Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
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Die Autoren danken allen Mitgliedern der Green-, Pardee- und Pena-Labore sowie allen Co-Autoren früherer Manuskripte, die sich auf die in diesem Manuskript offenbarte Arbeit beziehen. S.J.R.d.S. wurde durch ein PhD-Stipendium der Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasilien, Referenznummer IBPG-1321-2.12/18, unterstützt und wird derzeit durch ein Postdoc-Stipendium der University of Toronto, Kanada, unterstützt. P.B. wird durch den William Knapp Buckley Award der Fakultät für Pharmazie der University of Toronto unterstützt. M.K. wurde von der Precision Medicine Initiative (PRiME) an der University of Toronto mit der internen Fellowship-Nummer PRMF2019-002 unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Mittel an K.P aus dem Canada Research Chairs Program (Dateien 950-231075 und 950-233107), den Major Research Project Management Fund der University of Toronto, das CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469) und an L.P, A.A.G. und K.P durch den CIHR/IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783) sowie durch Mittel an K.P. vom kanadischen International Development Research Centre (Zuschuss 109434-001) über die Canadian 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Diese Arbeit wurde auch durch Mittel an A.A.G. von einem Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), der Gates Foundation (OPP1160667), einem NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), einem NIH R21 Award (1R21AI136571-01A1) an K.P. / A.A.G und einem Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108) unterstützt. Abbildung 1 wurde mit Biorender.com unter akademischer Lizenz an K.P.

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K.P. und A.A.G. sind Miterfinder papierbasierter Zehensensortechnologien. Y.G., S.C. und K.P. sind Mitbegründer von LSK Technologies, Inc. und Miterfinder der PLUM-bezogenen Technologien. M.K., K.P. und A.A.G. sind Mitbegründer von En Carta Diagnostics Ltd. Andere Autoren haben keine Interessenkonflikte. Patente: PLUM-Gerät: Y.G., S.C. und K.P. Die Patentanmeldung wurde von der University of Toronto eingereicht und LSK Technologies Inc. zugewiesen. U. S. Provisional Patent Application No. 62/982,323, eingereicht am 27. Februar 2020; Zehenschalterpatent: A.A.G., P.Y. und J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Patent. WO2014074648A3 eingereicht am 6. November 2012; Papierbasiertes diagnostisches Patent: K.P. und J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" U.S. Patent angemeldet Nr. US15/963.831, eingereicht am 6. Dezember 2013; Zika-Patent 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. und J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 62/403,778, eingereicht am 4. Oktober 2016; Zika-Patent 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. und J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 62/341,221, eingereicht am 25. Mai 2016.

Das hier beschriebene kombinierte papierbasierte System kann klinisch relevante molekulare Diagnostik mit einer Leistung, die funktionell mit der RT-qPCR vergleichbar ist, an den Point-of-Needbringen 6. Wichtig ist, dass bei Remote-Einstellungen die Verfügbarkeit von Diagnosen vor Ort die Zeit bis zum Ergebnis von Tagen auf Stunden verkürzen kann. Um die Programmierbarkeit dieses Ansatzes hervorzuheben, kann die beschriebene Pipeline verwendet werden, um praktisch jedes Erregerziel zu erkennen. Wir haben die molekularen Werkzeuge mit einem speziell entwickelten tragbaren Plattenleser kombiniert, der kompakt und mit dem Batteriebetrieb (8-9 h) kompatibel ist und eine integrierte Datenanalyse bietet, um verteilte Anwendungen zu ermöglichen. In anderen Arbeiten haben wir die kombinierte Hardware und die Zika-Virus-Diagnoseplattform mit 268 Patientenproben parallel zur RT-qPCR validiert und eine diagnostische Genauigkeit von 98,5% gefunden24. Zusammengenommen ist es unser Ziel, den Technologietransfer dieser Plattform an Forscher zu ermöglichen, damit sie von der Gemeinschaft umfunktioniert und verbessert werden kann, um unerfüllte diagnostische Bedürfnisse zu adressieren.
Der Designprozess von In-silico-Zehenschaltern wurde in eine Pipeline integriert und automatisiert, die in drei Stufen unterteilt werden kann. Die erste Stufe erzeugt einen Pool von Zehenschalterdesigns, die in einem Nukleotidschritt zur Zielsequenz hybridisiert werden. Die zweite Stufe untersucht die Sekundärstruktur und die Verfügbarkeit von Zehenhalteschaltern und eliminiert Sensoren mit vorzeitigen Stopp-Codons im Rahmen. Eine Bewertungsfunktion, die mehrere Faktoren berücksichtigt (z. B. Fehlergrad des Zehenschalters, Verfügbarkeit des Zehengriffschalters und Zugänglichkeit des Zielstandorts), wird dann implementiert, um die besten Zehenschalterdesigns basierend auf den Gesamtergebnissen auszuwählen. In der letzten Phase wird eine Liste von Sequenzen für die oberen Zehengriffschalterdesigns und die entsprechenden Zielauslöser generiert. Die Top-Sensorsequenzen sollten unter Verwendung von NCBI/Primer-BLAST25 auf Spezifität gegen das menschliche Transkriptom und eng verwandte virale Genome untersucht werden. Es ist auch eine bewährte Methode, die Sensorzielstellen auf Sequenzkonservierung im Zika-Virusgenom zu untersuchen, um sicherzustellen, dass die Sensoren eine breite und robuste Detektion bieten. Es wurden mehrere Versionen der Zehenschalter-Designsoftware entwickelt, und der Designalgorithmus ermöglicht es Benutzern, zwei Versionen zu generieren, entweder Serie A 6 oder Serie B Zehenschalter6. In diesem Artikel lag der Fokus auf dem Design der Zehenschalter der Serie B.
