Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
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Gli autori ringraziano tutti i membri dei laboratori Green, Pardee e Pena, nonché tutti i coautori dei precedenti manoscritti relativi al lavoro divulgato in questo manoscritto. S.J.R.d.S. è stato supportato da una borsa di dottorato sponsorizzata dalla Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasile, numero di riferimento IBPG-1321-2.12/18, e attualmente è supportato da una borsa di studio post-dottorato sponsorizzata dall'Università di Toronto, Canada. P.B. è supportato dal William Knapp Buckley Award della Facoltà di Farmacia dell'Università di Toronto. M.K. è stato supportato dalla Precision Medicine Initiative (PRiME) presso il numero di borsa di studio interno dell'Università di Toronto PRMF2019-002. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi a K.P dal Canada Research Chairs Program (File 950-231075 e 950-233107), dal Major Research Project Management Fund dell'Università di Toronto, dal CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469) e da L.P, A.A.G. e K.P attraverso il CIHR / IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), nonché da fondi a K.P. dal Centro internazionale di ricerca sullo sviluppo del Canada (sovvenzione 109434-001) attraverso l'opportunità di finanziamento rapido della ricerca canadese 2019 sul nuovo coronavirus (COVID-19). Questo lavoro è stato anche supportato da fondi ad A.A.G. da un Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), la Gates Foundation (OPP1160667), un NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), un premio NIH R21 (1R21AI136571-01A1) a K.P./A.A.G, e una Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). La Figura 1 è stata creata con Biorender.com sotto licenza accademica a K.P.

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	<li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world.">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, 73-79 (2006).</li><li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+diagnostics+for+global+health.">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil.">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+Early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis.">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li><li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants.">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li><li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor.">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).</li><li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment.">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li><li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors.">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li><li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics.">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li><li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection.">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li><li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter.">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR&#946;-specific+endocrine+disruptors.">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTR&#946;-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine:+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach.">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li><li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors.">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li><li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis.">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li><li>Gr&#228;we, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper-based,+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs.">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).</li><li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toehold+Switches:+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression.">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li><li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics:+a+critical+review.">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li><li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification.">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers.">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li><li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples.">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li><li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information.">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li><li>. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022)</li><li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+(NASBA).">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li><li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization.">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).</li><li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+automated+DNA+assembly:+Best+practices,+metrics,+and+protocols+using+robots.">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).</li><li>Silva, S. J. R., de Magalh&#227;es, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+circulation+of+DENV,+CHIKV,+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil:+An+inconvenient+truth.">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205 (2021).</li><li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso.">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li><li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts.">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).</li><li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+(RT-LAMP)+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil.">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li></ol>

K.P. e A.A.G. sono co-inventori di tecnologie relative ai sensori di presa basati su carta. Y.G., S.C. e K.P. sono co-fondatori di LSK Technologies, Inc. e sono co-inventori delle tecnologie relative a PLUM. M.K., K.P. e A.A.G. sono co-fondatori di En Carta Diagnostics Ltd. Altri autori non hanno conflitti di interesse. Brevetti: Dispositivo PLUM: Y.G., S.C. e la domanda di brevetto K.P. sono stati depositati dall'Università di Toronto e assegnati a LSK Technologies Inc. U. S. Provisional Patent Application No. 62/982,323 depositato il 27 febbraio 2020; Brevetto Toehold switch: A.A.G., P.Y., e J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Brevetto. WO2014074648A3 depositato il 6 novembre 2012; Brevetto diagnostico cartaceo: K.P. e J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" U.S. patent pending No. US15/963.831 depositato il 6 dicembre 2013; Brevetto Zika 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. e J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U. S. Provisional Patent Application No. 62/403,778 depositato il 4 ottobre 2016; Brevetto Zika 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. e J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U. S. Provisional Patent Application No. 62/341,221 depositato il 25 maggio 2016.

Il sistema combinato cartaceo qui descritto può portare la diagnostica molecolare clinicamente rilevante, con prestazioni funzionalmente paragonabili a RT-qPCR, al punto di necessità6. È importante sottolineare che, per le impostazioni remote, la disponibilità della diagnostica in loco può ridurre il tempo necessario per ottenere i risultati da giorni a ore. Evidenziando la programmabilità di questo approccio, la pipeline che è stata descritta può essere utilizzata per rilevare praticamente qualsiasi bersaglio patogeno. Abbiamo abbinato gli strumenti molecolari a un lettore di piastre portatile appositamente costruito, che è compatto e compatibile con il funzionamento a batteria (8-9 ore) e fornisce analisi dei dati a bordo per consentire applicazioni distribuite. In altri lavori, abbiamo convalidato l'hardware combinato e la piattaforma diagnostica del virus Zika con 268 campioni di pazienti, in parallelo con RT-qPCR, e abbiamo trovato un'accuratezza diagnostica del 98,5%24. Nel complesso, il nostro obiettivo è consentire il trasferimento tecnologico di questa piattaforma ai ricercatori in modo che possa essere riproposta e migliorata dalla comunità per affrontare esigenze diagnostiche insoddisfatte.
