Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

המחברים מודים לכל חברי מעבדות גרין, פארדי ופנה, כמו גם לכל המחברים השותפים של כתבי יד קודמים הנוגעים לעבודה המתגלה בכתב יד זה. S.J.R.d.S. נתמך על ידי מלגת דוקטורט בחסות הקרן למדע וטכנולוגיה של פרנמבוקו (FACEPE), ברזיל, מספר הפניה IBPG-1321-2.12/18, וכיום נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט בחסות אוניברסיטת טורונטו, קנדה. P.B. נתמך על ידי פרס ויליאם קנאפ באקלי מהפקולטה לרוקחות, אוניברסיטת טורונטו. M.K. נתמך על ידי יוזמת הרפואה המדויקת (PRiME) באוניברסיטת טורונטו מספר מלגה פנימית PRMF2019-002. עבודה זו נתמכה על ידי כספים ל- K.P מתוכנית כסאות המחקר של קנדה (קבצים 950-231075 ו- 950-233107), הקרן לניהול פרויקטי מחקר גדולים של אוניברסיטת טורונטו, תוכנית המענקים של קרן CIHR (201610FDN-375469), ול- L.P, A.A.G., ו- K.P באמצעות מענק צוות CIHR / IDRC: תוכנית וירוס זיקה קנדה-לטינית/אמריקה-קריביים (FRN: 149783), כמו גם על ידי כספים ל- K.P. ממרכז המחקר לפיתוח בינלאומי של קנדה (מענק 109434-001) דרך הזדמנות מימון המחקר המהיר של נגיף הקורונה החדש (COVID-19) הקנדי לשנת 2019. עבודה זו נתמכה גם על ידי כספים ל- A.A.G. מפרס חוקר חדש של ועדת המחקר הביו-רפואית של אריזונה (ADHS16-162400), קרן גייטס (OPP1160667), פרס חדשן חדש של מנהל NIH (1DP2GM126892), פרס NIH R21 (1R21AI136571-01A1) ל- K.P./A.A.G, ומלגת אלפרד פ. סלואן (FG-2017-9108). איור 1 נוצר עם Biorender.com תחת רישיון אקדמי ל-K.P.

<ol>
	<li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world.">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, 73-79 (2006).</li><li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+diagnostics+for+global+health.">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil.">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+Early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis.">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li><li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants.">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li><li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor.">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).</li><li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment.">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li><li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors.">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li><li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics.">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li><li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection.">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li><li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter.">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR&#946;-specific+endocrine+disruptors.">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTR&#946;-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine:+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach.">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li><li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors.">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li><li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis.">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li><li>Gr&#228;we, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper-based,+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs.">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).</li><li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toehold+Switches:+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression.">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li><li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics:+a+critical+review.">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li><li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification.">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers.">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li><li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples.">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li><li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information.">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li><li>. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022)</li><li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+(NASBA).">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li><li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization.">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).</li><li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+automated+DNA+assembly:+Best+practices,+metrics,+and+protocols+using+robots.">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).</li><li>Silva, S. J. R., de Magalh&#227;es, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+circulation+of+DENV,+CHIKV,+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil:+An+inconvenient+truth.">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205 (2021).</li><li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso.">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li><li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts.">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).</li><li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+(RT-LAMP)+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil.">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li></ol>

K.P. ו-A.A.G. הם ממציאים שותפים של טכנולוגיות הקשורות לחיישני טוהולד מבוססי נייר. Y.G., S.C., ו- K.P. הם מייסדים משותפים של LSK Technologies, Inc. והם ממציאים שותפים של טכנולוגיות הקשורות ל- PLUM. מ.ק., ק.פ. וא.א.ג. הם מייסדים שותפים של אן כרטא דיאגנוסטיקה בע"מ. למחברים אחרים אין ניגודי עניינים. פטנטים: מכשיר PLUM: Y.G., S.C., ו- K.P. בקשת הפטנט הוגשה על ידי אוניברסיטת טורונטו והוקצתה ל- LSK Technologies Inc. U. S. בקשת פטנט זמנית מס '62/982,323 שהוגשה 27 בפברואר 2020; טוהולד מתג פטנט: A.A.G., P.Y., ו- J.J. C. "הרכבי ריבורגולטור ושיטות שימוש", פטנט. WO2014074648A3 הגיש 6 בנובמבר 2012; פטנט אבחון מבוסס נייר: K.P. ו- J.J.C. "רשתות גנים סינתטיות מבוססות נייר" בארה"ב. פטנט בהמתנה לא. US15/963,831 הגיש 6 בדצמבר 2013; פטנט זיקה 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., ו- J.J.C., "פלטפורמה ניידת וזולה לזיהוי וירוסים וזיהוי מתח", בקשת פטנט זמנית מס' 62/403,778 שהוגשה ב-4 באוקטובר 2016; פטנט זיקה 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., ו- J.J.C., "פלטפורמה ניידת וזולה לזיהוי וירוסים וזיהוי מתח", בקשת פטנט זמנית מס' 62/341,221 שהוגשה ב-25 במאי 2016.

