Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

著者は、Green、Pardee、Penaの各研究室のすべてのメンバー、およびこの原稿で開示された研究に関連する以前の原稿のすべての共著者に感謝します。S.J.R.d.S.は、ブラジルのペルナンブコ科学技術財団(FACEPE)が後援する博士号フェローシップ(参照番号IBPG-1321-2.12/18)の支援を受けており、現在はカナダのトロント大学が後援するポスドクフェローシップの支援を受けています。PBは、トロント大学薬学部のウィリアムナップバックリー賞によってサポートされています。M.K.は、トロント大学内部フェローシップ番号PRMF2019-002の精密医療イニシアチブ(PRiME)の支援を受けました。この作業は、カナダ研究椅子プログラム(ファイル950-231075および950-233107)、トロント大学の主要研究プロジェクト管理基金、CIHR財団助成プログラム(201610FDN-375469)、およびCIHR / IDRCチーム助成金:カナダ-ラテンアメリカ/アメリカ-カリブ海ジカウイルスプログラム(FRN: 149783)、およびカナダの国際開発研究センター(助成金109434-001)からカナダの2019年新規コロナウイルス(COVID-19)迅速研究資金提供の機会を通じてK.P.への資金によって。この研究は、アリゾナ生物医学研究委員会の新人研究者賞(ADHS16-162400)、ゲイツ財団(OPP1160667)、NIHディレクターの新イノベーター賞(1DP2GM126892)、K.P./A.A.G.へのNIH R21賞(1R21AI136571-01A1)、およびアルフレッドP.スローンフェローシップ(FG-2017-9108)からのA.A.G.への資金によっても支援されました。 図1 は、K.P.へのアカデミックライセンスの下で Biorender.com で作成されました。

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K.P.とA.A.G.は、紙ベースのトーホールドセンサー関連技術の共同発明者です。Y.G.、S.C.、K.P.はLSK Technologies, Inc.の共同設立者であり、PLUM関連技術の共同発明者です。M.K.、K.P.、A.A.G.は、En Carta Diagnostics Ltd.の共同設立者です。他の著者には利益相反はありません。特許:PLUMデバイス:Y.G.、S.C.、およびK.P.特許出願はトロント大学によって提出され、LSKテクノロジーズ社に割り当てられました。 2020年2月27日に出願された米国仮特許出願第62/982,323号。Toeholdスイッチ特許:A.A.G.、P.Y.、およびJ.J.C.「リボレギュレーター組成物および使用方法」、特許。WO2014074648A3 2012年11月6日出願;紙ベースの診断特許:K.P.およびJ.J.C.「紙ベースの合成遺伝子ネットワーク」米国特許出願中No.US15 / 963,831 2013年12月6日出願;ジカ特許1:K.P.、A.A.G.、M.K.T.、D.B.、G.L.、T.F.、およびJ.J.C.、「Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform」、2016年10月4日出願の米国仮特許出願第62/403,778号;ジカ特許2:K.P.、A.A.G.、M.K.T.、D.B.、G.L.、T.F.、およびJ.J.C.、「Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform」、2016年5月25日出願の米国仮特許出願第62/341,221号。

