebaseerde sensoren te implementeren in op lysaat gebaseerde celvrije systemen, met een LOD van 2,7 fM met Zika-virus RNA14. Deze prestatie maakt het niet alleen mogelijk om de reagentia in het land van gebruik te maken, waardoor importtarieven en vertragingen worden vermeden, maar de arbeidskosten schalen ook naar lokale tarieven en dus kunnen de totale kosten aanzienlijk worden verlaagd. In het werk geschetst door de Federici-groep bedroegen de kosten voor het produceren van de CFPS-expressiereactie (5 μL) in Chili 6,9 cent (USD) 35,38, wat een dubbele stimulans (verbeterde logistiek en kosten) biedt voor het implementeren van op lysaat gebaseerde systemen35,38.
De plaatsing van RT-qPCR-vergelijkbare tests in gedistribueerde diagnostische netwerken kan aanzienlijke voordelen opleveren ten opzichte van de huidige praktijken die afhankelijk zijn van het transport van monsters naar gecentraliseerde RT-qPCR-faciliteiten. In peri-urbane omgevingen, waar Zika-gevallen geconcentreerd waren, vertraagt de fysieke afstand tussen een patiënt en de diagnostische faciliteit de diagnose en verhoogt het risico dat de resultaten de patiënt niet op een klinisch relevant moment bereiken. Het is onze hoop dat het hier gepresenteerde werk kan bijdragen aan het in staat stellen van de onderzoeksgemeenschap, door de overdracht van kennis, om gedecentraliseerde biotechnologie en draagbare hardware te creëren voor menselijke gezondheid, landbouw en milieumonitoring.

RT-qPCR is de gouden standaardtechnologie voor klinische diagnostiek gebleven vanwege de uitstekende gevoeligheid en specificiteit. Hoewel zeer robuust, is de methode afhankelijk van dure, gespecialiseerde apparatuur en reagentia die temperatuurgecontroleerde distributie en opslag vereisen. Dit vormt aanzienlijke belemmeringen voor de toegankelijkheid van kwaliteitsdiagnostiek wereldwijd, met name in tijden van ziekte-uitbraken en in regio's waar de toegang tot goed uitgeruste laboratoria beperkt is 1,2. Dit werd waargenomen tijdens de uitbraak van het Zika-virus in 2015/2016 in Brazilië. Met slechts vijf gecentraliseerde laboratoria beschikbaar om RT-qPCR-tests uit te voeren, ontstonden er aanzienlijke knelpunten, waardoor de toegang tot diagnostiek werd beperkt. Dit was vooral een uitdaging voor personen in peri-urbane omgevingen, die ernstiger werden getroffen door de uitbraak 3,4. In een poging om de toegang tot diagnostiek te verbeteren, toont het protocol een platform dat is ontwikkeld met het potentieel om gedecentraliseerde, goedkope en hoge capaciteitsdiagnostiek te bieden in instellingen met weinig middelen. Als onderdeel hiervan werd een diagnostische ontdekkingspijplijn opgezet, waarbij isothermische amplificatie en synthetische RNA-switchgebaseerde sensoren werden gekoppeld aan op papier gebaseerde celvrije expressiesystemen 5,6.
Celvrije eiwitsynthesesystemen (CFPS), in het bijzonder op E. coli gebaseerde celvrije systemen, zijn een aantrekkelijk platform voor een breed scala aan biosensingtoepassingen, van milieumonitoring 7,8 tot pathogene diagnostiek 5,6,9,10,11,12 . Cfps-systemen bestaan uit de componenten die nodig zijn voor transcriptie en vertaling en hebben aanzienlijke voordelen ten opzichte van biosensoren voor hele cellen. In het bijzonder wordt detectie niet beperkt door een celwand en zijn ze over het algemeen modulair van ontwerp, bioveilig, goedkoop en kunnen ze worden gevriesdroogd voor draagbaar gebruik. De mogelijkheid om op gencircuits gebaseerde reacties op substraten zoals papier of textiel te vriesdrogen, maakt transport mogelijk, langdurige opslag bij kamertemperatuur5 en zelfs integratie in draagbare technologie13.
