Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
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Les auteurs remercient tous les membres des laboratoires Green, Pardee et Pena ainsi que tous les co-auteurs des manuscrits précédents relatifs aux travaux divulgués dans ce manuscrit. S.J.R.d.S. a été soutenu par une bourse de doctorat parrainée par la Fondation pour la science et la technologie de Pernambuco (FACEPE), Brésil, numéro de référence IBPG-1321-2.12/18, et est actuellement soutenu par une bourse postdoctorale parrainée par l’Université de Toronto, Canada. P.B. est soutenu par le prix William Knapp Buckley de la Faculté de pharmacie de l’Université de Toronto. M.K. a été soutenu par la Precision Medicine Initiative (PRiME) à l’Université de Toronto numéro de bourse interne PRMF2019-002. Ces travaux ont été financés par le Programme des chaires de recherche du Canada (dossiers 950-231075 et 950-233107), le Fonds de gestion des grands projets de recherche de l’Université de Toronto, le Programme de subventions Fondation des IRSC (201610FDN-375469) et le Programme de subventions Fondation des IRSC (201610FDN-375469) et L.P., A.A.G. et K.P par l’entremise de la subvention d’équipe IRSC/CRDI : Programme Canada-Amérique latine/Amérique-Caraïbes sur le virus Zika (FRN : 149783), ainsi que par des fonds versés à K.P. par le Centre de recherches pour le développement international du Canada (subvention 109434-001) dans le cadre de la Possibilité de financement de recherche rapide sur le nouveau coronavirus canadien (COVID-19) 2019. Ce travail a également été soutenu par des fonds à A.A.G. d’une bourse de nouveau chercheur de l’Arizona Biomedical Research Commission (ADHS16-162400), de la Fondation Gates (OPP1160667), d’un NIH Director’s New Innovator Award (1DP2GM126892), d’un prix NIH R21 (1R21AI136571-01A1) à K.P./A.A.G, et d’une bourse Alfred P. Sloan (FG-2017-9108). La figure 1 a été créée avec Biorender.com sous licence académique de K.P.

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K.P. et A.A.G. sont les co-inventeurs de technologies liées aux capteurs de maintien du pied à base de papier. Y.G., S.C. et K.P. sont les cofondateurs de LSK Technologies, Inc. et sont les co-inventeurs des technologies liées au PLUM. M.K., K.P. et A.A.G. sont les cofondateurs d’En Carta Diagnostics Ltd. Les autres auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts. Brevets : Dispositif PLUM : La demande de brevet Y.G., S.C. et K.P. a été déposée par l’Université de Toronto et attribuée à LSK Technologies Inc. U. S. Provisional Patent Application No. 62/982,323 déposée le 27 février 2020; Toehold switch patent: A.A.G., P.Y., et J.J. C. « Riboregulator compositions and methods of use », Brevet. WO2014074648A3 déposé le 6 novembre 2012; Brevet de diagnostic sur papier : K.P. et J.J.C. « Paper-based synthetic gene networks » Brevet américain en instance No. US15/963,831 déposé le 6 décembre 2013; Zika patent 1 : K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., et J.J.C., « Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform », U. S. Provisional Patent Application No. 62/403,778 déposée le 4 octobre 2016 ; Zika patent 2 : K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., et J.J.C., « Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform », U. S. Provisional Patent Application No. 62/341,221 déposée le 25 mai 2016.

Le système combiné sur papier décrit ici peut apporter des diagnostics moléculaires cliniquement pertinents, avec des performances fonctionnellement comparables à la RT-qPCR, au point de besoin6. Il est important de noter que pour les paramètres distants, la disponibilité des diagnostics sur site peut réduire le délai d’obtention des résultats de plusieurs jours à quelques heures. Soulignant la programmabilité de cette approche, le pipeline qui a été décrit peut être utilisé pour détecter pratiquement n’importe quelle cible pathogène. Nous avons associé les outils moléculaires à un lecteur de plaques portable spécialement conçu, compact et compatible avec le fonctionnement sur batterie (8 à 9 h) et fournissant une analyse de données embarquée pour permettre des applications distribuées. Dans d’autres travaux, nous avons validé le matériel combiné et la plateforme de diagnostic du virus Zika avec 268 échantillons de patients, en parallèle avec la RT-qPCR, et avons trouvé une précision diagnostique de 98,5 %24. Ensemble, notre objectif est de permettre le transfert de technologie de cette plateforme aux chercheurs afin qu’elle puisse être réutilisée et améliorée par la communauté pour répondre aux besoins diagnostiques non satisfaits.