ここで説明する紙ベースの複合システムは、RT-qPCRに機能的に匹敵する性能を備えた臨床的に関連する分子診断を必要な時点にまでもたらすことができます6。重要なのは、リモート設定の場合、オンサイトで診断を利用できるため、結果までの時間が数日から数時間に短縮される可能性があることです。このアプローチのプログラマビリティを強調して、説明されているパイプラインは、事実上あらゆる病原体標的を検出するために使用することができる。分子ツールと専用のポータブルプレートリーダーを組み合わせており、コンパクトでバッテリー動作(8〜9時間)と互換性があり、オンボードデータ分析を提供して分散アプリケーションを可能にします。他の研究では、RT-qPCRと並行して、268の患者サンプルを含むハードウェアとジカウイルス診断プラットフォームを組み合わせたものを検証し、98.5%24の診断精度を発見しました。まとめると、私たちの目標は、このプラットフォームの技術移転を研究者に提供し、満たされていない診断ニーズに対処するためにコミュニティによって再利用および改善できるようにすることです。
インシリコトーホールドスイッチの設計プロセスは、3つの段階に分けることができるパイプラインに統合および自動化されています。第1段階は、1ヌクレオチド刻みで標的配列にハイブリダイズするトーホールドスイッチデザインのプールを生成する。第2段階では、二次構造とトーホールドスイッチの可用性を調べ、フレーム内の早期停止コドンを持つセンサーを排除します。次に、複数の要因(トーホールドスイッチの欠陥レベル、トーホールドスイッチの可用性、ターゲットサイトのアクセシビリティなど)を考慮したスコアリング機能を実装して、全体的なスコアに基づいてトップトーホールドスイッチの設計を選択します。最終段階では、トップトーホールドスイッチデザインとそれに対応するターゲットトリガーのシーケンスのリストが生成されます。NCBI/Primer-BLAST25を使用して、ヒトトランスクリプトームおよび密接に関連するウイルスゲノムに対する特異性について、トップセンサー配列をスクリーニングする必要があります。また、ジカウイルスゲノムの配列保存のためにセンサーの標的部位をスクリーニングして、センサーが広範で堅牢な検出を提供することを確認することもベストプラクティスです。トーホールドスイッチ設計ソフトウェアのいくつかのバージョンが開発されており、設計アルゴリズムにより、ユーザーはシリーズA 6またはシリーズBのトーホールドスイッチ6の2つのバージョンを生成できます。この記事では、シリーズBのトーホールドスイッチの設計に焦点を当てました。
市販のDNA合成に続いて、トーホールドスイッチを迅速に組み立て、標的ゲノムの短い領域(200〜300 nt)に対応する合成標的トリガー配列に対して初期スクリーニングを実行することによって試験することができます。トーホールドスイッチベースのセンサーの性能をスクリーニングするには、RNAの形でターゲット配列を追加するのが理想的です。この記事では、 in vitro 転写トリガーRNAを追加するために必要な手順を概説しました。しかしながら、利用可能な場合、定量されたウイルスRNA抽出物または市販の合成RNAゲノムまたは標準などの完全長ゲノムテンプレートを使用することができる。最初のトーホールドスイッチスクリーニングに完全長RNAゲノムを使用することは、RNA二次構造などの追加の要因がセンサーの性能に影響を与えるかどうかを知らせることができるため、有益です。候補スイッチのON/OFF比を最適化するために、トーホールドスイッチDNAを無細胞反応に滴定することができます。このステップは、高性能のトーホールドスイッチ(フォールド増幅、または高いON/OFF比)を特定し、下流の特性評価ステップから漏れのあるトーホールドスイッチ(ターゲットRNAが存在しない場合の高シグナル)を省略するのにも役立ちます。
最高性能のトウホールドスイッチ候補の検出限界を改善するために、NASBAを使用して、標的ジカウイルスRNAの臨床的に関連する濃度を、トーホールドスイッチ6によって検出できるレベルまで増加させる。フォワードプライマーセットとリバースプライマーセットのさまざまな組み合わせをスクリーニングして、NASBAプライマーとトーホールドスイッチの最適な組み合わせを決定し、臨床的に関連する濃度での検出を可能にします。理想的なプライマーセットとトーホールドスイッチの組み合わせが特定されると、アッセイは臨床検証に進みます。トーホールドスイッチとNASBAスクリーニング段階は労力とリソースを大量に消費する可能性があるため、テスト開発は十分なリソースのある研究サイトに最適であることに注意することが重要です。プロセスの自動化は適用していませんが、これにより、反復的な設計、構築、およびテストサイクルが加速される可能性があります32。幸いなことに、センサーの設計とテストから展開までの所要時間は非常に短い(1週間未満)可能性があるため、この戦略は、流行の発生などのタイムクリティカルな状況に最適です6。