Nach der kommerziellen DNA-Synthese können die Zehengriffschalter schnell zusammengesetzt und dann getestet werden, indem ein erstes Screening gegen eine synthetische Zieltriggersequenz durchgeführt wird, die kurzen Regionen (200-300 nt) des Zielgenoms entspricht. Um die Leistung von Zehenschalter-basierten Sensoren zu überprüfen, ist es ideal, die Zielsequenz in Form von RNA hinzuzufügen. In diesem Artikel wurden die Schritte beschrieben, die erforderlich sind, um in vitro transkribierte Trigger-RNA hinzuzufügen. Falls verfügbar, können jedoch vollständige Genomvorlagen wie quantifizierte virale RNA-Extrakte oder kommerzielle synthetische RNA-Genome oder -Standards verwendet werden. Die Verwendung von RNA-Genomen in voller Länge für das anfängliche Zehenschalter-Screening ist von Vorteil, da es Aufschluss darüber geben kann, ob zusätzliche Faktoren, wie die RNA-Sekundärstruktur, die Sensorleistung beeinflussen. Um das ON/OFF-Verhältnis von Kandidatenschaltern zu optimieren, kann die Toehold-Schalter-DNA in die zellfreie Reaktion titriert werden. Dieser Schritt kann auch dazu dienen, leistungsstarke Zehenhalteschalter (Faltverstärkung oder hohes ON/OFF-Verhältnis) zu identifizieren und undichte Zehenhalteschalter (hohes Signal in Abwesenheit der Ziel-RNA) aus nachgeschalteten Charakterisierungsschritten auszulassen.
Um die Nachweisgrenze der leistungsstärksten Toehold-Switch-Kandidaten zu verbessern, wird NASBA verwendet, um klinisch relevante Konzentrationen von Ziel-Zika-viraler RNA auf ein Niveau zu erhöhen, das mit Zehenschaltern nachgewiesen werden kann6. Verschiedene Kombinationen von Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Sets werden gescreent, um die besten NASBA-Primer- und Zehenhalteschalterkombinationen zu bestimmen, um eine Detektion bei klinisch relevanten Konzentrationen zu ermöglichen. Sobald eine ideale Kombination aus Primer-Set und Zehenhalteschalter identifiziert wurde, wird der Assay zur klinischen Validierung weitergeleitet. Es ist wichtig zu beachten, dass die Zehenschalter- und NASBA-Screening-Stufen arbeits- und ressourcenintensiv sein können und daher die Testentwicklung am besten für gut ausgestattete Forschungsstandorte geeignet ist. Obwohl wir keine Prozessautomatisierung angewendet haben, ist es wahrscheinlich, dass dies den iterativen Entwurfs-, Erstellungs- und Testzyklusbeschleunigen könnte 32. Glücklicherweise kann die Bearbeitungszeit vom Sensordesign und -test bis zur Bereitstellung bemerkenswert kurz sein (weniger als eine Woche), was diese Strategie ideal für zeitkritische Situationen wie Epidemieausbrüche macht6.
Auch nach der Entwicklung eines Biosensors mit klinisch relevanter Sensitivität gibt es technische Herausforderungen, die angegangen werden müssen. Da dieses Protokoll eine manuelle Bedienung erfordert und ein mehrstufiges Verfahren ist, besteht die Gefahr einer Kreuzkontamination zwischen den Proben. Wir tun unser Bestes, um dieses Risiko durch sorgfältige Laborpraxis zu verringern. In einer kürzlich durchgeführten klinischen Studie mit 268 Patientenproben traten keine Kontaminationsprobleme auf. Dies ist jedoch eine wichtige Überlegung24. Vor diesem Hintergrund bleibt das Protokoll ein Laborassay und erfordert einen erfahrenen Benutzer mit der Beherrschung der richtigen molekularbiologischen Techniken. Eine weitere Überlegung für den Einsatz ist die RNA-Isolierung aus Patientenproben. Hier beschreiben wir die RNA-Isolierung mit säulenbasierten Nukleinsäure-Extraktionskits. In anderen Arbeiten haben wir jedoch eine effektive und einfache Siedelysemethode (95 °C für 2 min) für die Probenverarbeitung von Patienten mit geringer Belastung demonstriert6. Diese Strategie eliminiert nahezu die mit der RNA-Extraktion verbundenen Kosten und vermeidet die Verwendung von säulenbasierten Nukleinsäure-Extraktionskits, die in ressourcenarmen Umgebungen oder Lieferkettenproblemen während Krisen wie der COVID-19-Pandemie eine logistische Herausforderung darstellen können33.