Le processus de conception de l’interrupteur in silico a été intégré et automatisé dans un pipeline qui peut être divisé en trois étapes. La première étape génère un pool de conceptions d’interrupteurs de maintien qui s’hybrident à la séquence cible par incréments de nucléotides. La deuxième étape examine la structure secondaire et la disponibilité de l’interrupteur de maintien et élimine les capteurs avec des codons d’arrêt prématurés dans le cadre. Une fonction de notation qui prend en compte plusieurs facteurs (par exemple, le niveau de défaut de l’interrupteur de maintien du pied, la disponibilité du commutateur de maintien du pied et l’accessibilité du site cible) est ensuite mise en œuvre pour sélectionner les conceptions de l’interrupteur de maintien du pied supérieur en fonction des scores globaux. Dans la dernière étape, une liste de séquences est générée pour les conceptions d’interrupteurs de maintien du pied supérieur et leurs déclencheurs cibles correspondants. Les séquences de capteurs supérieurs doivent être examinées pour leur spécificité par rapport au transcriptome humain et aux génomes viraux étroitement apparentés à l’aide de NCBI/Primer-BLAST25. Il est également recommandé de filtrer les sites cibles des capteurs pour la conservation des séquences dans le génome viral Zika afin de s’assurer que les capteurs fourniront une détection large et robuste. Plusieurs versions du logiciel de conception d’interrupteurs de maintien ont été développées et l’algorithme de conception permet aux utilisateurs de générer deux versions, soit les commutateurs de maintien de la série A 6 ou de la série B6. Dans cet article, l’accent a été mis sur la conception de l’interrupteur de maintien de la série B.
Après la synthèse commerciale de l’ADN, les interrupteurs de maintien peuvent être rapidement assemblés, puis testés en effectuant un criblage initial contre une séquence de déclenchement cible synthétique qui correspond à des régions courtes (200-300 nt) du génome cible. Pour analyser les performances des capteurs basés sur un interrupteur à pied, il est idéal d’ajouter la séquence cible sous forme d’ARN. Dans cet article, les étapes nécessaires pour ajouter de l’ARN déclencheur transcrit in vitro ont été décrites. Cependant, s’ils sont disponibles, des modèles de génome complets tels que des extraits d’ARN viral quantifiés ou des génomes ou des étalons d’ARN synthétiques commerciaux peuvent être utilisés. L’utilisation de génomes d’ARN pleine longueur pour le criblage initial de l’interrupteur de maintien est bénéfique, car elle peut indiquer si des facteurs supplémentaires, tels que la structure secondaire de l’ARN, affecteront les performances du capteur. Pour optimiser le rapport ON/OFF des commutateurs candidats, l’ADN de l’interrupteur de maintien peut être titré dans la réaction acellulaire. Cette étape peut également servir à identifier les commutateurs de maintien du pied très performants (amplification du pli ou rapport ON/OFF élevé) et à omettre les commutateurs de maintien du pied qui fuient (signal élevé en l’absence de l’ARN cible) des étapes de caractérisation en aval.
Pour améliorer la limite de détection des candidats les plus performants, la NASBA est utilisée pour augmenter les concentrations cliniquement pertinentes d’ARN viral Zika cible à un niveau pouvant être détecté par les commutateurs de maintien6. Différentes combinaisons d’ensembles d’amorces avant et arrière sont examinées pour déterminer les meilleures combinaisons d’amorces et de commutateurs de maintien NASBA pour permettre la détection à des concentrations cliniquement pertinentes. Une fois qu’une combinaison idéale d’amorces et d’interrupteur de maintien a été identifiée, le test passe à la validation clinique. Il est important de noter que l’interrupteur de maintien du pied et les étapes de criblage NASBA peuvent nécessiter beaucoup de main-d’œuvre et de ressources et, par conséquent, le développement de tests est mieux adapté aux sites de recherche dotés de ressources suffisantes. Bien que nous n’ayons pas appliqué l’automatisation des processus, il est probable que cela pourrait accélérer le cycle itératif de conception, de construction et de test32. Heureusement, le délai d’exécution entre la conception et les tests des capteurs et le déploiement peut être remarquablement court (moins d’une semaine), ce qui rend cette stratégie idéale pour les situations urgentes, telles que les épidémies6.
Même après le développement d’un biocapteur présentant une sensibilité cliniquement pertinente, des défis techniques doivent être relevés. Étant donné que ce protocole implique une opération manuelle et qu’il s’agit d’une procédure en plusieurs étapes, il existe un risque de contamination croisée entre les échantillons. Nous faisons de notre mieux pour réduire ce risque grâce à des pratiques de laboratoire prudentes. Lors d’un essai clinique récent portant sur 268 échantillons de patients, nous n’avons rencontré aucun problème de contamination; Cependant, il s’agit d’une considération importante24. Dans cet esprit, le protocole reste un test de laboratoire et nécessite un utilisateur qualifié maîtrisant les techniques de biologie moléculaire appropriées. Une considération supplémentaire pour le déploiement est l’isolement de l’ARN à partir d’échantillons de patients. Nous décrivons ici l’isolement de l’ARN à l’aide de kits d’extraction d’acides nucléiques à base de colonnes. Cependant, dans d’autres travaux, nous avons démontré une méthode de lyse par ébullition efficace et simple (95 °C pendant 2 min) pour le traitement d’échantillons de patients à faible charge6. Cette stratégie élimine presque les coûts associés à l’extraction de l’ARN et évite l’utilisation de kits d’extraction d’acides nucléiques à base de colonnes, ce qui peut poser un défi logistique dans les milieux à faibles ressources ou les problèmes de chaîne d’approvisionnement lors de crises, telles que la pandémie de COVID-1933.