Il processo di progettazione degli interruttori toehold in silico è stato integrato e automatizzato in una pipeline che può essere suddivisa in tre fasi. Il primo stadio genera un pool di progetti di interruttori che si ibridano alla sequenza target in incrementi di un nucleotide. Il secondo stadio esamina la struttura secondaria e la disponibilità dell'interruttore di appoggio ed elimina i sensori con codoni di arresto prematuri in-frame. Viene quindi implementata una funzione di punteggio che considera molteplici fattori (ad esempio, il livello di difetto dell'interruttore toehold, la disponibilità dell'interruttore toehold e l'accessibilità del sito di destinazione) per selezionare i migliori progetti di switch toehold in base ai punteggi complessivi. Nella fase finale, viene generato un elenco di sequenze per i progetti di interruttori top toehold e i relativi trigger target. Le sequenze di sensori superiori dovrebbero essere sottoposte a screening per la specificità rispetto al trascrittoma umano e ai genomi virali strettamente correlati utilizzando NCBI / Primer-BLAST25. È inoltre consigliabile esaminare i siti target dei sensori per la conservazione della sequenza nel genoma virale Zika per garantire che i sensori forniscano un rilevamento ampio e robusto. Sono state sviluppate diverse versioni del software di progettazione di toehold switch e l'algoritmo di progettazione consente agli utenti di generare due versioni, serie A 6 o serie B toehold switch6. In questo articolo, l'attenzione si è concentrata sul design dell'interruttore toehold della serie B.
Dopo la sintesi commerciale del DNA, gli interruttori di appoggio possono essere rapidamente assemblati e quindi testati eseguendo uno screening iniziale contro una sequenza di trigger target sintetica che corrisponde a regioni corte (200-300 nt) del genoma bersaglio. Per lo screening delle prestazioni dei sensori basati su interruttore toehold, è ideale aggiungere la sequenza target sotto forma di RNA. In questo articolo, sono stati delineati i passaggi necessari per aggiungere l'RNA trigger trascritto in vitro . Tuttavia, se disponibili, possono essere utilizzati modelli di genoma completi come estratti di RNA virale quantificati o genomi o standard di RNA sintetico commerciale. L'utilizzo di genomi di RNA a lunghezza intera per lo screening iniziale dell'interruttore di attesa è utile in quanto può informare se fattori aggiuntivi, come la struttura secondaria dell'RNA, influenzeranno le prestazioni del sensore. Per ottimizzare il rapporto ON/OFF degli interruttori candidati, il DNA dell'interruttore di attesa può essere titolato nella reazione cellula-free. Questo passaggio può anche servire a identificare interruttori toehold ad alte prestazioni (amplificazione della piega o alto rapporto ON / OFF) e omettere gli interruttori di perdita (segnale elevato in assenza dell'RNA target) dalle fasi di caratterizzazione a valle.
Per migliorare il limite di rilevamento dei candidati toehold switch con le migliori prestazioni, NASBA viene utilizzato per aumentare le concentrazioni clinicamente rilevanti di RNA virale Zika bersaglio a un livello che può essere rilevato dagli interruttori toehold6. Diverse combinazioni di set di primer avanti e indietro vengono sottoposte a screening per determinare le migliori combinazioni di primer NASBA e interruttore di presa per consentire il rilevamento a concentrazioni clinicamente rilevanti. Una volta identificata una combinazione ideale di primer set e interruttore toehold, il test viene portato avanti alla convalida clinica. È importante notare che le fasi di apposizione e screening NASBA possono essere laboriose e ad alta intensità di risorse e quindi lo sviluppo di test è più adatto a siti di ricerca ben finanziati. Sebbene non sia stata applicata l'automazione dei processi, è probabile che ciò possa accelerare il ciclo iterativo di progettazione, costruzione e test32. Fortunatamente, il tempo di consegna dalla progettazione e dal test dei sensori all'implementazione può essere notevolmente breve (meno di una settimana), rendendo questa strategia ideale per situazioni critiche in termini di tempo, come epidemie6.
Anche dopo che è stato sviluppato un biosensore con sensibilità clinicamente rilevante, ci sono sfide tecniche che devono essere affrontate. Poiché questo protocollo prevede operazioni manuali ed è una procedura in più fasi, esiste il rischio di contaminazione incrociata tra i campioni. Facciamo del nostro meglio per ridurre questo rischio attraverso un'attenta pratica di laboratorio. In un recente studio clinico su 268 campioni di pazienti, non abbiamo riscontrato problemi di contaminazione; Tuttavia, è una considerazione importante24. Con questo in mente, il protocollo rimane un test di laboratorio e richiede un utente esperto con padronanza delle tecniche di biologia molecolare appropriate. Un'ulteriore considerazione per la distribuzione è l'isolamento dell'RNA dai campioni di pazienti. Qui descriviamo l'isolamento dell'RNA utilizzando kit di estrazione di acidi nucleici basati su colonne. Tuttavia, in altri lavori, abbiamo dimostrato un metodo di lisi bollente efficace e semplice (95 ° C per 2 minuti) per l'elaborazione del campione del paziente a basso carico6. Questa strategia elimina quasi del tutto il costo associato all'estrazione dell'RNA ed evita l'uso di kit di estrazione degli acidi nucleici basati su colonne, che possono rappresentare una sfida logistica in contesti a basse risorse o problemi della catena di approvvigionamento durante le crisi, come la pandemia di COVID-1933.