המערכת המשולבת מבוססת הנייר המתוארת כאן יכולה להביא אבחון מולקולרי רלוונטי מבחינה קלינית, עם ביצועים דומים מבחינה פונקציונלית ל- RT-qPCR, לנקודת הצורך6. חשוב לציין, עבור הגדרות מרוחקות, הזמינות של אבחון באתר יכולה לקצר את הזמן לתוצאות מימים לשעות. הדגשת יכולת התכנות של גישה זו, הצינור שתואר יכול לשמש לזיהוי כמעט כל יעד פתוגן. שילבנו את הכלים המולקולריים עם קורא צלחות נייד ייעודי, שהוא קומפקטי ותואם לפעולת הסוללה (8-9 שעות) ומספק ניתוח נתונים מובנה כדי לאפשר יישומים מבוזרים . בעבודות אחרות, אימתנו את החומרה המשולבת ואת פלטפורמת אבחון הווירוסים זיקה עם 268 דגימות מטופלים, במקביל ל- RT-qPCR, ומצאנו דיוק אבחוני של 98.5%24. יחד, המטרה שלנו היא לאפשר את העברת הטכנולוגיה של פלטפורמה זו לחוקרים, כך שהקהילה תוכל לשנות את ייעודה ולשפר אותה כדי לענות על צרכי אבחון שלא נענו.
תהליך תכנון מתגי ה- in silico toehold שולב ואוטומטי לצינור שניתן לחלק לשלושה שלבים. השלב הראשון מייצר מאגר של עיצובי מתגי טוהולד המשתלבים לרצף המטרה במרווחים של נוקלאוטיד אחד. השלב השני בוחן את המבנה המשני ואת זמינות מתגי ה-toehold ומבטל חיישנים עם קודוני עצירה מוקדמים בתוך המסגרת. לאחר מכן, פונקציית ניקוד הלוקחת בחשבון גורמים מרובים (לדוגמה, רמת הפגם של מתג toehold, זמינות מתג toehold ונגישות אתר היעד) מיושמת לאחר מכן כדי לבחור עיצובים של מתגי toehold מובילים בהתבסס על הציונים הכוללים. בשלב הסופי, נוצרת רשימה של רצפים עבור עיצובי מתגי הטוהולד העליונים וגורמי המטרה המתאימים להם. יש לבדוק את רצפי החיישנים העליונים כדי לבדוק את הספציפיות מול התעתיק האנושי והגנומים הנגיפיים הקשורים זה לזה באמצעות NCBI/Primer-BLAST25. כמו כן, מומלץ לסנן את אתרי המטרה של החיישן לצורך שימור רצף בגנום הנגיפי של זיקה כדי להבטיח שהחיישנים יספקו זיהוי רחב וחזק. מספר גרסאות של תוכנת תכנון מתגי toehold פותחו ואלגוריתם העיצוב מאפשר למשתמשים ליצור שתי גרסאות, או סדרה A 6 או סדרה B toehold מתגים6. במאמר זה, ההתמקדות הייתה בעיצוב מתגי Toehold מסדרה B.
לאחר סינתזת דנ"א מסחרית, ניתן להרכיב במהירות את מתגי ה-toehold, ולאחר מכן לבדוק אותם על ידי ביצוע בדיקה ראשונית כנגד רצף טריגר מטרה סינתטי המתאים לאזורים קצרים (200-300 nt) של גנום המטרה. לסינון הביצועים של חיישנים מבוססי מתג toehold, זה אידיאלי להוסיף את רצף המטרה בצורה של RNA. במאמר זה תוארו השלבים הנדרשים להוספת RNA טריגר מתועתק במבחנה . עם זאת, אם הן זמינות, ניתן להשתמש בתבניות גנום באורך מלא כגון תמציות RNA נגיפיות מכומתות או גנומים מסחריים של RNA סינתטי או תקנים. שימוש בגנומים של רנ"א באורך מלא לסינון ראשוני של מתגי ה-toehold מועיל מכיוון שהוא יכול להודיע אם גורמים נוספים, כגון מבנה משני של RNA, ישפיעו על ביצועי החיישן. כדי למטב את יחס ההפעלה/כיבוי של מתגים מועמדים, ניתן להפוך את הדנ"א של מתג ה-toehold לתגובה נטולת תאים. שלב זה יכול לשמש גם לזיהוי מתגי toehold בעלי ביצועים גבוהים (הגברה בקיפול, או יחס ON/OFF גבוה) ולהשמטת מתגי toehold דולפים (אות גבוה בהיעדר RNA המטרה) משלבי אפיון במורד הזרם.
כדי לשפר את גבול הזיהוי של המועמדים בעלי הביצועים הטובים ביותר למתג toehold, NASBA משמש להגדלת הריכוזים הרלוונטיים מבחינה קלינית של RNA נגיפי זיקה למטרה לרמה שניתן לזהות על ידי מתגי toehold6. שילובים שונים של ערכות פריימרים קדימה ואחורה נבדקים כדי לקבוע את שילובי הפריימר והמתגים הטובים ביותר של NASBA כדי לאפשר זיהוי בריכוזים רלוונטיים מבחינה קלינית. לאחר שזוהתה ערכת פריימרים אידיאלית ושילוב מתגי toehold, הבדיקה מועברת לאימות קליני. חשוב לציין כי מתג ה-toehold ושלבי הסינון של NASBA יכולים להיות עתירי עבודה ומשאבים ולכן פיתוח הבדיקות מתאים ביותר לאתרי מחקר עתירי משאבים. למרות שלא יישמנו אוטומציה של תהליכים, סביר להניח שהדבר עשוי להאיץ את מחזור התכנון, הבנייה והבדיקה האיטרטיבי32. למרבה המזל, זמן התפנית מתכנון חיישנים ובדיקות לפריסה יכול להיות קצר להפליא (פחות משבוע), מה שהופך אסטרטגיה זו לאידיאלית למצבים קריטיים בזמן, כגון התפרצויות מגיפה6.