Comme nous l’avons vu pendant la pandémie de COVID-19, les instruments utilisés pour effectuer la RT-qPCR peuvent eux-mêmes servir de goulot d’étranglement et limiter l’accès des patients aux tests. Ce facteur, qui est aussi largement financier, conduit à un mode de test centralisé qui peut limiter l’accès au diagnostic. Par exemple, lors de l’épidémie de Zika de 2015-2016, seuls cinq laboratoires de référence nationaux étaient disponibles au Brésil, ce qui a entraîné des retards dans les tests des patients. Sans tenir compte de l’avantage potentiel des économies d’échelle, le coût actuel des marchandises pour le lecteur de plaques portable est de ~ 500 USD, ce qui, même s’il est multiplié par cinq pour tenir compte de la main-d’œuvre et de la marge commerciale, fournit toujours un instrument abordable. Cela se compare bien aux instruments RT-qPCR dont le coût varie de 15 000 $ à 90 000 $34 USD. En outre, le coût estimé par test pour le test sans cellules en Amérique latine est d’environ 5,48 USD, tandis que le coût par test de RT-qPCR au Brésil était de ~ 10-11 USD au moment de l’épidémie de Zika36. Au-delà du coût de l’équipement, le lecteur de plaques portable a un faible encombrement (20 cm3), une analyse automatique, le téléchargement de données dans le cloud via Internet et peut fonctionner sur batterie. Ces caractéristiques élargissent considérablement les paramètres potentiels où les tests peuvent être déployés et élargissent simultanément la population de patients pouvant être servis.
À ce jour, les plateformes commerciales CFPS d’E. coli les plus courantes sont les systèmes S30 et PURE37; Cependant, une considération clé pour améliorer l’accès aux diagnostics dans les pays à revenu faible ou intermédiaire est la disponibilité limitée de ces réactifs au niveau national. Une étape importante vers la résolution de ce défi est le développement de la production locale de CFPS. Le laboratoire Federici a récemment fait des progrès significatifs dans le développement d’une plate-forme non commerciale pour mettre en œuvre des capteurs basés sur des commutateurs de maintien dans des systèmes sans cellules à base de lysat, atteignant une LOD de 2,7 fM avec l’ARN14 du virus Zika. Non seulement cette réalisation permet aux réactifs d’être fabriqués dans le pays d’utilisation, en évitant les tarifs d’importation et les retards, mais les coûts de main-d’œuvre s’adaptent également aux taux locaux et le coût global peut donc être considérablement réduit. Dans les travaux décrits par le groupe Federici, le coût de production de la réaction d’expression CFPS (5 μL) au Chili était de 6,9 cents (USD) 35,38, fournissant une double incitation (amélioration de la logistique et des coûts) pour la mise en œuvre de systèmes à base de lysat 35,38.
Le placement de tests comparables à la RT-qPCR dans des réseaux de diagnostic distribués pourrait apporter des avantages significatifs par rapport aux pratiques actuelles qui dépendent du transport des échantillons vers des installations centralisées de RT-qPCR. Dans les milieux périurbains, où les cas de Zika étaient concentrés, la distance physique entre un patient et l’établissement de diagnostic ralentit le diagnostic et augmente le risque que les résultats n’atteignent pas le patient à un moment cliniquement pertinent. Nous espérons que les travaux présentés ici contribueront à permettre à la communauté des chercheurs, grâce au transfert de connaissances, de créer des biotechnologies décentralisées et du matériel portable pour la santé humaine, l’agriculture et la surveillance de l’environnement.

La RT-qPCR est restée la technologie de référence pour le diagnostic clinique en raison de son excellente sensibilité et spécificité. Bien que très robuste, la méthode dépend d’équipements et de réactifs coûteux et spécialisés qui nécessitent une distribution et un stockage à température contrôlée. Cela présente des obstacles importants à l’accessibilité de diagnostics de qualité à l’échelle mondiale, en particulier en période d’épidémies et dans les régions où l’accès à des laboratoires bien équipés est limité 1,2. Cela a été observé lors de l’épidémie de virus Zika de 2015-2016 au Brésil. Avec seulement cinq laboratoires centralisés disponibles pour fournir des tests RT-qPCR, des goulots d’étranglement importants en ont résulté, limitant l’accès aux diagnostics. Cela a été particulièrement difficile pour les personnes vivant en milieu périurbain, qui ont été plus gravement touchées par l’éclosion3,4. Dans le but d’améliorer l’accès aux diagnostics, le protocole présente une plate-forme qui a été développée avec le potentiel de fournir des diagnostics décentralisés, peu coûteux et à haute capacité dans les environnements à faibles ressources. Dans ce cadre, un pipeline de découverte diagnostique a été établi, couplant l’amplification isotherme et les capteurs basés sur des commutateurs à ARN synthétique avec des systèmes d’expression sans cellules à base de papier 5,6.