Wie wir während der COVID-19-Pandemie gesehen haben, können die Instrumente, die zur Durchführung der RT-qPCR verwendet werden, selbst als Engpass dienen und den Zugang der Patienten zu Tests einschränken. Dieser Faktor, der auch weitgehend finanzieller Natur ist, führt zu einem zentralisierten Testmodus, der den Diagnosezugriff einschränken kann. Während des Zika-Ausbruchs 2015/2016 standen beispielsweise nur fünf nationale Referenzlabore in Brasilien zur Verfügung, was zu Verzögerungen bei Patiententests führte. Ohne den potenziellen Nutzen von Skaleneffekten zu berücksichtigen, betragen die aktuellen Warenkosten für den tragbaren Plattenleser ~ 500 USD, was selbst wenn es um das Fünffache erhöht wird, um die Arbeits- und Handelsmarge zu berücksichtigen, immer noch ein erschwingliches Instrument darstellt. Dies ist gut vergleichbar mit RT-qPCR-Instrumenten, deren Kosten zwischen 15.000 und 90.000 USD34 liegen. Darüber hinaus betragen die geschätzten Kosten pro Test für den zellfreien Assay in Lateinamerika rund 5,48 USD, während die Kosten pro Test der RT-qPCR in Brasilien zum Zeitpunkt des Zika-Ausbruchs ~ 10-11 USD betrugen36. Neben den Kosten für die Ausrüstung hat der tragbare Plattenleser eine geringe Stellfläche (20 cm3), automatische Analyse, Datenupload in die Cloud über das Internet und kann mit Batteriestrom betrieben werden. Diese Funktionen erweitern die potenziellen Umgebungen, in denen Tests eingesetzt werden können, drastisch und erweitern gleichzeitig die Patientenpopulation, die versorgt werden kann.
Bis heute sind die gebräuchlichsten kommerziellen E. coli CFPS-Plattformen die Systeme S30 und PURE37; Ein wichtiger Aspekt bei der Verbesserung des Zugangs zu Diagnostika in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen ist jedoch die begrenzte Verfügbarkeit dieser Reagenzien im Inland. Ein wichtiger Schritt zur Lösung dieser Herausforderung ist der Ausbau der lokalen CFPS-Produktion. Das Federici-Labor hat kürzlich bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung einer nichtkommerziellen Plattform zur Implementierung von Zehenschalter-basierten Sensoren in zellfreien Systemen auf Lysatbasis erzielt und mit Zika-Virus-RNA14 eine LOD von 2,7 fM erreicht. Diese Leistung ermöglicht nicht nur, dass die Reagenzien im Einsatzland hergestellt werden, wodurch Einfuhrzölle und Verzögerungen vermieden werden, sondern die Arbeitskosten skalieren auch auf lokale Tarife, wodurch die Gesamtkosten erheblich gesenkt werden können. In der von der Federici-Gruppe skizzierten Arbeit beliefen sich die Kosten für die Herstellung der CFPS-Expressionsreaktion (5 μL) in Chile auf 6,9 Cent (USD) 35,38, was einen doppelten Anreiz (verbesserte Logistik und Kosten) für die Implementierung lysatbasierter Systeme darstellt 35,38.
Die Platzierung von RT-qPCR-vergleichbaren Tests in verteilten Diagnosenetzwerken könnte erhebliche Vorteile gegenüber den derzeitigen Praktiken bringen, die vom Transport von Proben zu zentralisierten RT-qPCR-Einrichtungen abhängen. In peri-urbanen Umgebungen, in denen Zika-Fälle konzentriert waren, verlangsamt die physische Entfernung zwischen einem Patienten und der Diagnoseeinrichtung die Diagnose und erhöht das Risiko, dass die Ergebnisse den Patienten zu einem klinisch relevanten Zeitpunkt nicht erreichen. Wir hoffen, dass die hier vorgestellte Arbeit dazu beitragen kann, dass die Forschungsgemeinschaft durch Wissenstransfer dezentrale Biotechnologien und tragbare Hardware für die Überwachung der menschlichen Gesundheit, der Landwirtschaft und der Umwelt schaffen kann.

Die RT-qPCR ist aufgrund ihrer hervorragenden Sensitivität und Spezifität der Goldstandard für die klinische Diagnostik geblieben. Obwohl das Verfahren sehr robust ist, hängt es von teuren, spezialisierten Geräten und Reagenzien ab, die eine temperaturkontrollierte Verteilung und Lagerung erfordern. Dies stellt weltweit erhebliche Hindernisse für den Zugang zu qualitativ hochwertiger Diagnostik dar, insbesondere in Zeiten von Krankheitsausbrüchen und in Regionen, in denen der Zugang zu gut ausgestatteten Labors begrenzt ist 1,2. Dies wurde während des Zika-Virus-Ausbruchs 2015/2016 in Brasilien beobachtet. Da nur fünf zentralisierte Labore für RT-qPCR-Tests zur Verfügung standen, ergaben sich erhebliche Engpässe, die den Zugang zur Diagnostik einschränkten. Dies war besonders schwierig für Personen in stadtnahen Umgebungen, die stärker vom Ausbruch betroffen waren 3,4. Um den Zugriff auf Diagnosen zu verbessern, zeigt das Protokoll eine Plattform, die mit dem Potenzial entwickelt wurde, dezentrale, kostengünstige Diagnosen mit hoher Kapazität in ressourcenarmen Umgebungen bereitzustellen. Als Teil davon wurde eine diagnostische Entdeckungspipeline eingerichtet, die isotherme Amplifikation und synthetische RNA-Switch-basierte Sensoren mit papierbasierten zellfreien Expressionssystemen 5,6 koppelt.
Zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS), insbesondere zellfreie E. coli-basierte Systeme, sind eine attraktive Plattform für eine breite Palette von Biosensoranwendungen von der Umweltüberwachung 7,8 bis zur Erregerdiagnostik 5,6,9,10,11,12 . CFPS-Systeme umfassen die für die Transkription und Translation notwendigen Komponenten und haben signifikante Vorteile gegenüber Ganzzell-Biosensoren. Insbesondere ist die Sensorik nicht durch eine Zellwand begrenzt und im Allgemeinen sind sie modular aufgebaut, biosicher, kostengünstig und können für den tragbaren Einsatz gefriergetrocknet werden. Die Fähigkeit, auf Genschaltkreisen basierende Reaktionen auf Substraten wie Papier oder Textilien gefriertrocken zu lassen, ermöglicht den Transport, die Langzeitlagerung bei Raumtemperatur5 und sogar die Integration in tragbare Technologie13.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass zellfreie E. coli-Systeme zum Nachweis zahlreicher Analyten verwendet werden können, beispielsweise toxische Metalle wie Quecksilber, Antibiotika wie Tetracyclin7,14, endokrin wirksame Chemikalien15,16, Biomarker wie Hippursäure 17, pathogenassoziierte Quorum Sensing-Moleküle 9,18 und illegale Substanzen wie Kokain 17 und Gammahydroxybutyrat (GHB)19 . Für den sequenzspezifischen Nachweis von Nukleinsäuren setzen Strategien bisher meist auf den Einsatz von schalterbasierten Biosensoren, die an isotherme Amplifikationstechniken gekoppelt sind. Toehold-Schalter sind synthetische Riboregulatoren (im Rest des Textes auch einfach als "Schalter" bezeichnet), die eine Haarnadelstruktur enthalten, die die nachgeschaltete Translation blockiert, indem sie die ribosomale Bindungsstelle (RBS) und das Startcodon sequestriert. Bei Interaktion mit ihrer Zieltrigger-RNA wird die Haarnadelstruktur entlastet und die anschließende Translation eines offenen Leserahmens des Reporters ermöglicht20.
Die isotherme Amplifikation kann auch als molekulare Diagnostik21 verwendet werden; Diese Methoden sind jedoch anfällig für unspezifische Amplifikation, was die Spezifität und damit die Genauigkeit des Tests unter die der RT-qPCR 22 reduzieren kann. In der hier berichteten Arbeit wurde die isotherme Verstärkung vor den schalterbasierten Sensoren verwendet, um eine kombinierte Signalverstärkung bereitzustellen, die einen klinisch relevanten Nachweis von Nukleinsäuren (femtomolar bis attomolar) ermöglicht. Diese Paarung der beiden Methoden bietet auch zwei sequenzspezifische Checkpoints, die in Kombination ein hohes Maß an Spezifität bieten. Mit diesem Ansatz haben frühere Arbeiten den Nachweis von Viren wie Zika6, Ebola5, Norovirus10 sowie pathogenen Bakterien wie C. difficile23 und antibiotikaresistentem Typhus12 gezeigt. In jüngster Zeit wurden zellfreie Zehenschalter für den SARS-CoV-2-Nachweis demonstriert, um eine zugängliche Diagnose für die COVID-19-Pandemiebereitzustellen 11,12,13.
Das folgende Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung von zellfreien, papierbasierten synthetischen Zehenschalter-Assays für den Zika-Virusnachweis, vom Design des In-silico-Biosensors über die Montage- und Optimierungsschritte bis hin zur Feldvalidierung mit Patientenproben. Das Protokoll beginnt mit dem In-silico-Design von RNA-Toehold-Switch-basierten Sensoren und isothermen Amplifikationsprimern, die spezifisch für die Zika-Virus-RNA sind. Obwohl zahlreiche isotherme Amplifikationsmethoden existieren, wurde hier die Verwendung von Nukleinsäuresequenz-basierter Amplifikation (NASBA) gezeigt, um die Konzentration des in der Reaktion vorhandenen viralen RNA-Ziels zu erhöhen, was eine klinisch signifikante Sensitivität ermöglicht. In der Praxis haben isotherme Verstärkungsmethoden den Vorteil, dass sie bei einer konstanten Temperatur arbeiten, wodurch die Notwendigkeit spezieller Geräte wie Thermocycler entfällt, die im Allgemeinen auf zentrale Standorte beschränkt sind.
Als nächstes wird der Prozess der Montage der synthetischen Zehenschaltersensoren mit Reportercodierungssequenzen durch Überlappungsverlängerungs-PCR und das Screening der synthetischen Zehenschaltersensoren auf optimale Leistung in zellfreien Systemen mit synthetischer RNA beschrieben. Für diesen Satz von Zika-Virussensoren haben wir das lacZ-Gen ausgewählt, das für das Enzym β-Galactosidase kodiert, das in der Lage ist, ein kolorimetrisches Substrat, Chlorphenolrot-β-D-Galactopyranosid (CPRG), zu spalten, um eine gelbe bis violette Farbänderung zu erzeugen, die mit dem Auge oder mit einem Plattenleser erkannt werden kann. Sobald die leistungsfähigsten synthetischen Schalter identifiziert sind, wird der Prozess zum Screening von Primern auf Nukleinsäuresequenz-basierte isotherme Amplifikation der entsprechenden Zielsequenz unter Verwendung synthetischer RNA beschrieben, um Sets zu finden, die die beste Empfindlichkeit bieten.