Eerder werk heeft aangetoond dat E. coli celvrije systemen kunnen worden gebruikt om talrijke analyten te detecteren, bijvoorbeeld toxische metalen zoals kwik, antibiotica zoals tetracycline 7,14, hormoonontregelende chemicaliën 15,16, biomarkers zoals hippuurzuur17, pathogeen-geassocieerde quorumdetectiemoleculen 9,18 en illegale stoffen zoals cocaïne17 en gammahydroxybutyraat (GHB)19 . Voor de sequentiespecifieke detectie van nucleïnezuren zijn strategieën voor het grootste deel gebaseerd op het gebruik van switch-gebaseerde biosensoren gekoppeld aan isotherme amplificatietechnieken. Toehold-schakelaars zijn synthetische riboregulatoren (in de rest van de tekst ook wel gewoon 'schakelaars' genoemd) die een haarspeldstructuur bevatten die stroomafwaartse translatie blokkeert door de ribosomale bindingsplaats (RBS) en het startcodon te sekwestreren. Bij interactie met hun target trigger RNA wordt de haarspeldstructuur ontlast en wordt de daaropvolgende vertaling van een open leesframe van een reporter ingeschakeld20.
Isothermische amplificatie kan ook worden gebruikt als moleculaire diagnostiek21; deze methoden zijn echter gevoelig voor niet-specifieke versterking, waardoor de specificiteit en daarmee de nauwkeurigheid van de test kan worden teruggebracht tot onder die van RT-qPCR 22. In het hier gerapporteerde werk werd isotherme amplificatie stroomopwaarts van de switch-gebaseerde sensoren gebruikt om gecombineerde signaalversterking te bieden die klinisch relevante detectie van nucleïnezuren (femtomolaire tot attomolaire) mogelijk maakt. Deze koppeling van de twee methoden biedt ook twee sequentiespecifieke controlepunten die in combinatie een hoge mate van specificiteit bieden. Met behulp van deze aanpak heeft eerder werk de detectie aangetoond van virussen zoals Zika6, Ebola5, Norovirus10, evenals pathogene bacteriën zoals C. difficile23 en antibioticaresistente Tyfus12. Onlangs zijn celvrije toehold-schakelaars gedemonstreerd voor SARS-CoV-2-detectie in pogingen om toegankelijke diagnostiek te bieden voor de COVID-19-pandemie 11,12,13.
Het volgende protocol schetst de ontwikkeling en validatie van celvrije, op papier gebaseerde synthetische toehold switch assay voor Zika-virusdetectie, van in silico biosensorontwerp, via de assemblage- en optimalisatiestappen, tot veldvalidatie met patiëntmonsters. Het protocol begint met het in silico-ontwerp van RNA-sensoren en isothermische amplificatieprimers die specifiek zijn voor het Zika-virale RNA. Hoewel er tal van isotherme amplificatiemethoden bestaan, werd hier het gebruik van nucleïnezuursequentie-gebaseerde amplificatie (NASBA) aangetoond om de concentratie van het virale RNA-doelwit in de reactie te verhogen, waardoor klinisch significante gevoeligheid mogelijk werd. Praktisch gezien hebben isothermische versterkingsmethoden het voordeel dat ze bij een constante temperatuur werken, waardoor er geen gespecialiseerde apparatuur nodig is, zoals thermische cyclers, die over het algemeen beperkt zijn tot gecentraliseerde locaties.
Vervolgens wordt het proces beschreven van het assembleren van de synthetische toehold-schakelaarsensoren met reportercoderingssequenties door middel van overlapuitbreiding PCR en het screenen van de synthetische toehold-schakelaarsensoren voor optimale prestaties in celvrije systemen met synthetisch RNA. Voor deze set Zika-virussensoren hebben we het lacZ-gen geselecteerd dat codeert voor het β-galactosidase-enzym, dat in staat is om een colorimetrisch substraat, chlorofenol rood-β-D-galactopyranoside (CPRG), te splitsen om een gele naar paarse kleurverandering te produceren die met het oog of met een platenlezer kan worden gedetecteerd. Zodra de best presterende synthetische schakelaars zijn geïdentificeerd, wordt het proces beschreven voor het screenen van primers op basis van nucleïnezuursequentie gebaseerde isotherme amplificatie van de overeenkomstige doelsequentie met behulp van synthetisch RNA om sets te vinden die de beste gevoeligheid bieden.