גם לאחר שפותח ביוסנסור בעל רגישות רלוונטית מבחינה קלינית, ישנם אתגרים טכניים שיש לטפל בהם. מכיוון שפרוטוקול זה כרוך בהפעלה ידנית והוא הליך רב-שלבי, קיים סיכון לזיהום צולב בין דגימות. אנו עושים כמיטב יכולתנו כדי להפחית סיכון זה באמצעות תרגול מעבדה זהיר. בניסוי קליני שנערך לאחרונה בהשתתפות 268 דגימות של מטופלים, לא נתקלנו בבעיות זיהום; עם זאת, זהו שיקול חשוב24. בהתחשב בכך, הפרוטוקול נשאר מבחן מעבדה ודורש משתמש מיומן עם שליטה בטכניקות ביולוגיה מולקולרית מתאימות. שיקול נוסף לפריסה הוא בידוד הרנ"א מדגימות המטופלים. כאן אנו מתארים בידוד RNA באמצעות ערכות מיצוי חומצות גרעין מבוססות עמודה. עם זאת, בעבודות אחרות, הדגמנו שיטת תזה רותחת יעילה ופשוטה (95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות) לעיבוד דגימת מטופלים בנטל נמוך6. אסטרטגיה זו כמעט מבטלת את העלות הכרוכה במיצוי RNA ונמנעת משימוש בערכות מיצוי חומצות גרעין מבוססות עמודה, שיכולות להוות אתגר לוגיסטי במסגרות דלות משאבים או בבעיות בשרשרת האספקה במהלך משברים, כגון מגיפת COVID-1933.
כפי שראינו במהלך מגיפת COVID-19, המכשירים המשמשים לביצוע RT-qPCR יכולים בעצמם לשמש צוואר בקבוק ולהגביל את גישת המטופלים לבדיקות. גורם זה, שהוא גם פיננסי במידה רבה, מוביל למצב בדיקה מרכזי שיכול להגביל את הגישה לאבחון. לדוגמה, במהלך התפרצות זיקה 2015/2016, רק חמש מעבדות ייחוס לאומיות היו זמינות בברזיל, מה שגרם לעיכובים בבדיקות המטופלים. מבלי לקחת בחשבון את היתרון הפוטנציאלי של יתרונות לגודל, העלות הנוכחית של סחורות עבור קורא הצלחות הנייד היא ~ 500 דולר ארה"ב, אשר גם אם גדל פי חמישה כדי להסביר את העבודה ואת המרווח המסחרי, עדיין מספק מכשיר זול. זאת בהשוואה למכשירי RT-qPCR שעלותם נעה בין 15,000 ל-90,000 דולר34 דולר. יתר על כן, העלות המשוערת לבדיקה ללא תאים באמריקה הלטינית היא סביב $5.48 USD, בעוד שהעלות לבדיקה של RT-qPCR בברזיל הייתה ~$10-11 USD בזמן התפרצות זיקה36. מעבר לעלות הציוד, לקורא הצלחות הנייד יש טביעת רגל קטנה (20 ס"מ3), ניתוח אוטומטי, העלאת נתונים לענן דרך האינטרנט, וניתן להפעיל אותו על כוח סוללה. תכונות אלה מרחיבות באופן דרמטי את ההגדרות הפוטנציאליות שבהן ניתן לפרוס בדיקות ומרחיבות במקביל את אוכלוסיית המטופלים שניתן לשרת.
נכון להיום פלטפורמות E. coli CFPS המסחריות הנפוצות ביותר הן מערכות S30 ו- PURE37; עם זאת, שיקול מרכזי בשיפור הגישה לאבחון במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית הוא הזמינות המקומית המוגבלת של ריאגנטים אלה. צעד חשוב לקראת פתרון אתגר זה הוא פיתוח ייצור CFPS מקומי. מעבדת פדריצ'י עשתה לאחרונה התקדמות משמעותית לקראת פיתוח פלטפורמה לא מסחרית להטמעת חיישנים מבוססי מתגי toehold במערכות נטולות תאים מבוססות ליזאט, המגיעים ל-LOD של 2.7 fM עם נגיף זיקה RNA14. לא רק שהישג זה מאפשר לייצר את הריאגנטים בארץ השימוש, תוך הימנעות ממכסי יבוא ועיכובים, אלא שעלויות העבודה גם מתרחבות לתעריפים המקומיים וכך ניתן להוריד משמעותית את העלות הכוללת. בעבודה שהתוותה קבוצת פדריצ'י, עלות הפקת תגובת הביטוי CFPS (5 μL) בצ'ילה הייתה 6.9 סנט (USD)35,38, וסיפקה תמריץ כפול (לוגיסטיקה ועלות משופרות) ליישום מערכות מבוססות ליזאט 35,38.
המיקום של בדיקות דומות ל- RT-qPCR ברשתות אבחון מבוזרות עשוי להביא יתרונות משמעותיים על פני שיטות העבודה הנוכחיות התלויות בהובלת דגימות למתקני RT-qPCR מרכזיים. במסגרות פרי-עירוניות, שבהן התרכזו מקרי זיקה, המרחק הפיזי בין המטופל למכון האבחון מאט את האבחון ומגביר את הסיכון שהתוצאות לא יגיעו למטופל בזמן רלוונטי מבחינה קלינית. תקוותנו היא שהעבודה המוצגת כאן תוכל לתרום לאפשר לקהילת המחקר, באמצעות העברת ידע, ליצור ביוטכנולוגיות מבוזרות וחומרה ניידת לבריאות האדם, לחקלאות ולניטור סביבתי.