Come abbiamo visto durante la pandemia di COVID-19, gli strumenti utilizzati per eseguire RT-qPCR possono essi stessi fungere da collo di bottiglia e limitare l'accesso dei pazienti ai test. Questo fattore, che è anche in gran parte finanziario, porta a una modalità di test centralizzata che può limitare l'accesso diagnostico. Ad esempio, durante l'epidemia di Zika del 2015/2016, in Brasile erano disponibili solo cinque laboratori di riferimento nazionali, il che ha causato ritardi nei test sui pazienti. Senza considerare il potenziale beneficio delle economie di scala, il costo attuale delle merci per il lettore di piastre portatile è di ~ $ 500 USD, che anche se aumentato di cinque volte per tenere conto del margine di lavoro e commerciale, fornisce comunque uno strumento conveniente. Questo si confronta bene con gli strumenti RT-qPCR che variano in costo da $ 15.000 a $ 90.000 USD34. Inoltre, il costo stimato per test per il test cell-free in America Latina è di circa $ 5,48 USD, mentre il costo per test di RT-qPCR in Brasile era ~ $ 10-11 USD al momento dell'epidemia di Zika36. Oltre al costo delle apparecchiature, il lettore di piastre portatile ha un ingombro ridotto (20 cm3), analisi automatica, caricamento dei dati sul cloud via Internet e può essere eseguito a batteria. Queste funzionalità espandono notevolmente le potenziali impostazioni in cui è possibile distribuire i test e contemporaneamente ampliano la popolazione di pazienti che può essere servita.
Ad oggi le piattaforme commerciali CFPS di E. coli più comuni sono i sistemi S30 e PURE37; Tuttavia, una considerazione chiave per migliorare l'accesso alla diagnostica nei paesi a basso e medio reddito è la limitata disponibilità interna di questi reagenti. Un passo importante verso la risoluzione di questa sfida è lo sviluppo della produzione locale di CFPS. Il laboratorio Federici ha recentemente compiuto progressi significativi verso lo sviluppo di una piattaforma non commerciale per implementare sensori basati su switch toehold in sistemi cell-free basati su lisato, raggiungendo un LOD di 2,7 fM con l'RNA14 del virus Zika. Non solo questo risultato consente di produrre i reagenti nel paese di utilizzo, evitando tariffe di importazione e ritardi, ma i costi del lavoro si adattano anche alle tariffe locali e quindi il costo complessivo può essere significativamente ridotto. Nel lavoro delineato dal gruppo Federici, il costo di produzione della reazione di espressione CFPS (5 μL) in Cile è stato di 6,9 centesimi (USD) 35,38, fornendo un duplice incentivo (miglioramento della logistica e dei costi) per l'implementazione di sistemi basati su lisato 35,38.
Il posizionamento di test comparabili RT-qPCR in reti diagnostiche distribuite potrebbe portare vantaggi significativi rispetto alle pratiche attuali che dipendono dal trasporto di campioni a strutture centralizzate RT-qPCR. In contesti periurbani, dove si sono concentrati i casi di Zika, la distanza fisica tra un paziente e la struttura diagnostica rallenta la diagnosi e aumenta il rischio che i risultati non raggiungano il paziente in un momento clinicamente rilevante. La nostra speranza è che il lavoro qui presentato possa contribuire a consentire alla comunità di ricerca, attraverso il trasferimento di conoscenze, di creare biotecnologie decentralizzate e hardware portatile per la salute umana, l'agricoltura e il monitoraggio ambientale.

RT-qPCR è rimasta la tecnologia gold standard per la diagnostica clinica grazie alla sua eccellente sensibilità e specificità. Sebbene altamente robusto, il metodo dipende da costose attrezzature e reagenti specializzati che richiedono una distribuzione e uno stoccaggio a temperatura controllata. Ciò presenta ostacoli significativi all'accessibilità di una diagnostica di qualità a livello globale, in particolare in tempi di epidemie e nelle regioni in cui l'accesso a laboratori ben attrezzati è limitato 1,2. Ciò è stato osservato durante l'epidemia del virus Zika 2015/2016 in Brasile. Con solo cinque laboratori centralizzati disponibili per fornire test RT-qPCR, si sono verificati colli di bottiglia significativi, limitando l'accesso alla diagnostica. Ciò è stato particolarmente difficile per le persone in contesti periurbani, che sono stati più gravemente colpiti dall'epidemia 3,4. Nel tentativo di migliorare l'accesso alla diagnostica, il protocollo mostra una piattaforma che è stata sviluppata con il potenziale per fornire diagnostica decentralizzata, a basso costo e ad alta capacità in ambienti con risorse limitate. Come parte di questo, è stata stabilita una pipeline di scoperta diagnostica, accoppiando sensori basati su amplificazione isoterma e RNA sintetico con sistemi di espressione senza cellule basati su carta 5,6.
I sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS), in particolare i sistemi privi di cellule basati su E. coli, sono una piattaforma interessante per un'ampia gamma di applicazioni di biorilevamento, dal monitoraggio ambientale 7,8 alla diagnostica dei patogeni 5,6,9,10,11,12 . Comprendendo i componenti necessari per la trascrizione e la traduzione, i sistemi CFPS presentano vantaggi significativi rispetto ai biosensori a cellule intere. In particolare, il rilevamento non è limitato da una parete cellulare e, in generale, sono modulari nel design, biosicuri, economici e possono essere liofilizzati per uso portatile. La capacità di liofilizzare le reazioni basate su circuiti genici su substrati come carta o tessuti, consente il trasporto, la conservazione a lungo termine a temperatura ambiente5 e persino l'incorporazione nella tecnologia indossabile13.
Lavori precedenti hanno dimostrato che i sistemi privi di cellule di E. coli possono essere utilizzati per rilevare numerosi analiti, ad esempio metalli tossici come il mercurio, antibiotici come la tetraciclina7,14, sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino15,16, biomarcatori come l'acido ippurico 17, molecole quorum sensing associate ai patogeni 9,18 e sostanze illecite come la cocaina 17 e il gamma idrossibutirrato (GHB)19 . Per la rilevazione specifica della sequenza degli acidi nucleici, le strategie si sono basate per la maggior parte sull'uso di biosensori basati su commutazione accoppiati a tecniche di amplificazione isotermica. Gli interruttori Toehold sono riboregolatori sintetici (chiamati anche semplicemente "interruttori" nel resto del testo) che contengono una struttura a forcina che blocca la traslazione a valle sequestrando il sito di legame ribosomiale (RBS) e il codone di partenza. Dopo l'interazione con il loro RNA trigger target, la struttura della forcina viene alleviata e la successiva traduzione di un frame di lettura aperto del reporter è abilitata20.
L'amplificazione isoterma può anche essere utilizzata come diagnostica molecolare21; tuttavia, questi metodi sono soggetti ad amplificazione non specifica, che può ridurre la specificità e quindi l'accuratezza del test al di sotto di quella di RT-qPCR 22. Nel lavoro qui riportato, l'amplificazione isotermica a monte dei sensori basati su commutazione è stata utilizzata per fornire un'amplificazione del segnale combinata che consente il rilevamento clinicamente rilevante degli acidi nucleici (da femtomolare ad attomolare). Questa combinazione dei due metodi fornisce anche due punti di controllo specifici della sequenza che, in combinazione, forniscono un elevato livello di specificità. Utilizzando questo approccio, lavori precedenti hanno dimostrato la rilevazione di virus come Zika6, Ebola5, Norovirus 10, nonché batteri patogeni come C. difficile23 e Typhoid12 resistente agli antibiotici. Più recentemente, sono stati dimostrati interruttori di appoggio senza cellule per il rilevamento di SARS-CoV-2 nel tentativo di fornire una diagnostica accessibile per la pandemia COVID-1911,12,13.
Il seguente protocollo delinea lo sviluppo e la convalida di un saggio sintetico senza cellule e basato su carta per il rilevamento del virus Zika, dalla progettazione di biosensori in silico , attraverso le fasi di assemblaggio e ottimizzazione, alla convalida sul campo con campioni di pazienti. Il protocollo inizia con la progettazione in silico di sensori basati su interruttore di RNA toehold e primer di amplificazione isotermica specifici per l'RNA virale Zika. Sebbene esistano numerosi metodi di amplificazione isoterma, qui è stato dimostrato l'uso dell'amplificazione basata sulla sequenza di acidi nucleici (NASBA) per aumentare la concentrazione di RNA virale bersaglio presente nella reazione, consentendo una sensibilità clinicamente significativa. In pratica, i metodi di amplificazione isotermica hanno il vantaggio di operare a temperatura costante, eliminando la necessità di attrezzature specializzate, come i termociclatori, che sono generalmente limitati a postazioni centralizzate.