Ten slotte worden de prestaties van het diagnostisch platform ter plaatse gevalideerd in Latijns-Amerika (figuur 1). Om de klinische diagnostische nauwkeurigheid te bepalen, wordt de op papier gebaseerde celvrije test uitgevoerd met behulp van Zika-virusmonsters van patiënten; parallel wordt een gouden standaard RT-qPCR-test uitgevoerd ter vergelijking. Om colorimetrische celvrije testen te monitoren, maken we on-site kwantificering van resultaten mogelijk in regio's waar thermische cyclers niet beschikbaar zijn. De met de hand geassembleerde plaatlezer genaamd Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; hierna draagbare plaatlezer genoemd) wordt hier ook geïntroduceerd24. Oorspronkelijk ontwikkeld als een begeleidend apparaat voor celvrije synthetische toehold-schakelaardiagnostiek, biedt de draagbare plaatlezer een toegankelijke manier om resultaten op een manier met hoge doorvoer te incuberen en te lezen, waardoor geïntegreerde, op computervisie gebaseerde softwareanalyse voor gebruikers wordt geboden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Figuur 1: Workflow voor het testen van patiëntmonsters met behulp van op papier gebaseerde celvrije toehold-switchreacties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

Toegang tot moleculaire diagnostiek met lage belasting die in de gemeenschap kan worden ingezet om te testen, wordt steeds belangrijker en heeft betekenisvolle bredere implicaties voor het welzijn van samenlevingen en economische stabiliteit. De afgelopen jaren zijn er verschillende nieuwe isothermische diagnostische modaliteiten ontstaan om te voldoen aan de behoefte aan snelle, goedkope moleculaire diagnostiek. We hebben aan deze inspanning bijgedragen door de ontwikkeling en patiëntvalidatie van op toehold switch gebaseerde diagnostiek, inclusief diagnostiek voor de door muggen overgedragen Zika- en chikungunya-virussen, die prestaties leverden die vergelijkbaar waren met op goudstandaard reverse transcriptie-kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) gebaseerde assays. Deze diagnostiek is goedkoop te ontwikkelen en te produceren en ze hebben het potentieel om diagnostische capaciteit te bieden aan omgevingen met weinig middelen. Hier biedt het protocol alle stappen die nodig zijn voor de ontwikkeling van een switch-gebaseerde test voor Zika-virusdetectie. Het artikel neemt lezers mee door het stapsgewijze diagnostische ontwikkelingsproces. Ten eerste dienen genomische sequenties van het Zika-virus als input voor het computationele ontwerp van kandidaat-switches met behulp van open-source software. Vervolgens wordt de assemblage van de sensoren voor empirische screening met synthetische RNA-sequenties en optimalisatie van diagnostische gevoeligheid getoond. Eenmaal voltooid, wordt validatie uitgevoerd met patiëntmonsters parallel met RT-qPCR en een speciaal gebouwde optische lezer, PLUM. Dit werk biedt een technische routekaart voor onderzoekers voor de ontwikkeling van goedkope op de koppeling gebaseerde sensoren voor toepassingen in de menselijke gezondheid, landbouw en milieumonitoring.

Na de computationele ontwerppijplijn werd de bouw van drie toehold-switches uitgevoerd door PCR. De PCR-producten werden geanalyseerd met behulp van agarose gel-elektroforese (figuur 2). De aanwezigheid van een heldere band rond 3.000 bp, ongeveer de grootte van het lacZ-gen gekoppeld aan een teengreepschakelaar, duidt meestal op een succesvolle reactie. Een baan zonder band, meerdere banden of een band van de verkeerde grootte geeft ook een mislukte PCR aan. In het geval van een defecte PCR moeten de reactiecondities en/of primersequenties worden geoptimaliseerd.