RT-qPCR נותרה טכנולוגיית תקן הזהב לאבחון קליני בשל הרגישות והספציפיות המצוינות שלה. למרות שהיא חזקה מאוד, השיטה תלויה בציוד וריאגנטים יקרים ומתמחים הדורשים הפצה ואחסון מבוקרי טמפרטורה. הדבר מציב חסמים משמעותיים לנגישות של אבחון איכותי ברחבי העולם, במיוחד בתקופות של התפרצויות מחלות ובאזורים שבהם הגישה למעבדות מאובזרות היטב מוגבלתב-1,2. זה נצפה במהלך התפרצות נגיף זיקה 2015/2016 בברזיל. כאשר רק חמש מעבדות מרכזיות זמינות כדי לספק בדיקות RT-qPCR, נוצרו צווארי בקבוק משמעותיים שהגבילו את הגישה לאבחון. זה היה מאתגר במיוחד עבור אנשים במסגרות פרי-עירוניות, שנפגעו בצורה קשה יותר מההתפרצות 3,4. במאמץ לשפר את הגישה לאבחון, הפרוטוקול מציג פלטפורמה שפותחה עם פוטנציאל לספק אבחון מבוזר, בעלות נמוכה ובקיבולת גבוהה בסביבות דלות משאבים. כחלק מכך, הוקם צינור גילוי אבחוני, המשלב הגברה איזותרמית וחיישנים מבוססי מתגי RNA סינתטיים עם מערכות ביטוי ללא תאים מבוססות נייר 5,6.
מערכות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS), במיוחד מערכות ללא תאים מבוססות E. coli, הן פלטפורמה אטרקטיבית למגוון רחב של יישומי ביוסנסינג מניטור סביבתי 7,8 ועד אבחון פתוגנים 5,6,9,10,11,12 . מערכות CFPS, הכוללות את הרכיבים הדרושים לתמלול ולתרגום, הן בעלות יתרונות משמעותיים על פני ביוסנסורים של תאים שלמים. באופן ספציפי, חישה אינה מוגבלת על ידי דופן התא, ובאופן כללי, הם מודולריים בעיצוב, biosafe, זול, וניתן לייבש בהקפאה לשימוש נייד. היכולת לייבש בהקפאה תגובות מבוססות מעגל גנים על מצעים כגון נייר או טקסטיל, מאפשרת הובלה, אחסון לטווח ארוך בטמפרטורת החדר5, ואף שילוב בטכנולוגיה לבישה13.
עבודות קודמות הראו כי ניתן להשתמש במערכות ללא תאי E. coli כדי לזהות אנליטים רבים, למשל, מתכות רעילות כגון כספית, אנטיביוטיקה כגון טטרציקלין 7,14, כימיקלים המשבשים את המערכת האנדוקרינית15,16, סמנים ביולוגיים כגון חומצה היפופורית 17, מולקולות חישת מניין הקשורות לפתוגנים9,18 וחומרים לא חוקיים כגון קוקאין17, וגמא הידרוקסיבוטיראט (GHB)19 . לצורך זיהוי ספציפי לרצף של חומצות גרעין, אסטרטגיות הסתמכו ברובן על שימוש בביוסנסורים מבוססי מתגים המצומדים לטכניקות הגברה איזותרמיות. מתגי Toehold הם ריבורגולטורים סינתטיים (המכונים גם פשוט 'מתגים' בשאר הטקסט) המכילים מבנה סיכות שיער החוסם תרגום במורד הזרם על ידי רצף אתר הקשירה הריבוזומלי (RBS) וקודון ההתחלה. עם אינטראקציה עם RNA טריגר המטרה שלהם, מבנה סיכת השיער הוא הקלה ולאחר מכן תרגום של כתב פתוח לקרוא מסגרת מופעלת20.
הגברה איזותרמית יכולה לשמש גם כאבחון מולקולרי21; עם זאת, שיטות אלה נוטות להגברה לא ספציפית, מה שיכול להפחית את הספציפיות ובכך את הדיוק של הבדיקה מתחת לזו של RT-qPCR 22. בעבודה שדווחה כאן, הגברה איזותרמית במעלה הזרם של חיישנים מבוססי מתגים שימשה כדי לספק הגברת אותות משולבת המאפשרת זיהוי רלוונטי מבחינה קלינית של חומצות גרעין (femtomolar to attomolar). זיווג זה של שתי השיטות מספק גם שני מחסומים ספציפיים לרצף, שבשילובם מספקים רמה גבוהה של ספציפיות. באמצעות גישה זו, עבודה קודמת הדגימה זיהוי של וירוסים כגון זיקה6, אבולה5, Norovirus10, כמו גם חיידקים פתוגניים כגון C. difficile23 ואנטיביוטיקה עמיד Typhoid12. לאחרונה, מתגי toehold ללא תאים הודגמו לזיהוי SARS-CoV-2 במאמצים לספק אבחון נגיש למגפת COVID-1911,12,13.
הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאימות של בדיקת מתגי toehold סינתטיים נטולי תאים, מבוססי נייר, לזיהוי וירוס זיקה, החל מתכנון ביוסנסור סיליקו , דרך שלבי ההרכבה והאופטימיזציה, ועד לאימות שדה עם דגימות מטופלים. הפרוטוקול מתחיל בתכנון in silico של חיישנים מבוססי מתגי RNA toehold ופריימרים להגברה איזותרמית ספציפיים לרנ"א הנגיפי זיקה. למרות שקיימות שיטות הגברה איזותרמיות רבות, כאן הודגם השימוש בהגברה מבוססת רצף חומצות גרעין (NASBA) כדי להגדיל את ריכוז מטרת ה-RNA הנגיפית הקיימת בתגובה, מה שמאפשר רגישות משמעותית מבחינה קלינית. למעשה, שיטות הגברה איזותרמיות יש את היתרון של פעולה בטמפרטורה קבועה, ביטול הצורך בציוד מיוחד, כגון מחזורים תרמיים, אשר מוגבלים בדרך כלל למיקומים מרכזיים.
לאחר מכן, מתואר התהליך של הרכבת חיישני מתג toehold סינתטיים עם רצפי קידוד כתבים באמצעות PCR הרחבה חופפת, וסינון חיישני מתג toehold סינתטיים לביצועים אופטימליים במערכות ללא תאים באמצעות RNA סינתטי. עבור קבוצה זו של חיישני וירוס זיקה, בחרנו את הגן lacZ המקודד את האנזים β-גלקטוזידאז, אשר מסוגל לבקע מצע colorimetric, כלורופנול אדום-β-D-galactopyranoside (CPRG), כדי לייצר שינוי צבע צהוב עד סגול שניתן לזהות על ידי העין או עם קורא צלחת. לאחר זיהוי מתגים סינתטיים בעלי ביצועים מעולים, מתואר התהליך לסינון פריימרים להגברה איזותרמית מבוססת רצף חומצות גרעין של רצף המטרה המתאים באמצעות RNA סינתטי כדי למצוא קבוצות המספקות את הרגישות הטובה ביותר.
לבסוף, הביצועים של פלטפורמת האבחון מאומתים באתר באמריקה הלטינית (איור 1). כדי לקבוע את דיוק האבחון הקליני, הבדיקה נטולת התאים המבוססת על נייר מבוצעת באמצעות דגימות נגיף זיקה מחולים; במקביל מבוצעת בדיקת תקן זהב RT-qPCR לצורך השוואה. כדי לנטר מבחנים ללא תאים צבעוניים, אנו מאפשרים כימות באתר של תוצאות באזורים שבהם מחזוריות תרמית אינה זמינה. קורא הצלחות המורכב ביד הנקרא נייד, בעלות נמוכה, ידידותי למשתמש, Multimodal (PLUM; להלן נקרא קורא צלחות נייד) מוצג גם כאן24. קורא הצלחות הנייד, שפותח בתחילה כמכשיר נלווה לאבחון מתגי טוהולד סינתטיים ללא תאים, מציע דרך נגישה לדגור ולקרוא תוצאות באופן בעל תפוקה גבוהה, ומספק ניתוח תוכנה משולב ומבוסס ראייה ממוחשבת למשתמשים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> איור 1: זרימת עבודה לבדיקת דגימות מטופלים באמצעות תגובות מתג ללא תאים מבוססי נייר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