Schließlich wird die Leistung der Diagnoseplattform vor Ort in Lateinamerika validiert (Abbildung 1). Um die klinische diagnostische Genauigkeit zu bestimmen, wird der papierbasierte zellfreie Assay mit Zika-Virusproben von Patienten durchgeführt; parallel dazu wird ein Goldstandard RT-qPCR Assay zum Vergleich durchgeführt. Zur Überwachung kolorimetrischer zellfreier Assays ermöglichen wir die Vor-Ort-Quantifizierung der Ergebnisse in Regionen, in denen keine Thermocycler verfügbar sind. Der handmontierte Plattenleser namens Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; im Folgenden als tragbarer Plattenleser bezeichnet) wird hier ebenfallsvorgestellt 24. Ursprünglich als Begleitgerät für die zellfreie Diagnose synthetischer Zehenschalter entwickelt, bietet der tragbare Plattenleser eine zugängliche Möglichkeit, Ergebnisse mit hohem Durchsatz zu inkubieren und zu lesen, und bietet integrierte, auf Computer Vision basierende Softwareanalyse für Benutzer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Testung von Patientenproben mit papierbasierten zellfreien Zehengriff-Schalterreaktionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

Der Zugang zu Molekulardiagnostika mit geringer Belastung, die in der Gemeinschaft zu Testzwecken eingesetzt werden kann, wird immer wichtiger und hat weitreichende Auswirkungen auf das Wohlergehen von Gesellschaften und die wirtschaftliche Stabilität. In den letzten Jahren sind mehrere neue isotherme Diagnosemodalitäten entstanden, um dem Bedarf an schneller und kostengünstiger molekularer Diagnostik gerecht zu werden. Wir haben zu diesen Bemühungen durch die Entwicklung und Patientenvalidierung von Toehold-Switch-basierten Diagnostika beigetragen, einschließlich der Diagnostik für die durch Moskitos übertragenen Zika- und Chikungunya-Viren, die eine Leistung bieten, die mit Goldstandard-Reverse-Transkription-quantitativen Polymerase-Kettenreaktions-Assays (RT-qPCR) vergleichbar ist. Diese Diagnosen sind kostengünstig in der Entwicklung und Herstellung und haben das Potenzial, Diagnosekapazitäten für ressourcenarme Umgebungen bereitzustellen. Hier liefert das Protokoll alle notwendigen Schritte für die Entwicklung eines switchbasierten Assays zum Nachweis von Zika-Viren. Der Artikel führt die Leser durch den schrittweisen diagnostischen Entwicklungsprozess. Erstens dienen genomische Sequenzen des Zika-Virus als Eingaben für das rechnerische Design von Kandidatenschaltern unter Verwendung von Open-Source-Software. Als nächstes wird der Aufbau der Sensoren für das empirische Screening mit synthetischen RNA-Sequenzen und die Optimierung der diagnostischen Sensitivität gezeigt. Nach Abschluss der Validierung erfolgt die Validierung mit Patientenproben parallel zur RT-qPCR und einem speziell entwickelten optischen Lesegerät, PLUM. Diese Arbeit bietet Forschern eine technische Roadmap für die Entwicklung kostengünstiger Toehold-Schalter-basierter Sensoren für Anwendungen in der menschlichen Gesundheit, Landwirtschaft und Umweltüberwachung.

Im Anschluss an die Computational Design Pipeline wurde der Bau von drei Zehenhalteschaltern mittels PCR durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert (Abbildung 2). Das Vorhandensein einer klaren Bande um 3.000 bp, etwa so groß wie das lacZ-Gen , das an einen Zehenschalter gekoppelt ist, deutet typischerweise auf eine erfolgreiche Reaktion hin. Alternativ weist eine Lane ohne Band, mehrere Bänder oder ein Band der falschen Größe auf eine fehlgeschlagene PCR hin. Im Falle einer fehlgeschlagenen PCR sollten die Reaktionsbedingungen und/oder Primersequenzen optimiert werden.
Die zusammengebauten Zehenschalter wurden gescreent, um jeden Sensor anhand seiner jeweiligen in vitro transkribierten Trigger-RNA zu bewerten (Abbildung 3). Während alle drei Sensoren eine erhöhte OD570-Absorption aufwiesen, hatte der Schalter 27B (Abbildung 3A) die schnellste On-Rate. Die Schalter 33B und in geringerem Maße 47B zeigten eine erhöhte OD570-Absorption in Abwesenheit von Zieltrigger-RNA, was darauf hindeutet, dass diese Schalter eine gewisse Hintergrundaktivität oder Undichtigkeit aufweisen (Abbildung 3B, C) - ein Merkmal, das in einem Kandidatensensor nicht erwünscht ist, da es die Spezifität reduzieren kann. Um den Sensor mit dem höchsten ON/OFF-Signalverhältnis eindeutiger zu identifizieren, wurde die Faltenänderung der OD570-Absorption berechnet (siehe ergänzende Informationen Abschnitt 5) und aufgetragen (Abbildung 4). Aus dieser Analyse geht hervor, dass der Schalter 27B mit einem ON/OFF-Verhältnis von rund 60 der Sensor mit der besten Leistung ist.
Die Empfindlichkeit des leistungsstärksten Zehengriffschalters (27B) wurde dann bewertet, indem die niedrigste RNA-Konzentration bestimmt wurde, die erforderlich ist, um den Zehenhalteschalter in Verbindung mit einer NASBA-Reaktion zu aktivieren. Die Grafik zeigt, dass die leistungsfähigsten Zika-Sensoren RNA in Konzentrationen von nur 1,24 Molekülen pro μL (entspricht ~2 aM; Abbildung 5).