De geassembleerde grijpschakelaars werden gescreend om elke sensor te beoordelen aan de hand van zijn respectievelijke in vitro getranscribeerde trigger-RNA (figuur 3). Terwijl alle drie de sensoren een verhoogde OD570-absorptie vertoonden, had schakelaar 27B (figuur 3A) de snelste on-rate. Schakelaars 33B en, in mindere mate, 47B vertoonden een verhoogde OD570-absorptie in afwezigheid van target trigger-RNA, wat aangeeft dat deze schakelaars enige achtergrondactiviteit of lekkage bezitten (figuur 3B, C) - een eigenschap die niet gewenst is in een kandidaat-sensor omdat het de specificiteit kan verminderen. Om de sensor met de hoogste AAN/UIT-signaalverhouding duidelijker te identificeren, werd de vouwverandering van de ABSORPTIE VAN OD570 berekend (zie aanvullende informatie rubriek 5) en uitgezet (figuur 4). Uit deze analyse blijkt dat schakelaar 27B de sensor is die de beste prestaties levert met een AAN/UIT-verhouding van rond de 60.
De gevoeligheid van de best presterende toehold-schakelaar (27B) werd vervolgens geëvalueerd door de laagste RNA-concentratie te bepalen die nodig is om de toehold-schakelaar te activeren in combinatie met een NASBA-reactie. De grafiek illustreert dat de best presterende Zika-sensoren RNA kunnen detecteren bij concentraties zo laag als 1,24 moleculen per μL (gelijk aan ~ 2 aM; Figuur 5).
Nadat schakelaar 27B was geïdentificeerd en gevalideerd, werden de sensormaterialen gedistribueerd naar de teamleden in Recife in de Braziliaanse deelstaat Pernambuco. In Brazilië werd de klinische diagnostische nauwkeurigheid van het diagnostische platform voor het Zika-virus beoordeeld met behulp van monsters van Zika-viruspatiënten, parallel aan RT-qPCR voor vergelijking. Om het op papier gebaseerde Zika-diagnostische platform te valideren, werd de draagbare plaatlezer gebruikt, die in staat is om de colorimetrische uitvoer van op papier gebaseerde sensoren te incuberen en te lezen. De kleurverandering van geel naar paars wordt gebruikt om een positief monster te identificeren, terwijl een negatief monster geel blijft (figuur 6). Een extra optie voor het visualiseren van de resultaten die door de draagbare plaatlezer worden gegenereerd (figuur 8) is om de colorimetrische respons voor elke op papier gebaseerde reactie in de loop van de tijd te plotten. Monsters werden in drievoud getest en monsters die de drempel overschreden (rode lijn ingesteld op 1) werden als positief beschouwd, terwijl monsters onder de drempel als negatief werden beschouwd (figuur 6 en figuur 7).
Ten slotte, om de klinische prestaties van de Zika-greepschakelaarsensor te evalueren en te vergelijken met de huidige gouden standaardmethode voor het diagnosticeren van Zika-virusinfectie, werden alle patiëntmonsters parallel met RT-qPCR getest. De amplificatieplot van twee representatieve patiëntenmonsters werd in drievoud getest voor de detectie van het Zika-virus door RT-qPCR (figuur 9). De monsters worden als positief beschouwd wanneer de cyclusdrempel (Ct) ≤38 is; de rode lijn geeft een positief monster aan en de blauwe lijn geeft een negatief monster voor het Zika-virus aan.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Figuur 2: Agarose gel elektroforese om de kwaliteit van PCR-producten te beoordelen. PCR-producten worden geanalyseerd op een 1% agarose-gel in 1X TAE, uitgevoerd op 80 V gedurende 90 minuten. Een enkele duidelijke band duidt meestal op een succesvolle reactie. Baan 1: 1 kb DNA ladder; Lanes 2-4: 27B switch DNA, 33B trigger DNA en 47B trigger DNA, respectievelijk. De nummers aan de linkerkant vertegenwoordigen de bandgrootte in bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Figuur 3: Prototyping van drie grijpschakelaars voor op papier gebaseerde Zika-sensoren. De prestaties van drie op papier gebaseerde RNA-toevoerschakelaarsensoren werden gemeten bij 37 °C gedurende meer dan 130 minuten. Elke grafiek bevat twee sporen, één vertegenwoordigt de schakelaar alleen controle, terwijl de andere de schakelaar en trigger vertegenwoordigt. De drie grafieken geven gegevens weer die zijn verkregen met behulp van de sensoren 27B (A), 33B (B) en 47B (C). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van drie replicaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Figuur 4: De best presterende sensoren worden geïdentificeerd door de vouwverandering in absorptie bij 570 nm te berekenen. Vouwverandering (of maximale AAN/UIT-verhouding) wordt berekend door de absorptieverhouding (OD570) te meten op 130 minuten tussen de schakelaar alleen controle en de schakelaar plus trigger CFPS-test. Foutbalken vertegenwoordigen SEM van drie replicaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Figuur 5: Gevoeligheidsbeoordeling van de best presterende switch. In vitro getranscribeerd Zika-RNA wordt getitreerd in NASBA-reacties. Na een incubatie van 1 uur werden de reacties toegevoegd aan celvrije PURExpress-reacties op papieren schijven in een verhouding van 1:7. De vouwwissel na 130 min bij 37 °C wordt uitgezet. Dit cijfer is gereproduceerd van24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Figuur 6: Draagbare plaatlezer opnamepagina geladen met vastgelegde afbeeldingsgegevens. Deze afbeelding toont een voorbeeldafbeelding van de uiteindelijke afbeelding die door de draagbare plaatlezer is vastgelegd tijdens een gegevensverzamelingsrun. De oorspronkelijke datum-/tijdstempel is zichtbaar boven aan de afbeelding. Gele kleur duidt op controle of negatieve reacties en de paarse kleur duidt op een positieve reactie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Figuur 7: Gegevensanalysemodus. Aan de linkerkant selecteren gebruikers de datasets die ze willen plotten; de grafieken worden vervolgens aan de rechterkant weergegeven met unieke kleuren voor elk monster of controleset. De stippellijn dient als drempel voor het bepalen van positieve en negatieve monsters. Monsters die in drievoud zijn getest en de drempel overschrijden, worden als positief beschouwd, terwijl monsters onder de drempel als negatief worden beschouwd. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (SD) van drie replicaties. Ctrl 1 tot Ctrl 5 geeft besturingselementen aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Figuur 8. PLUM, een draagbare plaatlezer. Deze draagbare plaatlezer fungeert als een lab-in-a-box en dient als een temperatuurgestuurde plaatlezer om colorimetrische reacties te incuberen en te bewaken. Dit draagbare apparaat kan kwantitatieve en high-throughput metingen van de op papier gebaseerde Zika-sensoren ter plaatse leveren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Figuur 9: RT-qPCR-plot van de versterking van twee patiëntmonsters die in drievoud zijn getest voor de detectie van het Zika-virus. Monsters worden als positief beschouwd wanneer de cyclusdrempel (Ct) ≤38 is. De gestippelde rode lijn dient als drempel voor het bepalen van positieve en negatieve monsters. Het rode spoor duidt op een positief monster en het blauwe spoor op een negatief monster. De ΔRn-waarde (delta Rn) vertegenwoordigt de genormaliseerde grootte van het fluorescentiesignaal dat door het RT-qPCR-instrument wordt gedetecteerd voor alle geteste monsters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend Protocol Dossier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende cijfers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Klik hier om deze cijfers te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

Toegang tot gedecentraliseerde, goedkope en hoogwaardige diagnostiek die in de gemeenschap kan worden ingezet voor gedecentraliseerde tests is van cruciaal belang voor het bestrijden van wereldwijde gezondheidscrises. Dit manuscript beschrijft hoe op papier gebaseerde diagnostiek kan worden gebouwd voor virale RNA-sequenties die kunnen worden gedetecteerd met een draagbare optische lezer.