הגישה לאבחון מולקולרי בנטל נמוך שניתן לפרוס בקהילה לצורך בדיקה חשובה יותר ויותר ויש לה השלכות רחבות ומשמעותיות יותר על רווחתן של חברות ויציבות כלכלית. בשנים האחרונות צצו מספר שיטות אבחון איזותרמיות חדשות כדי לענות על הצורך באבחון מולקולרי מהיר בעלות נמוכה. תרמנו למאמץ זה באמצעות פיתוח ותיקוף מטופלים של אבחון מבוסס מתגי toehold, כולל אבחון עבור נגיפי זיקה וצ'יקונגוניה הנישאים על ידי יתושים, אשר סיפקו ביצועים דומים למבחנים מבוססי תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-qPCR) בתקן זהב. אבחון זה זול לפיתוח ולייצור, ויש להם פוטנציאל לספק יכולת אבחון לסביבות דלות משאבים. כאן הפרוטוקול מספק את כל השלבים הדרושים לפיתוח בדיקה מבוססת מתג לזיהוי וירוס זיקה. המאמר לוקח את הקוראים דרך תהליך פיתוח האבחון המדורג. ראשית, רצפים גנומיים של וירוס זיקה משמשים כתשומות לתכנון חישובי של מתגים מועמדים באמצעות תוכנת קוד פתוח. לאחר מכן, מוצגת הרכבת החיישנים לסינון אמפירי עם רצפי RNA סינתטיים ואופטימיזציה של רגישות האבחון. לאחר השלמתו, האימות מתבצע עם דגימות מטופלים במקביל ל- RT-qPCR, וקורא אופטי ייעודי, PLUM. עבודה זו מספקת מפת דרכים טכנית לחוקרים לפיתוח חיישנים מבוססי מתגי Toehold בעלות נמוכה עבור יישומים בבריאות האדם, בחקלאות ובניטור סביבתי.