Les systèmes de synthèse de protéines acellulaires (CFPS), en particulier les systèmes sans cellules à base d’E. coli, constituent une plate-forme attrayante pour un large éventail d’applications de biodétection, de la surveillance environnementale7,8 au diagnostic des agents pathogènes 5,6,9,10,11,12 . Comprenant les composants nécessaires à la transcription et à la traduction, les systèmes CFPS présentent des avantages significatifs par rapport aux biocapteurs à cellules entières. Plus précisément, la détection n’est pas limitée par une paroi cellulaire et, en général, ils sont de conception modulaire, biosûrs, peu coûteux et peuvent être lyophilisés pour une utilisation portable. La capacité de lyophiliser des réactions basées sur des circuits génétiques sur des substrats tels que le papier ou les textiles permet le transport, le stockage à long terme à température ambiante5 et même l’incorporation dans la technologie portable13.
Des travaux antérieurs ont démontré que les systèmes acellulaires d’E. coli peuvent être utilisés pour détecter de nombreux analytes, par exemple, des métaux toxiques tels que le mercure, des antibiotiques tels que la tétracycline7,14, des perturbateurs endocriniens15,16, des biomarqueurs tels que l’acide hippurique 17, des molécules de détection du quorum associées aux agents pathogènes 9,18 et des substances illicites telles que la cocaïne 17 et le gamma-hydroxybutyrate (GHB)19 . Pour la détection spécifique de la séquence des acides nucléiques, les stratégies ont pour la plupart reposé sur l’utilisation de biocapteurs à commutation couplés à des techniques d’amplification isotherme. Les interrupteurs Toehold sont des riborégulateurs synthétiques (également appelés simplement « commutateurs » dans le reste du texte) qui contiennent une structure en épingle à cheveux qui bloque la translation en aval en séquestrant le site de liaison ribosomique (RBS) et le codon de départ. Lors de l’interaction avec leur ARN déclencheur cible, la structure en épingle à cheveux est soulagée et la traduction ultérieure d’un cadre de lecture ouvert rapporteur est activée20.
L’amplification isotherme peut également être utilisée comme diagnostic moléculaire21 ; cependant, ces méthodes sont sujettes à une amplification non spécifique, ce qui peut réduire la spécificité et donc la précision du test en dessous de celle de la RT-qPCR 22. Dans les travaux rapportés ici, l’amplification isotherme en amont des capteurs à commutation a été utilisée pour fournir une amplification combinée du signal qui permet une détection cliniquement pertinente des acides nucléiques (femtomolaire à attomolaire). Ce couplage des deux méthodes fournit également deux points de contrôle spécifiques à la séquence qui, combinés, offrent un haut niveau de spécificité. En utilisant cette approche, des travaux antérieurs ont démontré la détection de virus tels que Zika6, Ebola5, Norovirus 10, ainsi que de bactéries pathogènes telles que C. difficile23 et Typhoïde12 résistant aux antibiotiques. Plus récemment, des interrupteurs de maintien sans cellules ont été démontrés pour la détection du SRAS-CoV-2 dans le but de fournir des diagnostics accessibles pour la pandémie de COVID-19 11,12,13.
Le protocole suivant décrit le développement et la validation du test de prise de pied synthétique sans cellule à base de papier pour la détection du virus Zika, de la conception de biocapteurs in silico , en passant par les étapes d’assemblage et d’optimisation, jusqu’à la validation sur le terrain avec des échantillons de patients. Le protocole commence par la conception in silico de capteurs basés sur des commutateurs à ARN et d’amorces d’amplification isotherme spécifiques de l’ARN viral Zika. Bien qu’il existe de nombreuses méthodes d’amplification isotherme, l’utilisation de l’amplification basée sur la séquence d’acide nucléique (NASBA) pour augmenter la concentration de la cible d’ARN viral présente dans la réaction, permettant une sensibilité cliniquement significative a été démontrée. En pratique, les méthodes d’amplification isotherme ont l’avantage de fonctionner à une température constante, éliminant ainsi le besoin d’équipements spécialisés, tels que les thermocycleurs, qui sont généralement limités à des emplacements centralisés.
Ensuite, le processus d’assemblage des capteurs synthétiques de l’interrupteur de maintien avec des séquences de codage de rapporteur par PCR d’extension de chevauchement, et le criblage des capteurs synthétiques de l’interrupteur de maintien du pied pour une performance optimale dans les systèmes sans cellules utilisant de l’ARN synthétique est décrit. Pour cet ensemble de capteurs du virus Zika, nous avons sélectionné le gène lacZ codant pour l’enzyme β-galactosidase, capable de cliver un substrat colorimétrique, le chlorophénol rouge-β-D-galactopyranoside (CPRG), pour produire un changement de couleur jaune à violet qui peut être détecté à l’œil nu ou avec un lecteur de plaque. Une fois que les commutateurs synthétiques les plus performants sont identifiés, le processus de criblage des amorces pour l’amplification isotherme basée sur la séquence d’acide nucléique de la séquence cible correspondante à l’aide d’ARN synthétique pour trouver les ensembles qui offrent la meilleure sensibilité est décrit.