Ontwerp-tot-implementatiestudie voor ontwikkeling en patiëntvalidatie van op papier gebaseerde sleufschakelaardiagnostiek

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Ons protocol beschrijft het ontwerp, de assemblage en de validatie van op gencircuits gebaseerde diagnostiek. Deze op papier gebaseerde moleculaire diagnostiek is goedkoop en gevoelig, kan klinisch relevante concentraties van nucleïnezuren detecteren en kan worden ontworpen om vrijwel elke sequentie te detecteren. Dit is een platformtechnologie die door gebruikers kan worden ontworpen voor hun behoeften en het potentieel heeft om diagnostiek van klinische kwaliteit in meer gedecentraliseerde tandheelkundige broninstellingen te brengen.Celvrije toehold-schakelaarsensor kan worden ontworpen voor vrijwel elk doel op basis van nucleïnezuur. Recent werk heeft celvrije diagnostiek aangetoond voor Ebola, norovirus, SARS-CoV-2, C.difficile en tyfus veroorzakende bacteriën. De procedure wordt gedemonstreerd door Severino Jefferson Rivero da Silva, een postdoctorale fellow, en Pouriya Bayat, een promovendus uit mijn laboratorium.Om de toehold-schakelaar te ontwerpen, identificeert u de doelsequenties uit het Zika-virusgenoom en kiest u de Zika-virusdoelsequenties uit de amplicons zoals beschreven in het tekstprotocol. Download het softwarepakket voor het ontwerpen van de toehold switch. Open MATLAB en navigeer naar de map met ontwerpsoftware.Voer de doelreeksen in het csv-bestand van het ontwerpinvoerbestand in de invoersubmap in. Selecteer de parameters die u wilt gebruiken voor de ontwerpfunctie. Voer de ontwerpfunctie uit om de teengreepschakelaarontwerpen te genereren voor de interessante doelen.Navigeer na voltooiing naar de map final_designs en zoek de ontwerpreeksen van de bovenste toehold-schakelaar en de bijbehorende doelreeksen in spreadsheets in csv-indeling. Zorg ervoor dat de door het algoritme gegenereerde DNA-sequenties van de toehold switch de T7-promotorsequenties aan het vijf priemeinde en een geconserveerde 21 nucleotide-linkersequentie aan het drie priemeinde bevatten. Gebruik NCBI BLAST om de ontwerpsequenties van de bovenste teengreepschakelaar te screenen tegen andere veel voorkomende virussen door te controleren op sequentie homologie.Accepteer sequenties met minder dan 40% hemologie. Bereid oplossingen van de teengreepschakelaar haarspeld DNA-oligo's en omgekeerde amplificatieprimers in een concentratie van 10 micromolair in nucleasevrij water. Monteer reacties in PCR-buizen op ijs volgens deze tabel.Plaats de reactiebuizen in een thermocycler, volgens de in deze tabel vermelde cyclusomstandigheden. Analyseer de PCR-producten op een agarose-gel. Zuiver de PCR-producten en elueerde het DNA in een minimaal volume nucleasevrij water om een voldoende hoge concentratie te garanderen.Kwantificeer het DNA met behulp van een spectrofotometer. Bereid een CPRG-stamoplossing door 25 milligram van het poeder op te lossen in één milliliter nucleasevrij water. Bereid een mastermix op ijs volgens het hier getoonde standaardprotocol.Doseer de celvrije mastermix in PCR-buizen. Voor celvrije bedieningselementen en schakelbedieningen alleen, voegt u nucleasevrij water toe aan een volume van 5,94 microliter. En voeg voor de reactie PCR-gezuiverd teenschakelaar-DNA toe om een uiteindelijke concentratie van 33 nanomolair te krijgen.Om de toehold switch en target RNA combinatie te testen, voeg je in vitro getranscribeerd target RNA toe aan een uiteindelijke concentratie van één micromolair. Meng alle reacties grondig door te pipetteren en kort te centrifugeren. Voeg op een zwart heldere bodemplaat met 384 putten 30 microliter nucleasevrij water toe aan de putten rond de reactieputten.Snijd vervolgens met behulp van een biopsiepons en pincet van twee millimeter BSA geblokkeerde filterpapierschijven en plaats ze in de reactieputten. Doseer 1,8 microliter van elke reactiebuis op de filtreerpapierschijven in de 384-putplaat in drievoud. Bedek de plaat met doorzichtige PCR-film en plaats deze in een platenlezer.Meet de absorptie op 570 nanometer bij 37 graden Celsius elke minuut gedurende 130 minuten. Bereid een 25 micromolaire stockoplossing van alle voorwaartse en omgekeerde primersets in nucleasevrij water. Stel een reactie van vijf microliter in met behulp van de hier getoonde mastermix.Meng door te pipetteren totdat het witte neerslag oplost en doseer vervolgens in PCR-buizen. Voeg de voorste en omgekeerde primers