Successivamente, viene descritto il processo di assemblaggio dei sensori sintetici toehold switch con sequenze di codifica reporter tramite sovrapposizione di estensione PCR e screening dei sensori sintetici toehold switch per prestazioni ottimali in sistemi privi di cellule utilizzando RNA sintetico. Per questo set di sensori del virus Zika, abbiamo selezionato il gene lacZ che codifica per l'enzima β-galattosidasi, che è in grado di scindere un substrato colorimetrico, il clorofenolo rosso-β-D-galattopiranoside (CPRG), per produrre un cambiamento di colore da giallo a viola che può essere rilevato ad occhio o con un lettore di piastre. Una volta identificati gli interruttori sintetici con le migliori prestazioni, viene descritto il processo per lo screening dei primer per l'amplificazione isotermica basata sulla sequenza di acidi nucleici della sequenza target corrispondente utilizzando RNA sintetico per trovare set che forniscono la migliore sensibilità.
Infine, le prestazioni della piattaforma diagnostica sono convalidate in loco in America Latina (Figura 1). Per determinare l'accuratezza diagnostica clinica, il test privo di cellule su carta viene eseguito utilizzando campioni di virus Zika da pazienti; in parallelo viene eseguito un test RT-qPCR gold standard per il confronto. Per monitorare i saggi colorimetrici senza cellule, consentiamo la quantificazione in loco dei risultati nelle regioni in cui i termociclatori non sono disponibili. Il lettore di piastre assemblato a mano denominato Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; di seguito denominato lettore di piastre portatile) è anche introdotto qui24. Inizialmente sviluppato come dispositivo complementare per la diagnostica dell'interruttore sintetico senza celle, il lettore di piastre portatile offre un modo accessibile per incubare e leggere i risultati in modo ad alto rendimento, fornendo agli utenti un'analisi software integrata basata sulla visione artificiale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro per testare i campioni dei pazienti utilizzando reazioni di interruttore di presa senza cellule basate su carta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

L'accesso alla diagnostica molecolare a basso carico che può essere implementata nella comunità per i test è sempre più importante e ha implicazioni significative e più ampie per il benessere delle società e la stabilità economica. Gli ultimi anni hanno visto emergere diverse nuove modalità diagnostiche isotermiche per soddisfare la necessità di una diagnostica molecolare rapida e a basso costo. Abbiamo contribuito a questo sforzo attraverso lo sviluppo e la convalida da parte dei pazienti della diagnostica basata su interruttore toehold, compresa la diagnostica per i virus Zika e chikungunya trasmessi dalle zanzare, che hanno fornito prestazioni paragonabili ai saggi basati sulla reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) a trascrizione inversa (RT-qPCR). Questi strumenti diagnostici sono poco costosi da sviluppare e produrre e hanno il potenziale per fornire capacità diagnostica ad ambienti con risorse limitate. Qui il protocollo fornisce tutti i passaggi necessari per lo sviluppo di un test basato su switch per il rilevamento del virus Zika. L'articolo guida i lettori attraverso il processo di sviluppo diagnostico graduale. In primo luogo, le sequenze genomiche del virus Zika servono come input per la progettazione computazionale di switch candidati utilizzando software open source. Successivamente, viene mostrato l'assemblaggio dei sensori per lo screening empirico con sequenze di RNA sintetico e l'ottimizzazione della sensibilità diagnostica. Una volta completata, la convalida viene eseguita con campioni di pazienti in parallelo con RT-qPCR e un lettore ottico appositamente costruito, PLUM. Questo lavoro fornisce una tabella di marcia tecnica ai ricercatori per lo sviluppo di sensori basati su interruttore toehold a basso costo per applicazioni nella salute umana, nell'agricoltura e nel monitoraggio ambientale.

Seguendo la pipeline di progettazione computazionale, la costruzione di tre interruttori di attesa è stata eseguita mediante PCR. I prodotti PCR sono stati analizzati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2). La presenza di una banda chiara di circa 3.000 bp, all'incirca la dimensione del gene lacZ accoppiato a un interruttore di appiglio, indica tipicamente una reazione riuscita. In alternativa, una corsia senza banda, bande multiple o una banda di dimensioni errate, indica una PCR fallita. In caso di PCR fallita, le condizioni di reazione e/o le sequenze di primer devono essere ottimizzate.
Gli interruttori di appoggio assemblati sono stati sottoposti a screening per valutare ciascun sensore rispetto al rispettivo RNA trigger trascritto in vitro (Figura 3). Mentre tutti e tre i sensori mostravano un aumento dell'assorbanza OD570, lo switch 27B (Figura 3A) aveva la velocità di accensione più rapida. Gli interruttori 33B e, in misura minore, 47B hanno mostrato un aumento dell'assorbanza OD570 in assenza di RNA trigger target, indicando che questi interruttori possiedono una certa attività di fondo o perdita (Figura 3B, C), una caratteristica non voluta in un sensore candidato in quanto può ridurre la specificità. Per identificare più chiaramente il sensore con il rapporto segnale ON/OFF più elevato, è stata calcolata la variazione di piega dell'assorbanza OD570 (vedere la sezione 5 delle informazioni supplementari) e tracciata (Figura 4). Da questa analisi, è chiaro che l'interruttore 27B è il sensore che ha le migliori prestazioni con un rapporto ON / OFF di circa 60.