Enfin, les performances de la plateforme de diagnostic sont validées sur site en Amérique latine (Figure 1). Pour déterminer la précision du diagnostic clinique, le test acellulaire sur papier est effectué à l’aide d’échantillons de virus Zika provenant de patients; en parallèle, un test RT-qPCR de référence est effectué à des fins de comparaison. Pour surveiller les tests colorimétriques sans cellules, nous permettons la quantification sur site des résultats dans les régions où les thermocycleurs ne sont pas disponibles. Le lecteur de plaques assemblé à la main appelé Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; ci-après dénommé lecteur de plaques portable) est également présenté ici24. Initialement développé comme un dispositif compagnon pour le diagnostic de l’interrupteur synthétique sans cellule, le lecteur de plaques portable offre un moyen accessible d’incuber et de lire les résultats de manière à haut débit, fournissant une analyse logicielle intégrée basée sur la vision par ordinateur pour les utilisateurs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Figure 1 : Flux de travail pour tester des échantillons de patients à l’aide de réactions d’interrupteur de maintien sans cellules à base de papier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

L’accès à des diagnostics moléculaires à faible charge qui peuvent être déployés dans la communauté pour les tests est de plus en plus important et a des implications significatives plus larges pour le bien-être des sociétés et la stabilité économique. Ces dernières années, plusieurs nouvelles modalités de diagnostic isotherme ont émergé pour répondre au besoin de diagnostics moléculaires rapides et peu coûteux. Nous avons contribué à cet effort par le développement et la validation par les patients de diagnostics basés sur l’interrupteur de maintien du pied, y compris les diagnostics pour les virus Zika et chikungunya transmis par les moustiques, qui ont fourni des performances comparables aux tests de référence basés sur la transcription inverse-amplification en chaîne de la polymérase quantitative (RT-qPCR). Ces diagnostics sont peu coûteux à développer et à fabriquer, et ils ont le potentiel de fournir une capacité de diagnostic aux environnements à faibles ressources. Ici, le protocole fournit toutes les étapes nécessaires au développement d’un test basé sur un commutateur pour la détection du virus Zika. L’article guide les lecteurs tout au long du processus de développement diagnostique par étapes. Premièrement, les séquences génomiques du virus Zika servent d’intrants pour la conception informatique de commutateurs candidats à l’aide de logiciels libres. Ensuite, l’assemblage des capteurs pour le criblage empirique avec des séquences d’ARN synthétiques et l’optimisation de la sensibilité diagnostique est montré. Une fois terminée, la validation est effectuée avec des échantillons de patients en parallèle avec RT-qPCR et un lecteur optique spécialement conçu, PLUM. Ce travail fournit une feuille de route technique aux chercheurs pour le développement de capteurs à faible coût basés sur des interrupteurs à pied pour des applications dans les domaines de la santé humaine, de l’agriculture et de la surveillance de l’environnement.

Suite au pipeline de conception informatique, la construction de trois interrupteurs de maintien a été effectuée par PCR. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose (figure 2). La présence d’une bande claire d’environ 3 000 pb, à peu près la taille du gène lacZ couplé à un interrupteur de maintien du pied, indique généralement une réaction réussie. Alternativement, une voie sans bande, plusieurs bandes ou une bande de taille incorrecte indique un échec de la PCR. Dans le cas d’une PCR échouée, les conditions de réaction et/ou les séquences d’amorce doivent être optimisées.
Les interrupteurs de maintien assemblés ont été examinés pour évaluer chaque capteur par rapport à son ARN déclencheur transcrit in vitro respectif (Figure 3). Alors que les trois capteurs affichaient une absorbance OD570 accrue, le commutateur 27B (Figure 3A) avait la vitesse de marche la plus rapide. Les commutateurs 33B et, dans une moindre mesure, 47B ont montré une absorbance OD570 accrue en l’absence d’ARN déclencheur cible, ce qui indique que ces commutateurs possèdent une certaine activité de fond ou une fuite (Figure 3B, C) - une caractéristique non souhaitée dans un capteur candidat car elle peut réduire la spécificité. Pour identifier plus clairement le capteur présentant le rapport de signal ON/OFF le plus élevé, le changement de pli de l’absorbance OD570 a été calculé (voir informations supplémentaires section 5) et tracé (Figure 4). De cette analyse, il est clair que l’interrupteur 27B est le capteur qui a les meilleures performances avec un rapport ON/OFF d’environ 60.
La sensibilité de l’interrupteur de maintien du pied le plus performant (27B) a ensuite été évaluée en déterminant la plus faible concentration d’ARN requise pour activer l’interrupteur de maintien du pied lorsqu’il est couplé à une réaction NASBA. Le graphique illustre que les capteurs Zika les plus performants peuvent détecter l’ARN à des concentrations aussi faibles que 1,24 molécule par μL (équivalent à ~2 aM; Graphique 5).