toe aan de juiste buizen, gevolgd door het toevoegen van een microliter nucleasevrij water of twee picomolar van target trigger RNA. Meng door zachtjes te pipetteren en draai kort door de buizen.Stel het incubatieprotocol in op een thermocycler zoals hier weergegeven. Verwijder na 12 minuten de buisjes en voeg 1,25 microliter van het enzymmengsel toe aan elke buis, gevolgd door mengen en centrifugatie. Breng de buizen terug naar de thermocycler na het overslaan van de 41 graden Celsius hold-stap om de reactie-incubatie van een uur te starten.Om vervolgens de primerprestaties te beoordelen, stelt u de op papier gebaseerde celvrije toehold-switchreacties samen en analyseert u de gegevens. Identificeer voor gevoeligheidsanalyse kandidaat-primerparen en bereid seriële verdunningen van doel-RNA voor in nucleasevrij water. Herhaal de NASBA en celvrije reacties met de geselecteerde primersets in biologische triplicaten.Voer met behulp van één microliter geëxtraheerd patiënt-RNA de NASBA-amplificatie en op papier gebaseerde celvrije reacties uit zoals weergegeven in rubriek vijf. Na de reacties bereidt u de 384-well reactieplaat voor en voert u de test uit in een draagbare plaatlezer bij 37 graden Celsius. Monteer vervolgens de RT-qPCR-componenten en voeg de reagentia toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter volgens deze tabel.Meng de reactie door te pipetteren. Doseer 6,5 microliter in elke put van een 96-well of 384-well PCR-plaat, gevolgd door 3,5 microliter van elke RNA-sjabloon in triplicaat. Plaats een PCR-film over de bovenkant van de plaat.Centrifugeer de 384-putplaat op 600 maal G gedurende twee minuten. Plaats de plaat in een RT-qPCR-machine en voer de fietsomstandigheden uit zoals hier afgebeeld. Volgens het computationele ontwerp werden drie toehold-schakelaars geconstrueerd en geanalyseerd met behulp van agarose gel-elektroforese.Een band rond de 3.000 basenparen duidde op een succesvolle reactie. De grijpschakelaars werden beoordeeld aan de hand van hun respectievelijke in vitro getranscribeerde trigger-RNA. Terwijl alle drie de sensoren een toename van de absorptie vertoonden, had sensor 27B de snelste snelheid, terwijl schakelaars 33B en 47B een lagere aan / uit-verhouding hadden die achtergrondactiviteit en verminderde specificiteit aangaf.De vouwverandering van absorptie op 570 nanometer toonde aan dat schakelaar 27B de beste prestaties heeft met een aan/ uit-signaalverhouding. Bovendien kan het in combinatie met NASBA RNA detecteren bij concentraties zo laag als 124 moleculen per microliter, wat wijst op een hoge gevoeligheid. Monsters van Zika-viruspatiënten uit Brazilië werden getest om de klinische diagnostische nauwkeurigheid van de sensoren te beoordelen met behulp van een draagbare plaatlezer.Een kleurverandering van geel naar paars identificeerde een positief monster. De colorimetrische respons voor elke op papier gebaseerde reactie werd in de loop van de tijd uitgezet door de geïntegreerde software op de PLUM draagbare plaatlezer. De monsters die de drempel overschreden, werden als positief beschouwd.De klinische prestaties van de sensor werden vastgesteld in vergelijking met RT-qPCR. De monsters werden als positief beschouwd wanneer de cyclusdrempelwaarde gelijk was aan of lager was dan 38. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de resultaten van toehold-schakelschermen en NASBA-primergevoeligheid reproduceerbaar en geoptimaliseerd zijn voordat u verder gaat met patiëntenproeven.Gezien de eenvoud en het aanpassingsvermogen heeft het hier beschreven diagnostische platform de weg vrijgemaakt voor de ontwikkeling van nieuwe point-of-care-hulpmiddelen die voordelen kunnen opleveren voor het gezondheidssysteem, vooral voor lage-inkomenslanden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Ontwerp en implementatie van een Automated Verlichten, kweken, en Sampling System voor Microbiële optogenetische Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetische levitatie In combinatie met Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fabricage van Driedimensionale Paper-based microfluïdische apparaten voor een immunoassay

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

Anatomisch realistische neonatale hart Model voor gebruik in neonatale patiënt simulatoren

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors om te detecteren Protease activiteit In Vivo Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...