La sensibilità del toehold switch più performante (27B) è stata quindi valutata determinando la più bassa concentrazione di RNA richiesta per attivare il toehold switch quando accoppiato con una reazione NASBA. Il grafico illustra che i sensori Zika più performanti possono rilevare l'RNA a concentrazioni fino a 1,24 molecole per μL (equivalenti a ~ 2 aM; Figura 5).
Dopo che lo switch 27B è stato identificato e convalidato, i materiali dei sensori sono stati distribuiti ai membri del team a Recife, nello stato brasiliano di Pernambuco. In Brasile, l'accuratezza diagnostica clinica della piattaforma diagnostica del virus Zika è stata valutata utilizzando campioni di pazienti con virus Zika, in parallelo con RT-qPCR per il confronto. Per convalidare la piattaforma diagnostica Zika basata su carta, è stato utilizzato il lettore di piastre portatile, che è in grado di incubare e leggere l'output colorimetrico dei sensori basati su carta. Il cambiamento di colore da giallo a viola viene utilizzato per identificare un campione positivo, mentre un campione negativo rimane giallo (Figura 6). Un'opzione aggiuntiva per visualizzare i risultati generati dal lettore di piastre portatile (Figura 8) consiste nel tracciare la risposta colorimetrica per ciascuna reazione cartacea nel tempo. I campioni sono stati testati in triplice copia e quelli che hanno superato la soglia (linea rossa impostata a 1) sono stati considerati positivi, mentre i campioni al di sotto della soglia sono stati considerati negativi (Figura 6 e Figura 7).
Infine, per valutare e confrontare le prestazioni cliniche del sensore Zika toehold switch con l'attuale metodo gold standard per diagnosticare l'infezione da virus Zika, tutti i campioni di pazienti sono stati testati in parallelo con RT-qPCR. Il grafico di amplificazione di due campioni rappresentativi di pazienti è stato testato in triplice copia per la rilevazione del virus Zika mediante RT-qPCR (Figura 9). I campioni sono considerati positivi quando il valore della soglia del ciclo (Ct) è ≤38; la linea rossa indica un campione positivo e la linea blu indica un campione negativo per il virus Zika.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Figura 2: Elettroforesi su gel di agarosio per valutare la qualità dei prodotti PCR. I prodotti PCR vengono analizzati su un gel di agarosio all'1% in 1X TAE, eseguito a 80 V per 90 minuti. Una singola banda chiara indica in genere una reazione di successo. Corsia 1: 1 kb scala del DNA; Corsie 2-4: 27B commutano DNA, 33B trigger DNA e 47B trigger DNA, rispettivamente. I numeri sul lato sinistro rappresentano la dimensione della banda in bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Figura 3: Prototipazione di tre interruttori toehold per sensori Zika basati su carta. Le prestazioni di tre sensori toehold switch a RNA basati su carta sono state misurate a 37 °C per oltre 130 minuti. Ogni grafico contiene due tracce, una rappresenta il controllo solo switch, mentre l'altra rappresenta l'interruttore e il trigger. I tre grafici rappresentano i dati acquisiti utilizzando i sensori toehold switch 27B (A), 33B (B) e 47B (C). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM) di tre repliche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Figura 4: I sensori più performanti sono identificati calcolando la variazione di piega dell'assorbanza a 570 nm. Il cambio di piega (o rapporto ON/OFF massimo) viene calcolato misurando il rapporto di assorbanza (OD570) a 130 minuti tra il controllo solo dell'interruttore e il test CFPS interruttore più trigger. Le barre di errore rappresentano SEM da tre repliche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Figura 5: Valutazione della sensibilità dell'interruttore più performante. L'RNA Zika trascritto in vitro viene titolato in reazioni NASBA. Dopo un'incubazione di 1 ora, le reazioni sono state aggiunte alle reazioni PURExpress prive di cellule su dischi di carta con un rapporto di 1:7. Viene tracciato il cambio di piega dopo 130 minuti a 37 °C. Questa cifra è stata riprodotta da24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Figura 6: Pagina di acquisizione del lettore di lastre portatile caricata con i dati delle immagini acquisite. Questa figura mostra un'immagine di esempio dell'immagine finale acquisita dal lettore di targhe portatile durante un'esecuzione di raccolta dati. Il timbro data/ora originale è visibile nella parte superiore dell'immagine. Il colore giallo indica reazioni di controllo o negative e il colore viola indica una reazione positiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Figura 7: Modalità di analisi dei dati. A sinistra, gli utenti selezionano i set di dati che desiderano tracciare; I grafici vengono quindi visualizzati sulla destra con colori univoci per ogni campione o set di controlli. La linea rossa tratteggiata funge da soglia per determinare i campioni positivi e negativi. I campioni testati in triplice copia che superano la soglia sono considerati positivi, mentre i campioni al di sotto della soglia sono considerati negativi. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD) da tre repliche. Ctrl da 1 a Ctrl 5 indica i controlli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Figura 8. PLUM, un lettore di piastre portatile. Questo lettore di piastre portatile funge da lab-in-a-box e funge da lettore di piastre a temperatura controllata per incubare e monitorare le reazioni colorimetriche. Questo dispositivo portatile è in grado di fornire misurazioni quantitative e ad alta produttività dei sensori Zika basati su carta in loco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Figura 9: Grafico RT-qPCR dell'amplificazione di due campioni di pazienti testati in triplice copia per la rilevazione del virus Zika. I campioni sono considerati positivi quando il valore della soglia del ciclo (Ct) è ≤38. La linea rossa tratteggiata serve come soglia per determinare campioni positivi e negativi. La traccia rossa indica un campione positivo e la traccia blu indica un campione negativo. Il valore ΔRn (delta Rn) rappresenta la grandezza normalizzata del segnale di fluorescenza rilevato dallo strumento RT-qPCR per tutti i campioni testati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
File di protocollo supplementare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Cifre supplementari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare queste figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

L'accesso a diagnostica decentralizzata, a basso costo e ad alta capacità che può essere implementata nella comunità per i test decentralizzati è fondamentale per combattere le crisi sanitarie globali. Questo manoscritto descrive come costruire una diagnostica cartacea per sequenze di RNA virale che possono essere rilevate con un lettore ottico portatile.