Après l’identification et la validation du commutateur 27B, les matériaux du capteur ont été distribués aux membres de l’équipe à Recife, dans l’État de Pernambuco au Brésil. Au Brésil, la précision diagnostique clinique de la plateforme de diagnostic du virus Zika a été évaluée à l’aide d’échantillons de patients atteints du virus Zika, parallèlement à la RT-qPCR à des fins de comparaison. Pour valider la plate-forme de diagnostic Zika sur papier, le lecteur de plaques portable a été utilisé, capable d’incuber et de lire la sortie colorimétrique des capteurs à base de papier. Le changement de couleur du jaune au violet est utilisé pour identifier un échantillon positif, tandis qu’un échantillon négatif reste jaune (Figure 6). Une option supplémentaire pour visualiser les résultats générés par le lecteur de plaques portable (Figure 8) consiste à tracer la réponse colorimétrique pour chaque réaction sur papier au fil du temps. Les échantillons ont été testés en triple exemplaire et ceux qui dépassaient le seuil (ligne rouge fixée à 1) ont été considérés comme positifs, tandis que les échantillons inférieurs au seuil ont été considérés comme négatifs (figure 6 et figure 7).
Enfin, pour évaluer et comparer les performances cliniques du capteur de maintien du pied Zika avec la méthode de référence actuelle pour diagnostiquer l’infection par le virus Zika, tous les échantillons de patients ont été testés en parallèle avec la RT-qPCR. Le diagramme d’amplification de deux échantillons représentatifs de patients a été testé en triple exemplaire pour la détection du virus Zika par RT-qPCR (Figure 9). Les échantillons sont considérés comme positifs lorsque la valeur du seuil de cycle (Ct) est de ≤38; la ligne rouge indique un échantillon positif et la ligne bleue indique un échantillon négatif pour le virus Zika.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Figure 2 : Électrophorèse sur gel d’agarose pour évaluer la qualité des produits de PCR. Les produits PCR sont analysés sur un gel d’agarose à 1% dans 1X TAE, fonctionnant à 80 V pendant 90 min. Une seule bande claire indique généralement une réaction réussie. Voie 1 : échelle d’ADN de 1 kb ; Voies 2-4: ADN de commutateur 27B, ADN de déclenchement 33B et ADN de déclenchement 47B, respectivement. Les chiffres sur le côté gauche représentent la taille de la bande en pb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Figure 3 : Prototypage de trois interrupteurs de maintien pour les capteurs Zika sur papier. La performance de trois capteurs de prise d’orteil à ARN à base de papier a été mesurée à 37 °C pendant plus de 130 minutes. Chaque graphique contient deux traces, l’une représente le contrôle de commutateur uniquement, tandis que l’autre représente le commutateur et le déclencheur. Les trois graphiques représentent les données acquises à l’aide des capteurs de commutation 27B (A), 33B (B) et 47B (C). Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (MEB) de trois répétitions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Figure 4 : Les capteurs les plus performants sont identifiés en calculant la variation de pli de l’absorbance à 570 nm. Le changement de pli (ou rapport ON/OFF maximal) est calculé en mesurant le rapport d’absorbance (OD570) à 130 min entre la commande de l’interrupteur uniquement et le test CFPS interrupteur plus déclenchement. Les barres d’erreur représentent le MEB à partir de trois réplications. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Figure 5 : Évaluation de la sensibilité du commutateur le plus performant. L’ARN Zika transcrit in vitro est titré en réactions NASBA. Après une incubation de 1 h, les réactions ont été ajoutées aux réactions PURExpress acellulaires sur disques papier dans un rapport de 1:7. Le changement de pli après 130 min à 37 °C est tracé. Ce chiffre a été reproduit à partir de24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Figure 6 : Page de capture du lecteur de plaques portable chargée avec les données d’image capturées. Cette figure montre un exemple d’image de l’image finale capturée par le lecteur de plaques portable lors d’une collecte de données. L’horodatage d’origine est visible en haut de l’image. La couleur jaune indique un contrôle ou des réactions négatives, et la couleur violette indique une réaction positive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Figure 7 : Mode d’analyse des données. Sur la gauche, les utilisateurs sélectionnent les ensembles de données qu’ils souhaitent tracer ; Les graphiques sont ensuite affichés à droite avec des couleurs uniques pour chaque échantillon ou jeu de contrôle. La ligne rouge pointillée sert de seuil pour déterminer les échantillons positifs et négatifs. Les échantillons testés en triple exemplaire qui dépassent le seuil sont considérés comme positifs, tandis que les échantillons en dessous du seuil sont considérés comme négatifs. Les barres d’erreur représentent l’écart-type (ET) de trois répétitions. Ctrl 1 à Ctrl 5 indique les contrôles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Graphique 8. PLUM, un lecteur de plaques portable. Ce lecteur de plaques portable agit comme un laboratoire dans une boîte et sert de lecteur de plaques à température contrôlée pour incuber et surveiller les réactions colorimétriques. Cet appareil portable peut fournir des mesures quantitatives et à haut débit des capteurs Zika sur papier sur site. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Figure 9 : Graphique RT-qPCR de l’amplification de deux échantillons de patients testés en triple exemplaire pour la détection du virus Zika. Les échantillons sont considérés comme positifs lorsque la valeur du seuil de cycle (Ct) est de ≤38. La ligne pointillée rouge sert de seuil pour déterminer les échantillons positifs et négatifs. La trace rouge indique un échantillon positif et la trace bleue indique un échantillon négatif. La valeur ΔRn (delta Rn) représente l’amplitude normalisée du signal de fluorescence détecté par l’instrument RT-qPCR pour tous les échantillons testés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier du protocole supplémentaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Chiffres supplémentaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ces chiffres.</a>

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Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

L’accès à des diagnostics décentralisés, peu coûteux et à haute capacité qui peuvent être déployés dans la communauté pour des tests décentralisés est essentiel pour lutter contre les crises sanitaires mondiales. Ce manuscrit décrit comment construire des diagnostics sur papier pour les séquences d’ARN viral qui peuvent être détectées avec un lecteur optique portable.