臨床的に関連する感度を持つバイオセンサーが開発された後でも、対処する必要のある技術的課題があります。このプロトコルは手動操作を含み、多段階の手順であるため、サンプル間の相互汚染のリスクがあります。私たちは、慎重な実験室での実践を通じてこのリスクを軽減するために最善を尽くしています。268人の患者サンプルを対象とした最近の臨床試験では、汚染の問題は発生しませんでした。ただし、これは重要な考慮事項です24。これを念頭に置いて、プロトコルは実験室でのアッセイのままであり、適切な分子生物学的手法を指揮する熟練したユーザーが必要です。展開に関する追加の考慮事項は、患者サンプルからのRNA単離です。ここでは、カラムベースの核酸抽出キットを使用したRNA単離について説明します。しかし、他の研究では、負担の少ない患者のサンプル処理に効果的で簡単な煮沸溶解法(95°Cで2分間)を実証しました6。この戦略は、RNA抽出に関連するコストをほぼ排除し、COVID-19パンデミック33などの危機の際に、低リソースの設定やサプライチェーンの問題でロジスティクスの課題を引き起こす可能性のあるカラムベースの核酸抽出キットの使用を回避します。
COVID-19のパンデミックで見たように、RT-qPCRを実行するために使用される機器自体がボトルネックとして機能し、患者の検査へのアクセスを制限する可能性があります。この要因は、主に財務的なものでもありますが、診断アクセスを制限する可能性のある集中テストモードにつながります。たとえば、2015/2016年のジカ熱の発生時には、ブラジルで利用可能な国立参照研究所が5つしかなかったため、患者の検査が遅れました。規模の経済の潜在的な利益を考慮しない限り、ポータブルプレートリーダーの現在の商品コストは~500米ドルであり、人件費と商業的マージンを考慮して5倍に増加したとしても、手頃な価格の機器を提供します。これは、15,000ドルから90,000ドルの34米ドルの価格の範囲のRT-qPCR機器によく匹敵します。さらに、ラテンアメリカでの無細胞アッセイの検査あたりの推定コストは約5.48米ドルですが、ブラジルでのRT-qPCRの検査あたりのコストは、ジカ熱の発生時に~10〜11米ドルでした36。機器のコストを超えて、ポータブルプレートリーダーは小さなフットプリント(20cm3)、自動分析、インターネット を介した クラウドへのデータアップロード、およびバッテリー電源で実行できます。これらの機能は、テストを展開できる潜在的な設定を劇的に拡大し、同時にサービスを提供できる患者人口を拡大します。
今日まで、最も一般的な商用大腸菌CFPSプラットフォームはS30およびPUREシステム37です。しかし、低・中所得国における診断へのアクセスを改善する上で重要な考慮事項は、これらの試薬の国内入手可能性が限られていることです。この課題を解決するための重要なステップは、現地CFPS生産の開発です。Federiciのラボは最近、ライセートベースの無細胞システムにトーホールドスイッチベースのセンサーを実装するための非商用プラットフォームの開発に向けて大きな進歩を遂げ、ジカウイルスRNA14で2.7 fM LODに達しました。この成果により、試薬を使用国で製造できるようになり、輸入関税や遅延を回避できるだけでなく、人件費も現地の料金に拡大するため、全体的なコストを大幅に削減できます。Federiciグループが概説した研究では、チリでのCFPS発現反応(5 μL)の製造コストは6.9セント(USD)35,38であり、ライセートベースのシステムを実装するための二重のインセンティブ(ロジスティクスとコストの改善)を提供しました35,38。
RT-qPCRと同等の検査を分散型診断ネットワークに配置することで、集中型RT-qPCR施設へのサンプルの輸送に依存する現在の慣行に比べて大きな利点がもたらされる可能性があります。ジカ熱の症例が集中していた都市周辺の環境では、患者と診断施設の物理的な距離が診断を遅らせ、臨床的に関連する時間に結果が患者に届かないリスクが高まります。ここで紹介する研究が、知識の移転を通じて、研究コミュニティが人間の健康、農業、環境モニタリングのための分散型バイオテクノロジーとポータブルハードウェアを作成できるようにすることに貢献できることを願っています。