Studio dalla progettazione all'implementazione per lo sviluppo e la convalida da parte del paziente della diagnostica cartacea dell'interruttore di attesa

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Il nostro protocollo descrive la progettazione, l'assemblaggio e la convalida della diagnostica basata su circuiti genici. Queste diagnosi molecolari cartacee sono a basso costo e sensibili, essendo in grado di rilevare concentrazioni clinicamente rilevanti di acidi nucleici e possono essere progettate per rilevare praticamente qualsiasi sequenza. Questa è una tecnologia di piattaforma che può essere progettata dagli utenti per le loro esigenze e ha il potenziale per portare la diagnostica di livello clinico in impostazioni di risorse dentali più decentralizzate.Il sensore Toehold Switch senza celle può essere progettato praticamente per qualsiasi bersaglio basato su acidi nucleici. Recenti lavori hanno dimostrato la diagnostica priva di cellule per Ebola, norovirus, SARS-CoV-2, C.difficile e batteri che causano il tifo. A dimostrare la procedura saranno Severino Jefferson Rivero da Silva, un borsista post-dottorato, e Pouriya Bayat, uno studente di dottorato del mio laboratorio.Per progettare l'interruttore di appiglio, identificare le sequenze target dal genoma del virus Zika e scegliere le sequenze target del virus Zika dagli ampliconi come descritto nel protocollo di testo. Scarica il pacchetto software di progettazione di toehold switch. Apri MATLAB e vai alla cartella del software di progettazione.Immettere le sequenze di destinazione nel file csv del file di input di progettazione che si trova nella sottocartella di input. Selezionare i parametri da utilizzare per la funzione di progettazione. Eseguire la funzione di progettazione per generare i progetti dell'interruttore di appoggio per gli obiettivi di interesse.Al termine, passare alla cartella final_designs e individuare le sequenze di progettazione dell'interruttore top toehold e le sequenze di destinazione corrispondenti nei fogli di calcolo in formato csv. Assicurarsi che le sequenze di DNA del toehold switch generate dall'algoritmo contengano le sequenze del promotore T7 all'estremità cinque prime e una sequenza conservata di 21 linker nucleotidici all'estremità dei tre primi. Utilizzare NCBI BLAST per schermare le sequenze di progettazione dell'interruttore topehold contro altri virus comuni controllando l'omologia della sequenza.Accetta sequenze con meno del 40% di emologia. Preparare soluzioni di oligo DNA a forcina e primer ad amplificazione inversa ad una concentrazione di 10 micromolari in acqua priva di nucleasi. Assemblare le reazioni in provette PCR sul ghiaccio secondo questa tabella.Posizionare i tubi di reazione in un termociclatore, seguendo le condizioni di ciclo elencate in questa tabella. Analizzare i prodotti PCR su un gel di agarosio. Purificare i prodotti della PCR ed eluire il DNA in un volume minimo di acqua priva di nucleasi per garantire una concentrazione sufficientemente elevata.Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro. Preparare una soluzione madre CPRG sciogliendo 25 milligrammi di polvere in un millilitro di acqua priva di nucleasi. Preparare un master mix su ghiaccio secondo il protocollo standard mostrato qui.Erogare la miscela master priva di cellule in provette per PCR. Per i controlli senza celle e i controlli switch alone, aggiungere acqua priva di nucleasi a un volume di 5,94 microlitri. E per la reazione, aggiungere il DNA dell'interruttore di punta purificato dalla PCR per ottenere una concentrazione finale di 33 nanomolari.Per testare la combinazione di interruttore toehold e RNA target, aggiungere RNA bersaglio trascritto in vitro a una concentrazione finale di un micromolare. Miscelare accuratamente tutte le reazioni mediante pipettaggio e centrifugare brevemente. Su una piastra nera a fondo chiaro da 384 pozzetti, aggiungere 30 microlitri di acqua priva di nucleasi ai pozzi che circondano i pozzi di reazione.Quindi, utilizzando un punzone bioptico da due millimetri e una pinzetta, tagliare i dischi di carta da filtro bloccati BSA e posizionarli nei pozzetti di reazione. Erogare 1,8 microlitri da ciascun tubo di reazione sui dischi di carta da filtro nella piastra a 384 pozzetti in triplice copia. Coprire la piastra con pellicola PCR trasparente e posizionarla