Étude de conception à mise en œuvre pour le développement et la validation par le patient de diagnostics de commutation de maintien à pied sur papier

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Notre protocole décrit la conception, l’assemblage et la validation de diagnostics basés sur des circuits génétiques. Ces diagnostics moléculaires sur papier sont peu coûteux et sensibles, capables de détecter des concentrations cliniquement pertinentes d’acides nucléiques et peuvent être conçus pour détecter pratiquement n’importe quelle séquence. Il s’agit d’une technologie de plate-forme qui peut être conçue par les utilisateurs pour leurs besoins et qui a le potentiel d’apporter des diagnostics de qualité clinique dans des contextes de ressources dentaires plus décentralisés.Le capteur de commutation sans cellule peut être conçu pour pratiquement toutes les cibles à base d’acides nucléiques. Des travaux récents ont démontré des diagnostics acellulaires pour Ebola, les norovirus, le SRAS-CoV-2, C. difficile et les bactéries causant la typhoïde. Severino Jefferson Rivero da Silva, boursier postdoctoral, et Pouriya Bayat, doctorant de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Pour concevoir l’interrupteur de maintien du pied, identifiez les séquences cibles du génome du virus Zika et choisissez les séquences cibles du virus Zika parmi les amplicons comme décrit dans le protocole texte. Téléchargez le progiciel de conception de l’interrupteur de maintien du pied. Ouvrez MATLAB et accédez au dossier du logiciel de conception.Entrez les séquences cibles dans le fichier csv du fichier d’entrée de conception situé dans le sous-dossier d’entrée. Sélectionnez les paramètres à utiliser pour la fonction de conception. Exécutez la fonction de conception pour générer les conceptions d’interrupteur de maintien pour les cibles d’intérêt.Une fois terminé, accédez au dossier final_designs et localisez les séquences de conception du commutateur d’arrêt supérieur et les séquences cibles correspondantes dans des feuilles de calcul au format csv. Assurez-vous que les séquences d’ADN de l’interrupteur de maintien générées par l’algorithme contiennent les séquences promotrices T7 à l’extrémité principale cinq et une séquence de liaison nucléotidique 21 conservée à l’extrémité des trois premières. Utilisez NCBI BLAST pour analyser les séquences de conception de l’interrupteur de maintien du pied supérieur contre d’autres virus courants en vérifiant l’homologie des séquences.Acceptez les séquences avec moins de 40% d’hémologie. Préparer des solutions d’oligos d’ADN en épingle à cheveux et d’amorces d’amplification inverse à une concentration de 10 micromolaires dans de l’eau exempte de nucléase. Assembler les réactions dans des tubes de PCR sur glace selon ce tableau.Placez les tubes de réaction dans un thermocycleur, en suivant les conditions de cyclage indiquées dans ce tableau. Analysez les produits PCR sur un gel d’agarose. Purifier les produits de PCR et éluer l’ADN dans un volume minimal d’eau exempte de nucléases pour assurer une concentration suffisamment élevée.Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Préparer une solution mère CPRG en dissolvant 25 milligrammes de poudre dans un millilitre d’eau sans nucléase. Préparez un mélange principal sur glace selon le protocole standard illustré ici.Distribuer le mélange-maître sans cellules dans des tubes PCR. Pour les commandes sans cellules et les commandes de commutation seules, ajoutez de l’eau sans nucléase à un volume de 5,94 microlitres. Et pour la réaction, ajoutez de l’ADN de commutateur de maintien purifié par PCR pour obtenir une concentration finale de 33 nanomolaires.Pour tester l’interrupteur de maintien et la combinaison d’ARN cible, ajoutez in vitro de l’ARN cible transcrit à une concentration finale d’une micromolaire. Bien mélanger toutes les réactions en pipetant et en centrifugeant brièvement. Sur une plaque noire à fond clair de 384 puits, ajoutez 30 microlitres d’eau exempte de nucléases aux puits entourant les puits de réaction.Ensuite, à l’aide d’un poinçon de biopsie de deux millimètres et d’une pince à épiler, coupez les disques de papier filtre bloqués par BSA et placez-les dans les puits de réaction. Distribuer 1,8 microlitre de chaque tube de réaction sur les disques de papier filtre dans la plaque de 384 puits en trois exemplaires. Couvrez la plaque avec un film PCR transparent et placez-la dans