Nachdem Schalter 27B identifiziert und validiert war, wurden die Sensormaterialien an die Teammitglieder in Recife im brasilianischen Bundesstaat Pernambuco verteilt. In Brasilien wurde die klinische diagnostische Genauigkeit der Zika-Virus-Diagnoseplattform anhand von Zika-Virus-Patientenproben parallel zur RT-qPCR zum Vergleich bewertet. Zur Validierung der papierbasierten Zika-Diagnoseplattform wurde der tragbare Plattenleser verwendet, der in der Lage ist, die kolorimetrische Ausgabe von papierbasierten Sensoren zu inkubieren und zu lesen. Die Farbänderung von gelb zu violett wird verwendet, um eine positive Probe zu identifizieren, während eine negative Probe gelb bleibt (Abbildung 6). Eine weitere Option zur Visualisierung der vom tragbaren Plattenlesegerät generierten Ergebnisse (Abbildung 8) besteht darin, die kolorimetrische Reaktion für jede papierbasierte Reaktion im Zeitverlauf darzustellen. Die Proben wurden dreifach getestet und diejenigen, die den Schwellenwert überschritten (rote Linie auf 1 gesetzt), wurden als positiv eingestuft, während Proben unterhalb des Schwellenwerts als negativ eingestuft wurden (Abbildung 6 und Abbildung 7).
Um schließlich die klinische Leistung des Zika-Zehenschaltersensors mit der aktuellen Goldstandardmethode zur Diagnose einer Zika-Virusinfektion zu bewerten und zu vergleichen, wurden alle Patientenproben parallel zur RT-qPCR getestet. Das Amplifikationsdiagramm von zwei repräsentativen Patientenproben wurde in dreifacher Ausfertigung auf den Nachweis des Zika-Virus mittels RT-qPCR getestet (Abbildung 9). Die Proben gelten als positiv, wenn der Zyklusschwellenwert (Ct) ≤38 beträgt; Die rote Linie zeigt eine positive Probe an und die blaue Linie zeigt eine negative Probe für das Zika-Virus an.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Abbildung 2: Agarose-Gelelektrophorese zur Beurteilung der Qualität von PCR-Produkten. PCR-Produkte werden auf einem 1% igen Agarosegel in 1X TAE analysiert, das bei 80 V für 90 min betrieben wird. Ein einzelnes klares Band zeigt typischerweise eine erfolgreiche Reaktion an. Bahn 1: 1 kb DNA-Leiter; Bahnen 2-4: 27B-Schalter-DNA, 33B-Trigger-DNA bzw. 47B-Trigger-DNA. Die Zahlen auf der linken Seite stellen die Bandgröße in bp dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Abbildung 3: Prototyping von drei Zehenhalteschaltern für papierbasierte Zika-Sensoren. Die Leistung von drei papierbasierten RNA-Zehenschaltersensoren wurde bei 37 °C über 130 min gemessen. Jedes Diagramm enthält zwei Ablaufverfolgungen, von denen eine das Nur-Switch-Steuerelement darstellt, während die andere den Schalter und den Trigger darstellt. Die drei Diagramme stellen Daten dar, die mit den Zehenschaltersensoren 27B (A), 33B (B) und 47B (C) erfasst wurden. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (REM) aus drei Replikaten dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Abbildung 4: Leistungsstarke Sensoren werden durch Berechnung der Faltenänderung der Absorption bei 570 nm identifiziert. Der Faltwechsel (oder das maximale ON/OFF-Verhältnis) wird berechnet, indem das Absorptionsverhältnis (OD570) bei 130 Minuten zwischen der reinen Schaltsteuerung und dem Schalter plus Trigger-CFPS-Assay gemessen wird. Fehlerbalken stellen SEM aus drei Replikaten dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Abbildung 5: Sensitivitätsbewertung des leistungsstärksten Schalters. In vitro transkribierte Zika-RNA wird in NASBA-Reaktionen titriert. Nach einer 1 h Inkubation wurden die Reaktionen zu zellfreien PURExpress-Reaktionen auf Papierscheiben im Verhältnis 1:7 addiert. Der Faltenwechsel nach 130 min bei 37 °C wird aufgetragen. Diese Zahl wurde von24 reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Abbildung 6: Tragbare Plattenlesegeräte-Aufnahmeseite mit erfassten Bilddaten geladen. Diese Abbildung zeigt ein Beispielbild des endgültigen Bildes, das vom tragbaren Plattenleser während einer Datenerfassungsfahrt aufgenommen wurde. Der ursprüngliche Datums-/Zeitstempel ist oben im Bild sichtbar. Die gelbe Farbe zeigt Kontroll- oder negative Reaktionen an, und die violette Farbe zeigt eine positive Reaktion an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Abbildung 7: Datenanalysemodus. Auf der linken Seite wählen Benutzer die Datensätze aus, die sie plotten möchten. Die Diagramme werden dann auf der rechten Seite mit eindeutigen Farben für jedes Beispiel oder Kontrollset angezeigt. Die gestrichelte rote Linie dient als Schwellenwert für die Bestimmung positiver und negativer Proben. In dreifacher Ausfertigung getestete Proben, die den Schwellenwert überschreiten, gelten als positiv, während Proben unterhalb des Schwellenwerts als negativ gelten. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung (SD) von drei Replikaten dar. Strg 1 bis Strg 5 kennzeichnet Steuerelemente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Abbildung 8. PLUM, ein tragbarer Plattenleser. Dieser tragbare Plattenleser fungiert als Lab-in-a-Box und dient als temperaturgesteuerter Plattenleser zur Inkubation und Überwachung kolorimetrischer Reaktionen. Dieses tragbare Gerät kann quantitative und Hochdurchsatzmessungen der papierbasierten Zika-Sensoren vor Ort durchführen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Abbildung 9: RT-qPCR-Diagramm der Amplifikation von zwei Patientenproben, die in dreifacher Ausfertigung zum Nachweis des Zika-Virus getestet wurden. Proben gelten als positiv, wenn der Zyklusschwellenwert (Ct) ≤38 beträgt. Die gestrichelte rote Linie dient als Schwellenwert für die Bestimmung positiver und negativer Proben. Die rote Spur zeigt eine positive Probe an, und die blaue Spur zeigt eine negative Probe an. Der ΔRn-Wert (delta Rn) stellt die normalisierte Größe des Fluoreszenzsignals dar, das vom RT-qPCR-Instrument für alle getesteten Proben detektiert wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Protokolldatei. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Zahlen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildungen herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

Der Zugang zu dezentralen, kostengünstigen Diagnosen mit hoher Kapazität, die für dezentrale Tests in der Community eingesetzt werden können, ist entscheidend für die Bekämpfung globaler Gesundheitskrisen. Dieses Manuskript beschreibt, wie eine papierbasierte Diagnostik für virale RNA-Sequenzen aufgebaut werden kann, die mit einem tragbaren optischen Lesegerät nachgewiesen werden können.