בעקבות צינור התכנון החישובי, בניית שלושה מתגי toehold בוצעה על ידי PCR. מוצרי ה-PCR נותחו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז (איור 2). נוכחותו של פס ברור סביב 3,000 bp, בערך בגודל של הגן lacZ המוצמד למתג toehold, בדרך כלל מצביעה על תגובה מוצלחת. לחלופין, נתיב ללא רצועה, רצועות מרובות או רצועה בגודל שגוי, מציין PCR כושל. במקרה של PCR כושל, יש למטב את תנאי התגובה ו/או רצפי הפריימר.
מתגי ה-toehold שהורכבו נבדקו כדי להעריך כל חיישן מול הרנ"א המתועתק במבחנה שלו (איור 3). בעוד שכל שלושת החיישנים הציגו ספיגת OD570 מוגברת, למתג 27B (איור 3A) היה הקצב המהיר ביותר. מתגים 33B, ובמידה פחותה יותר, 47B, הראו ספיגה מוגברת של OD570 בהיעדר RNA של טריגר מטרה, מה שמצביע על כך שלמתגים אלה יש פעילות רקע או דליפה מסוימת (איור 3B,C) - תכונה שאינה רצויה בחיישן מועמד מכיוון שהיא יכולה להפחית את הספציפיות. כדי לזהות בצורה ברורה יותר את החיישן עם יחס אות ההפעלה/כיבוי הגבוה ביותר, חושב שינוי הקיפול של ספיגת OD570 (ראה מידע משלים סעיף 5) והתווה (איור 4). מניתוח זה, ברור כי מתג 27B הוא החיישן בעל הביצועים הטובים ביותר עם יחס הפעלה/כיבוי של כ-60.
הרגישות של מתג ה-toehold בעל הביצועים הטובים ביותר (27B) הוערכה לאחר מכן על ידי קביעת ריכוז ה-RNA הנמוך ביותר הנדרש להפעלת מתג ה-toehold בשילוב עם תגובת NASBA. הגרף ממחיש כי חיישני זיקה בעלי הביצועים הטובים ביותר יכולים לזהות RNA בריכוזים נמוכים של עד 1.24 מולקולות לכל μL (שווה ערך ל~2 aM; איור 5).
לאחר שמתג 27B זוהה ואומת, חומרי החיישנים חולקו לחברי הצוות ברסיפה במדינת פרנמבוקו בברזיל. בברזיל, הדיוק האבחוני הקליני של פלטפורמת אבחון הווירוסים זיקה הוערך באמצעות דגימות של חולי נגיף זיקה, במקביל ל- RT-qPCR לצורך השוואה. כדי לאמת את פלטפורמת אבחון זיקה מבוססת נייר, נעשה שימוש בקורא הצלחות הנייד, המסוגל לדגור ולקרוא את הפלט הצבעוני של חיישנים מבוססי נייר. שינוי הצבע מצהוב לסגול משמש לזיהוי דגימה חיובית, בעוד שדגימה שלילית נשארת צהובה (איור 6). אפשרות נוספת להמחשת התוצאות שמפיק קורא הלוחות הניידים (איור 8) היא להתוות את התגובה הצבעונית עבור כל תגובה מבוססת נייר לאורך זמן. דגימות נבדקו במשולש ואלה שעברו את הסף (קו אדום שנקבע ל-1) נחשבו חיוביות, בעוד שדגימות מתחת לסף נחשבו שליליות (איור 6 ואיור 7).
לבסוף, כדי להעריך ולהשוות את הביצועים הקליניים של חיישן מתג זיקה טוהולד עם שיטת תקן הזהב הנוכחית לאבחון זיהום בנגיף זיקה, כל דגימות המטופלים נבדקו במקביל ל- RT-qPCR. חלקת ההגברה של שתי דגימות מטופלות מייצגות נבדקה במשולש לזיהוי נגיף זיקה על ידי RT-qPCR (איור 9). הדגימות נחשבות חיוביות כאשר ערך סף המחזור (Ct) הוא ≤38; הקו האדום מציין דגימה חיובית והקו הכחול מציין דגימה שלילית לנגיף זיקה.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> איור 2: אלקטרופורזה בג'ל אגרוז להערכת האיכות של מוצרי PCR. מוצרי PCR מנותחים על ג'ל אגרוז 1% ב 1X TAE, לרוץ ב 80 V במשך 90 דקות. רצועה אחת ברורה מעידה בדרך כלל על תגובה מוצלחת. נתיב 1: סולם דנ"א של 1 קילובייט; נתיבים 2-4: 27B מתג DNA, 33B דנ"א טריגר, ו 47B מפעיל DNA, בהתאמה. המספרים בצד שמאל מייצגים את גודל הרצועה ב-bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> איור 3: יצירת אב-טיפוס של שלושה מתגי טו-הולד עבור חיישני זיקה מבוססי נייר. הביצועים של שלושה חיישני מתגי RNA מבוססי-נייר נמדדו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך יותר מ-130 דקות. כל גרף מכיל שני עקבות, האחד מייצג את פקד המתג בלבד, ואילו השני מייצג את המתג וההדק. שלושת הגרפים מייצגים נתונים שנרכשו באמצעות חיישני מתג 27B (A), 33B (B) ו- 47B (C). קווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) משלושה עותקים משוכפלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> איור 4: חיישנים בעלי ביצועים מעולים מזוהים על-ידי חישוב שינוי הקיפול בספיגה ב-570 ננומטר. שינוי קיפול (או יחס הפעלה/כיבוי מרבי) מחושב על ידי מדידת יחס הספיגה (OD570) ב-130 דקות בין בקרת המתג בלבד, לבין בדיקת CFPS של המתג בתוספת ההדק. קווי שגיאה מייצגים SEM משלושה עותקים משוכפלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> איור 5: הערכת רגישות של מתג בעל ביצועים מעולים. רנ"א זיקה מתועתק במבחנה מוחדר לתגובות NASBA. לאחר דגירה של שעה אחת, התגובות נוספו לתגובות PURExpress נטולות תאים על דיסקיות נייר ביחס של 1:7. שינוי הקיפול לאחר 130 דקות ב-37 מעלות צלזיוס מתווה. נתון זה הועתקמ-24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> איור 6: דף לכידה של קורא לוחות נייד עמוס בנתוני תמונה שנלכדו. איור זה מציג תמונה לדוגמה של התמונה הסופית שצולמה על-ידי קורא הלוחות הניידים במהלך הרצת איסוף נתונים. חותמת התאריך/שעה המקורית גלויה בראש התמונה. צבע צהוב מציין שליטה או תגובות שליליות, והצבע הסגול מציין תגובה חיובית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> איור 7: מצב ניתוח נתונים. בצד שמאל, משתמשים בוחרים את ערכות הנתונים שהם רוצים להתוות; לאחר מכן, התרשימים מוצגים מימין עם צבעים ייחודיים עבור כל דגימה או ערכת פקדים. הקו האדום המקווקו משמש סף לקביעת דגימות חיוביות ושליליות. דגימות שנבדקו במשולש החורגות מהסף נחשבות חיוביות, בעוד שדגימות מתחת לסף נחשבות שליליות. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD) משלושה עותקים משוכפלים. Ctrl 1 עד Ctrl 5 מציין פקדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> תרשים 8. PLUM, קורא צלחות נייד. קורא צלחות נייד זה פועל כמעבדה בקופסה ומשמש כקורא צלחות מבוקר טמפרטורה לדגירה ולניטור תגובות צבעיות. מכשיר נייד זה יכול לספק מדידות כמותיות ותפוקה גבוהה של חיישני זיקה מבוססי נייר באתר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> איור 9: תרשים RT-qPCR של הגברה של שתי דגימות מטופלים שנבדקו במשולש לזיהוי נגיף זיקה. דגימות נחשבות חיוביות כאשר ערך סף המחזור (Ct) הוא ≤38. הקו האדום המקווקו משמש סף לקביעת דגימות חיוביות ושליליות. העקבה האדומה מציינת דגימה חיובית, והעקבה הכחולה מציינת דגימה שלילית. ערך ΔRn (delta Rn) מייצג את הגודל המנורמל של אות הפלואורסצנציה שזוהה על ידי מכשיר RT-qPCR עבור כל הדגימות שנבדקו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
קובץ פרוטוקול משלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
נתונים משלימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתונים אלה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