in un lettore di piastre.Misurare l'assorbanza a 570 nanometri a 37 gradi Celsius ogni minuto per 130 minuti. Preparare una soluzione madre da 25 micromolari di tutti i set di primer avanti e indietro in acqua priva di nucleasi. Impostare una reazione da cinque microlitri utilizzando il master mix mostrato qui.Miscelare mediante pipettaggio fino a quando il precipitato bianco si solubilizza e quindi erogare in provette PCR. Aggiungere i primer avanti e indietro ai tubi appropriati, seguiti dall'aggiunta di un microlitro di acqua priva di nucleasi o due picomolar di RNA trigger target. Mescolare con un pipettaggio delicato e ruotare brevemente i tubi.Impostare il protocollo di incubazione su un termociclatore come mostrato qui. Dopo 12 minuti, rimuovere i tubi e aggiungere 1,25 microlitri della miscela enzimatica a ciascuna provetta, seguita dalla miscelazione e centrifugazione. Riportare i tubi al termociclatore dopo aver saltato il passaggio di attesa di 41 gradi Celsius per iniziare l'incubazione della reazione di un'ora.Quindi, per valutare le prestazioni del primer, assemblare le reazioni dell'interruttore di appoggio senza cellule basate su carta e analizzare i dati. Per l'analisi di sensibilità, identificare le coppie di primer candidati e preparare diluizioni seriali dell'RNA bersaglio in acqua priva di nucleasi. Ripetere le reazioni NASBA e cell-free con i set di primer selezionati in triplicati biologici.Utilizzando un microlitro di RNA del paziente estratto, eseguire l'amplificazione NASBA e le reazioni prive di cellule basate su carta come mostrato nella sezione cinque. Dopo le reazioni, preparare la piastra di reazione a 384 pozzetti ed eseguire il test in un lettore di piastre portatile a 37 gradi Celsius. Quindi assemblare i componenti RT-qPCR e aggiungere i reagenti a un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri secondo questa tabella.Mescolare la reazione mediante pipettaggio. Erogare 6,5 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti o 384 pozzetti, seguita da 3,5 microlitri di ciascun modello di RNA in triplice copia. Posizionare un film PCR sulla parte superiore della piastra.Centrifugare la piastra a 384 pozzetti a 600 volte G per due minuti. Posizionare la piastra in una macchina RT-qPCR ed eseguire le condizioni di ciclo come mostrato qui. Seguendo il disegno computazionale, sono stati costruiti e analizzati tre interruttori di appiglio utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio.Una banda di circa 3.000 coppie di basi ha indicato una reazione di successo. Gli interruttori di appiglio sono stati valutati rispetto ai rispettivi RNA trigger trascritti in vitro. Mentre tutti e tre i sensori mostravano un aumento dell'assorbanza, il sensore 27B aveva la velocità di accensione più rapida, mentre gli interruttori 33B e 47B avevano un rapporto on/off inferiore che indicava attività in background e specificità ridotta.Il cambio di piega dell'assorbanza a 570 nanometri ha mostrato che lo switch 27B ha le migliori prestazioni con un rapporto segnale on/off. Inoltre, quando accoppiato con NASBA, può rilevare RNA a concentrazioni fino a 124 molecole per microlitro che indicano un'alta sensibilità. I campioni di pazienti con virus Zika provenienti dal Brasile sono stati testati per valutare l'accuratezza diagnostica clinica dei sensori utilizzando un lettore di piastre portatile.Un cambiamento di colore dal giallo al viola ha identificato un campione positivo. La risposta colorimetrica per ogni reazione cartacea è stata tracciata nel tempo dal software integrato sul lettore di piastre portatile PLUM. I campioni che hanno superato la soglia sono stati considerati positivi.Le prestazioni cliniche del sensore sono state stabilite rispetto a RT-qPCR. I campioni sono stati considerati positivi quando il valore soglia del ciclo era uguale o inferiore a 38. È importante assicurarsi che i risultati degli schermi degli interruttori toehold e della sensibilità del primer NASBA siano riproducibili e ottimizzati prima di procedere con gli studi sui pazienti.Data la sua semplicità e adattabilità, la piattaforma diagnostica qui descritta ha aperto la strada allo sviluppo di nuovi strumenti point of care che possono portare benefici al sistema sanitario, in particolare per i paesi a basso reddito.

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