Design-to-Implementierungsstudie zur Entwicklung und Patientenvalidierung der papierbasierten Zehenschalterdiagnostik

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Unser Protokoll beschreibt das Design, den Aufbau und die Validierung von Genschaltkreis-basierten Diagnostika. Diese papierbasierte molekulare Diagnostik ist kostengünstig und empfindlich, da sie in der Lage ist, klinisch relevante Konzentrationen von Nukleinsäuren zu detektieren und kann so konzipiert werden, dass sie praktisch jede Sequenz detektieren. Dies ist eine Plattformtechnologie, die von Benutzern für ihre Bedürfnisse entworfen werden kann und das Potenzial hat, klinische Diagnostik in dezentralere zahnärztliche Ressourceneinstellungen zu bringen.Der zellfreie Zehenhalteschaltersensor kann für praktisch jedes Nukleinsäure-basierte Ziel ausgelegt werden. Jüngste Arbeiten haben eine zellfreie Diagnostik für Ebola, Noroviren, SARS-CoV-2, C.difficile und Typhus-verursachende Bakterien gezeigt. Severino Jefferson Rivero da Silva, ein Postdoktorand, und Pouriya Bayat, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren.Um den Zehenschalter zu entwerfen, identifizieren Sie die Zielsequenzen aus dem Zika-Virusgenom und wählen Sie die Zika-Virus-Zielsequenzen aus den Amplikons aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Laden Sie das Zehenhalteschalter-Design-Softwarepaket herunter. Öffnen Sie MATLAB und navigieren Sie zum Ordner Designsoftware.Geben Sie die Zielsequenzen in die CSV-Datei der Designeingabedatei ein, die sich im Unterordner input befindet. Wählen Sie die Parameter aus, die für die Konstruktionsfunktion verwendet werden sollen. Führen Sie die Designfunktion aus, um die Zehenschalterdesigns für die interessierenden Ziele zu generieren.Navigieren Sie nach Abschluss zum Ordner final_designs und suchen Sie die Entwurfssequenzen des oberen Zehengriffschalters und die entsprechenden Zielsequenzen in Tabellenkalkulationen im CSV-Format. Stellen Sie sicher, dass die vom Algorithmus erzeugten Zehenschalter-DNA-Sequenzen die T7-Promotorsequenzen am fünf Hauptende und eine konservierte 21-Nukleotid-Linkersequenz am drei Hauptende enthalten. Verwenden Sie NCBI BLAST, um die Designsequenzen des oberen Zehengriffschalters gegen andere gängige Viren zu überprüfen, indem Sie nach Sequenzhomologie suchen.Akzeptieren Sie Sequenzen mit weniger als 40%Hämologie. Bereiten Sie Lösungen der Zehenhalteschalter-Haarnadel-DNA-Oligos und umgekehrte Amplifikationsprimer in einer Konzentration von 10 Mikromolaren in nukleasefreiem Wasser vor. Reaktionen in PCR-Röhrchen auf Eis gemäß dieser Tabelle zusammenstellen.Legen Sie die Reaktionsröhrchen gemäß den in dieser Tabelle aufgeführten Zyklusbedingungen in einen Thermocycler. Analysieren Sie die PCR-Produkte auf einem Agarose-Gel. Reinigen Sie die PCR-Produkte und eluieren Sie die DNA in einem minimalen Volumen nukleasefreien Wassers, um eine ausreichend hohe Konzentration zu gewährleisten.Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer. Bereiten Sie eine CPRG-Stammlösung vor, indem Sie 25 Milligramm des Pulvers in einem Milliliter nukleasefreiem Wasser auflösen. Bereiten Sie eine Mastermischung auf Eis nach dem hier gezeigten Standardprotokoll vor.Geben Sie die zellfreie Mastermischung in PCR-Röhrchen. Für zellfreie Kontrollen und Schalterkontrollen allein fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Volumen von 5,94 Mikrolitern hinzu. Und für die Reaktion fügen Sie PCR-gereinigte Zehenschalter-DNA hinzu, um eine Endkonzentration von 33 Nanomolaren zu erhalten.Um die Zehengriff-Schalter- und Ziel-RNA-Kombination zu testen, fügen Sie in vitro transkribierte Ziel-RNA zu einer Endkonzentration von einem Mikromolaren hinzu. Mischen Sie alle Reaktionen gründlich durch Pipettieren und Zentrifugieren kurz. Auf einer schwarzen, klaren 384-Well-Platte 30 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Vertiefungen um die Reaktionsmulden geben.Schneiden Sie dann mit einem Zwei-Millimeter-Biopsiestempel und einer Pinzette BSA-blockierte Filterpapierscheiben ab und legen Sie sie in die Reaktionsmulden. Dosieren Sie 1,8 Mikroliter aus jedem Reaktionsrohr dreifach auf die Filterpapierscheiben in der 384-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit einer durchsichtigen PCR-Folie ab und legen Sie sie in einen Plattenleser.Messen Sie die Absorption bei 570 Nanometern bei 37 Grad Celsius jede Minute für 130 Minuten. Bereiten Sie eine 25-Mikromol-Stammlösung aller Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Sets in nukleasefreiem Wasser vor. Richten Sie eine Fünf-Mikroliter-Reaktion mit der hier gezeigten Mastermischung ein.Durch Pipettieren