un lecteur de plaques.Mesurez l’absorbance à 570 nanomètres à 37 degrés Celsius toutes les minutes pendant 130 minutes. Préparer une solution mère de 25 micromolaires de tous les ensembles d’amorces avant et arrière dans de l’eau sans nucléase. Configurez une réaction de cinq microlitres à l’aide du mélange principal illustré ici.Mélanger par pipetage jusqu’à ce que le précipité blanc se solubilise, puis distribuer dans des tubes de PCR. Ajouter les amorces avant et arrière aux tubes appropriés, puis ajouter un microlitre d’eau sans nucléase ou deux images d’ARN déclencheur cible. Mélanger par pipetage doux et faire tourner brièvement les tubes.Configurez le protocole d’incubation sur un thermocycleur comme illustré ici. Après 12 minutes, retirez les tubes et ajoutez 1,25 microlitre du mélange d’enzymes dans chaque tube, puis mélangez et centrifugez. Remettez les tubes dans le thermocycleur après avoir sauté l’étape de maintien de 41 degrés Celsius pour commencer l’incubation de réaction d’une heure.Ensuite, pour évaluer les performances de l’amorce, assemblez les réactions de l’interrupteur sans pile à base de papier et analysez les données. Pour l’analyse de sensibilité, identifier les paires d’amorces candidates et préparer des dilutions en série de l’ARN cible dans de l’eau exempte de nucléase. Répétez la NASBA et les réactions acellulaires avec les ensembles d’amorces sélectionnés en triplicates biologiques.À l’aide d’un microlitre d’ARN de patient extrait, effectuez l’amplification NASBA et les réactions sans cellules à base de papier, comme indiqué à la section cinq. Après les réactions, préparer la plaque de réaction à 384 puits et exécuter le test dans un lecteur de plaque portable à 37 degrés Celsius. Assemblez ensuite les composants RT-qPCR et ajoutez les réactifs dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre selon ce tableau.Mélanger la réaction par pipetage. Distribuer 6,5 microlitres dans chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits ou 384 puits, suivis de 3,5 microlitres de chaque matrice d’ARN en trois exemplaires. Placez un film PCR sur le dessus de la plaque.Centrifuger la plaque de 384 puits à 600 fois G pendant deux minutes. Placez la plaque dans une machine RT-qPCR et exécutez les conditions de cyclage comme indiqué ici. Après la conception informatique, trois interrupteurs de maintien ont été construits et analysés à l’aide d’électrophorèse sur gel d’agarose.Une bande d’environ 3 000 paires de bases indiquait une réaction réussie. Les interrupteurs de maintien ont été évalués par rapport à leur ARN déclencheur transcrit in vitro respectif. Alors que les trois capteurs affichaient une augmentation de l’absorbance, le capteur 27B avait le taux de démarrage le plus rapide, tandis que les commutateurs 33B et 47B avaient un rapport marche/arrêt plus faible, indiquant une activité de fond et une spécificité réduite.Le changement de pli de l’absorbance à 570 nanomètres a montré que l’interrupteur 27B a les meilleures performances avec un rapport de signal marche/arrêt. De plus, lorsqu’il est couplé à la NASBA, il peut détecter l’ARN à des concentrations aussi faibles que 124 molécules par microlitre, ce qui indique une sensibilité élevée. Des échantillons de patients atteints du virus Zika du Brésil ont été testés pour évaluer la précision diagnostique clinique des capteurs à l’aide d’un lecteur de plaque portable.Un changement de couleur du jaune au violet a permis d’identifier un échantillon positif. La réponse colorimétrique pour chaque réaction sur papier a été tracée au fil du temps par le logiciel intégré sur le lecteur de plaques portable PLUM. Les échantillons qui dépassaient le seuil ont été considérés comme positifs.Les performances cliniques du capteur ont été établies par comparaison avec la RT-qPCR. Les échantillons ont été considérés comme positifs lorsque la valeur seuil du cycle était égale ou inférieure à 38. Il est important de s’assurer que les résultats des écrans de commutation et de la sensibilité de l’amorce NASBA sont reproductibles et optimisés avant de passer aux essais sur les patients.Compte tenu de sa simplicité et de son adaptabilité, la plateforme de diagnostic décrite ici a ouvert la voie au développement de nouveaux outils au point de service qui peuvent apporter des avantages au système de santé, en particulier pour les pays à faible revenu.

Research

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