RT-qPCRは、その優れた感度と特異性により、臨床診断のゴールドスタンダード技術であり続けています。この方法は非常に堅牢ですが、温度制御された流通と保管を必要とする高価で特殊な機器と試薬に依存します。これは、特に病気の発生時や設備の整ったラボへのアクセスが制限されている地域では、世界的に質の高い診断へのアクセスに大きな障壁をもたらします1,2。これは、ブラジルでの2015/2016年のジカウイルスの発生時に観察されました。RT-qPCR検査を提供できる集中検査室は5つしかないため、重大なボトルネックが発生し、診断へのアクセスが制限されていました。これは、発生によってより深刻な影響を受けた都市周辺の環境の個人にとって特に困難でした3,4。診断へのアクセスを改善するために、このプロトコルは、低リソース設定で分散型、低コスト、大容量の診断を提供する可能性のあるプラットフォームを示しています。この一環として、等温増幅および合成RNAスイッチベースのセンサーを紙ベースの無細胞発現システムと結合する診断発見パイプラインが確立されました5,6。
無細胞タンパク質合成(CFPS)システム、特に大腸菌ベースの無細胞システムは、環境モニタリング7,8から病原体診断5,6,9,10,11,12まで、幅広いバイオセンシングアプリケーションにとって魅力的なプラットフォームです。.転写と翻訳に必要なコンポーネントで構成されるCFPSシステムは、全細胞バイオセンサーに比べて大きな利点があります。具体的には、センシングは細胞壁によって制限されず、一般に、それらはモジュール設計であり、バイオセーフで、安価であり、携帯用に凍結乾燥することができる。遺伝子回路ベースの反応を紙や繊維などの基質上で凍結乾燥する能力は、輸送、室温での長期保存5、さらにはウェアラブル技術への組み込みを可能にします13。
これまでの研究では、大腸菌無細胞システムを使用して、水銀などの有毒金属、テトラサイクリン7,14などの抗生物質、内分泌かく乱化学物質15,16、馬尿酸17などのバイオマーカー、病原体関連クォーラムセンシング分子9,18、コカイン17、ガンマヒドロキシ酪酸(GHB)19などの違法物質など、多数の分析物を検出できることが実証されています。.核酸の配列特異的検出のための戦略は、ほとんどの場合、等温増幅技術に結合されたスイッチベースのバイオセンサーの使用に依存してきました。Toeholdスイッチは、リボソーム結合部位(RBS)と開始コドンを隔離することによって下流の翻訳をブロックするヘアピン構造を含む合成リボレギュレーター(テキストの残りの部分では単に「スイッチ」とも呼ばれます)です。それらの標的トリガーRNAと相互作用すると、ヘアピン構造が緩和され、レポーターオープンリーディングフレームの後続の翻訳が可能になる20。
等温増幅は、分子診断としても使用できます21;ただし、これらの方法は非特異的増幅を起こしやすく、特異性を低下させ、それによって検査の精度をRT-qPCR 22の精度以下に低下させる可能性があります。ここで報告された研究では、スイッチベースのセンサーの上流の等温増幅を使用して、核酸(フェムトモラーからアトモラー)の臨床的に関連する検出を可能にする複合信号増幅を提供しました。この2つの方法の組み合わせは、組み合わせて高レベルの特異性を提供する2つの配列特異的チェックポイントも提供します。このアプローチを使用して、以前の研究では、ジカ6、エボラ5、ノロウイルス10などのウイルス、および C.ディフィシル23 や抗生物質耐性腸チフス12などの病原性細菌の検出が実証されています。最近では、COVID-19パンデミックにアクセス可能な診断を提供するために、SARS-CoV-2検出用のセルフリートーホールドスイッチが実証されています11、12、13。
以下のプロトコルは、 インシリコ バイオセンサーの設計から組み立てと最適化のステップ、患者サンプルによるフィールドバリデーションまで、ジカウイルス検出のための無細胞紙ベースの合成トーホールドスイッチアッセイの開発と検証の概要を示しています。このプロトコルは、RNAトーホールドスイッチベースのセンサーとジカウイルスRNAに特異的な等温増幅プライマーの インシリコ 設計から始まります。多数の等温増幅法が存在するが、ここでは核酸配列ベースの増幅(NASBA)を使用して反応中に存在するウイルスRNA標的の濃度を増加させ、臨床的に有意な感度を可能にすることが実証された。実際には、等温増幅法は一定の温度で動作するという利点があり、一般的に集中的な場所に限定されているサーマルサイクラーなどの特殊な機器が不要になります。