mischen, bis der weiße Niederschlag löslich ist, und dann in PCR-Röhrchen dosieren. Fügen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer zu den entsprechenden Röhrchen hinzu, gefolgt von einem Mikroliter entweder nukleasefreiem Wasser oder zwei Picomolar Zieltrigger-RNA. Durch vorsichtiges Pipettieren mischen und die Röhrchen kurz herunterschleudern.Richten Sie das Inkubationsprotokoll auf einem Thermocycler ein, wie hier gezeigt. Nach 12 Minuten die Röhrchen entfernen und 1,25 Mikroliter der Enzymmischung zu jedem Röhrchen hinzufügen, gefolgt von Mischen und Zentrifugieren. Bringen Sie die Röhrchen zum Thermocycler zurück, nachdem Sie den 41 Grad Celsius Halteschritt übersprungen haben, um die einstündige Reaktionsinkubation zu starten.Um dann die Primerleistung zu bewerten, stellen Sie die papierbasierten zellfreien Zehenschalterreaktionen zusammen und analysieren Sie die Daten. Für die Sensitivitätsanalyse identifizieren Sie mögliche Primerpaare und bereiten serielle Verdünnungen der Ziel-RNA in nukleasefreiem Wasser vor. Wiederholen Sie die NASBA- und zellfreien Reaktionen mit den ausgewählten Primer-Sets in biologischen Triplikaten.Führen Sie unter Verwendung eines Mikroliters extrahierter Patienten-RNA die NASBA-Amplifikation und papierbasierte zellfreie Reaktionen durch, wie in Abschnitt fünf gezeigt. Nach den Reaktionen bereiten Sie die 384-Well-Reaktionsplatte vor und führen den Assay in einem tragbaren Plattenleser bei 37 Grad Celsius durch. Anschließend werden die RT-qPCR-Komponenten zusammengebaut und die Reagenzien in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gemäß dieser Tabelle gegeben.Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren. Geben Sie 6,5 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Well- oder 384-Well-PCR-Platte, gefolgt von 3,5 Mikrolitern jeder RNA-Vorlage in dreifacher Ausfertigung. Legen Sie einen PCR-Film über die Oberseite der Platte.Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte bei 600 mal G für zwei Minuten. Legen Sie die Platte in ein RT-qPCR-Gerät und führen Sie die Zyklusbedingungen wie hier gezeigt durch. Nach dem rechnerischen Design wurden drei Zehenhalteschalter konstruiert und mittels Agarosegelelektrophorese analysiert.Eine Bande um 3.000 Basenpaare zeigte eine erfolgreiche Reaktion an. Die Zehengriffschalter wurden anhand ihrer jeweiligen in vitro transkribierten Trigger-RNA bewertet. Während alle drei Sensoren eine erhöhte Absorption aufwiesen, hatte Sensor 27B die schnellste Einschaltrate, während die Schalter 33B und 47B ein niedrigeres Ein-/Aus-Verhältnis aufwiesen, was auf Hintergrundaktivität und reduzierte Spezifität hinweist.Die Faltenänderung der Absorption bei 570 Nanometern zeigte, dass der Schalter 27B mit einem Ein-/Aus-Signalverhältnis die beste Leistung aufweist. Darüber hinaus kann es in Verbindung mit NASBA RNA in Konzentrationen von nur 124 Molekülen pro Mikroliter nachweisen, was auf eine hohe Empfindlichkeit hinweist. Zika-Virus-Patientenproben aus Brasilien wurden getestet, um die klinisch-diagnostische Genauigkeit der Sensoren mit einem tragbaren Plattenleser zu beurteilen.Ein Farbwechsel von gelb zu violett identifizierte eine positive Probe. Die kolorimetrische Reaktion für jede papierbasierte Reaktion wurde im Laufe der Zeit von der integrierten Software auf dem tragbaren PLUM-Plattenleser aufgezeichnet. Die Proben, die den Schwellenwert überschritten, wurden als positiv eingestuft.Die klinische Leistung des Sensors wurde im Vergleich zur RT-qPCR ermittelt. Die Proben wurden als positiv angesehen, wenn der Zyklusschwellenwert gleich oder kleiner als 38 war. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Ergebnisse von Zehenschalter-Bildschirmen und NASBA-Primer-Empfindlichkeit reproduzierbar und optimiert sind, bevor mit Patientenstudien fortgefahren wird.Aufgrund ihrer Einfachheit und Anpassungsfähigkeit hat die hier beschriebene Diagnoseplattform den Weg für die Entwicklung neuer Point-of-Care-Instrumente geebnet, die dem Gesundheitssystem, insbesondere für Länder mit niedrigem Einkommen, Vorteile bringen können.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Forschung

Biotechnik

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Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

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Auf Papier basierende Vorrichtungen zur Isolierung und Charakterisierung von extrazellulärer Vesikel

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

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Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

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