גישה לאבחון מבוזר, בעלות נמוכה ובקיבולת גבוהה שניתן לפרוס בקהילה לצורך בדיקות מבוזרות היא קריטית למאבק במשברי בריאות עולמיים. כתב יד זה מתאר כיצד לבנות אבחון מבוסס נייר עבור רצפי RNA ויראליים שניתן לזהות באמצעות קורא אופטי נייד.

תכנון ליישום מחקר לפיתוח ותיקוף מטופלים של אבחון מתגי Toehold מבוסס נייר

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

הפרוטוקול שלנו מתאר את התכנון, ההרכבה והאימות של אבחון מבוסס מעגל גנים. אבחון מולקולרי מבוסס נייר זה הוא בעלות נמוכה ורגישה, להיות מסוגל לזהות ריכוזים רלוונטיים מבחינה קלינית של חומצות גרעין והוא יכול להיות מתוכנן לזהות כמעט כל רצף. זוהי טכנולוגיית פלטפורמה שיכולה להיות מתוכננת על ידי משתמשים לצרכים שלהם ויש לה פוטנציאל להביא אבחון ברמה קלינית לתוך הגדרות משאבים דנטליים מבוזרות יותר.ניתן לתכנן חיישן מתג טוהולד ללא תאים עבור כמעט כל מטרה המבוססת על חומצות גרעין. עבודות אחרונות הדגימו אבחון ללא תאים עבור אבולה, נורווירוס, SARS-CoV-2, C.difficile וחיידקים הגורמים לטייפואידים. מי שידגימו את ההליך יהיו סברינו ג'פרסון ריברו דה סילבה, פוסט-דוקטורנט, ופורייה ביאת, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.כדי לתכנן את מתג ה-toehold, זהה את רצפי המטרה מהגנום של נגיף זיקה ובחר את רצפי המטרה של וירוס זיקה מתוך האמפליקונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הורד את חבילת התוכנה לעיצוב מתג toehold. פתח את MATLAB ונווט אל תיקיית תוכנת העיצוב.הזן את רצפי היעד לקובץ ה- csv של קובץ הקלט Design הממוקם בתיקיית המשנה של הקלט. בחר את הפרמטרים שישמשו עבור פונקציית העיצוב. הפעל את פונקציית העיצוב כדי ליצור את עיצובי מתגי toehold עבור יעדי העניין.בסיום, נווט לתיקיית final_designs ואתר את רצפי העיצוב של מתג הטוהולד העליון ואת רצפי היעד המתאימים בגיליונות אלקטרוניים בפורמט csv. ודא שרצפי הדנ"א של מתג הטוהולד הנוצרים על ידי האלגוריתם מכילים את רצפי מקדם T7 בקצה חמשת הראשוניים ורצף מקשר נוקלאוטידים שמור בשלושת הקצוות הראשוניים. השתמש ב-NCBI BLAST כדי לסנן את רצפי העיצוב של מתגי ה-toehold העליונים כנגד וירוסים נפוצים אחרים על-ידי בדיקת הומולוגיה של רצפים.קבל רצפים עם פחות מ- 40% hemology. הכינו תמיסות של אוליגוס דנ"א סיכות ראש של מתג הטוהולד ופריימרים להגברה הפוכה בריכוז של 10 מיקרומולר במים נטולי נוקלאזה. להרכיב תגובות בצינורות PCR על קרח על פי טבלה זו.מקמו את צינורות התגובה בתרמו-ציקלר, בהתאם לתנאי המחזור המפורטים בטבלה זו. לנתח את מוצרי PCR על ג'ל agarose. טהרו את תוצרי ה-PCR ועמקו את הדנ"א בנפח מינימלי של מים נטולי נוקלאז כדי להבטיח ריכוז גבוה מספיק.לכמת את הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. הכינו תמיסת מלאי החייאה על ידי המסת 25 מיליגרם של האבקה במיליליטר אחד של מים נטולי נוקלאזות. הכינו תערובת מאסטר על קרח בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי המוצג כאן.יש לפזר את תערובת המאסטר נטולת התאים לתוך צינורות PCR. לבקרות ללא תאים ולבקרות מתג בלבד, הוסיפו מים נטולי נוקלאז לנפח של 5.94 מיקרוליטרים. ולתגובה, הוסיפו דנ"א של מתג טוהר PCR כדי לקבל ריכוז סופי של 33 ננו-מולר.כדי לבחון את מתג ה-toehold ואת שילוב ה-RNA של המטרה, הוסיפו RNA מטרה מתועתק במבחנה לריכוז סופי של מיקרו-מולר אחד. ערבבו את כל התגובות ביסודיות על ידי פיפטינג וצנטריפוגה לזמן קצר. על צלחת שחורה עם תחתית שקופה של 384 בארות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לבארות המקיפות את בארות התגובה.לאחר מכן באמצעות ניקוב ביופסיה של שני מילימטרים ופינצטה, חותכים דיסקי נייר סינון חסומים של BSA ומניחים אותם בבארות התגובה. יש לפזר 1.8 מיקרוליטרים מכל שפופרת תגובה על דיסקיות נייר הסינון בלוח 384 הבאר במשולש. כסו את הצלחת בסרט PCR שקוף והניחו אותה בקורא צלחות.מדוד את הספיגה ב 570 ננומטר ב 37 מעלות צלזיוס כל דקה במשך 130 דקות. הכינו תמיסת מלאי של 25 מיקרומולרים של כל ערכות הפריימרים הקדמיים והאחוריים במים נטולי נוקלאזות. הגדר תגובת חמישה מיקרוליטרים באמצעות תערובת האב המוצגת כאן.מערבבים על ידי פיפטינג עד שהנוזל הלבן מתקלקל ואז מוציאים לצינורות PCR. הוסיפו את הפריימרים קדימה ואחורה לצינורות המתאימים, ולאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של מים נטולי נוקלאז או שני פיקומולרים של RNA טריגר מטרה. מערבבים על ידי צנרת עדינה ומסובבים לזמן קצר את הצינורות.הגדר את פרוטוקול הדגירה על תרמוציקלר כפי שמוצג כאן. לאחר 12 דקות, הסר את הצינורות והוסף 1.25 מיקרוליטר של תערובת האנזימים לכל צינור, ולאחר מכן ערבוב וצנטריפוגה. החזירו את הצינורות לתרמוציקלר לאחר דילוג על שלב ההחזקה של 41 מעלות צלזיוס כדי להתחיל את הדגירה של שעה אחת.לאחר מכן, כדי להעריך את ביצועי הפריימר, הרכיבו את תגובות מתגי ה-toehold נטולות התאים המבוססות על נייר ונתחו את הנתונים. לניתוח רגישות, זהה זוגות פריימרים מועמדים והכן דילולים סדרתיים של רנ"א מטרה במים נטולי נוקלאזה. חזרו על ה-NASBA והתגובות נטולות התאים עם ערכות הפריימרים שנבחרו במשולשים ביולוגיים.באמצעות מיקרוליטר אחד של רנ"א חולה שחולץ, בצע את ההגברה של NASBA ותגובות מבוססות נייר ללא תאים כפי שמוצג בסעיף 5. לאחר התגובות, הכינו את לוחית התגובה בעלת 384 הבארות והפעילו את הבדיקה בקורא צלחות נייד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הרכיבו את רכיבי RT-qPCR והוסיפו את הריאגנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר בהתאם לטבלה זו.מערבבים את התגובה על ידי פיפטינג. יש לחלק 6.5 מיקרוליטרים לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות או 384 בארות, ולאחר מכן 3.5 מיקרוליטרים של כל תבנית RNA במשולש. הניחו סרט PCR מעל החלק העליון של הצלחת.צנטריפוגה צלחת 384-באר ב 600 פעמים G במשך שתי דקות. הניחו את הצלחת במכונת RT-qPCR והפעילו את תנאי המחזור כפי שמוצג כאן. בעקבות התכנון החישובי, שלושה מתגי טוהולד נבנו ונותחו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.להקה סביב 3, 000 זוגות בסיסים הצביעה על תגובה מוצלחת. מתגי ה-toehold הוערכו כנגד ה-RNA המופעל במבחנה בהתאמה. בעוד שכל שלושת החיישנים הציגו עלייה בספיגה, לחיישן 27B היה קצב ההדלקה המהיר ביותר, ואילו למתגים 33B ו-47B היה יחס הפעלה/כיבוי נמוך יותר המעיד על פעילות רקע וספציפיות מופחתת.שינוי הקיפול של הספיגה ב-570 ננומטר הראה שלמתג 27B יש את הביצועים הטובים ביותר עם יחס אות הפעלה/כיבוי. יתר על כן, בשילוב עם NASBA, הוא יכול לזהות RNA בריכוזים נמוכים כמו 124 מולקולות למיקרוליטר המצביע על רגישות גבוהה. דגימות של חולי נגיף זיקה מברזיל נבדקו כדי להעריך את דיוק האבחון הקליני של החיישנים באמצעות קורא צלחות נייד.שינוי צבע מצהוב לסגול זיהה דגימה חיובית. התגובה הצבעונית עבור כל תגובה מבוססת נייר התוותה לאורך זמן על ידי התוכנה המשולבת בקורא הצלחות הנייד PLUM. הדגימות שעברו את הסף נחשבו חיוביות.הביצועים הקליניים של החיישן נקבעו בהשוואה ל- RT-qPCR. הדגימות נחשבו חיוביות כאשר ערך סף המחזור היה שווה או קטן מ-38. חשוב לוודא שהתוצאות ממסכי מתגי ה-toehold ורגישות הפריימר של NASBA ניתנות לשחזור וממוטבות לפני שמתקדמים בניסויים בחולים.בהתחשב בפשטותה וביכולת ההסתגלות שלה, פלטפורמת האבחון המתוארת כאן סללה את הדרך לפיתוח כלי טיפול נקודתיים חדשים שיכולים להביא תועלת למערכת הבריאות, במיוחד עבור מדינות בעלות הכנסה נמוכה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

ריחוף מגנטי יחד עם הדמיה ניידת וניתוח עבור אבחון מחלות

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

מודל הלב Neonatal מציאותי אנטומית לשימוש ב- Neonatal סימולטורים החולה

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors כדי לאתר פרוטאז פעילות In Vivo אבחון לא פולשנית

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...