次に、オーバーラップ伸長PCRを介してレポーターコード配列を備えた合成トーホールドスイッチセンサーを組み立て、合成RNAを使用して無細胞系で最適な性能が得られるように合成トーホールドスイッチセンサーをスクリーニングするプロセスについて説明します。このジカウイルスセンサーのセットでは、比色基質であるクロロフェノールレッド-β-D-ガラクトピラノシド(CPRG)を切断できるβ-ガラクトシダーゼ酵素をコードする lacZ 遺伝子を選択して、目またはプレートリーダーで検出できる黄色から紫色の色の変化を生成します。最高性能の合成スイッチが同定されたら、合成RNAを使用して対応する標的配列の核酸配列ベースの等温増幅のためのプライマーをスクリーニングし、最良の感度を提供するセットを見つけるためのプロセスが説明される。
最後に、診断プラットフォームの性能はラテンアメリカの現場で検証されます(図1)。臨床診断の精度を判断するために、患者からのジカウイルスサンプルを使用して紙ベースの無細胞アッセイが実行されます。並行して、比較のためにゴールドスタンダードのRT-qPCRアッセイが実行されます。比色無細胞アッセイをモニタリングするために、サーマルサイクラーが利用できない領域での結果のオンサイト定量を可能にします。ポータブル、低コスト、ユーザーフレンドリー、マルチモーダルと呼ばれる手作業で組み立てられたプレートリーダー(PLUM、以下、ポータブルプレートリーダーと呼びます)もここで紹介されています24。当初は無細胞合成トーホールドスイッチ診断のコンパニオンデバイスとして開発されたポータブルプレートリーダーは、ハイスループットな方法で結果をインキュベートして読み取るためのアクセス可能な方法を提供し、統合されたコンピュータービジョンベースのソフトウェア分析をユーザーに提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> 図1:紙ベースの無細胞トーホールドスイッチ反応を使用して患者サンプルをテストするためのワークフロー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

検査のためにコミュニティに展開できる低負担の分子診断へのアクセスはますます重要であり、社会の幸福と経済的安定に有意義な幅広い影響を及ぼします。近年、迅速で低コストの分子診断のニーズを満たすために、いくつかの新しい等温診断モダリティが登場しています。私たちは、ゴールドスタンダードの逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)ベースのアッセイに匹敵する性能を提供する、蚊媒介性ジカウイルスおよびチクングニアウイルスの診断を含む、トーホールドスイッチベースの診断の開発と患者の検証を通じてこの取り組みに貢献してきました。これらの診断は、開発と製造が安価であり、リソースの少ない環境に診断能力を提供する可能性があります。ここでは、プロトコルは、ジカウイルス検出のためのスイッチベースのアッセイの開発に必要なすべてのステップを提供します。この記事では、段階的な診断開発プロセスを読者に説明します。まず、ジカウイルスのゲノム配列は、オープンソースソフトウェアを使用した候補スイッチの計算設計のための入力として機能します。次に、合成RNA配列を用いた経験的スクリーニングのためのセンサーの組み立てと診断感度の最適化を示します。完了すると、RT-qPCRと専用の光学リーダーであるPLUMと並行して患者サンプルを使用して検証が実行されます。この研究は、人間の健康、農業、および環境モニタリングのアプリケーション向けの低コストのトーホールドスイッチベースのセンサーを開発するための技術ロードマップを研究者に提供します。

計算設計パイプラインに続いて、3つのトーホールドスイッチの構築がPCRによって実行されました。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動を用いて分析した(図2)。3,000 bp付近のクリアバンドの存在は、トーホールドスイッチに結合した lacZ 遺伝子とほぼ同じ大きさであり、典型的には反応が成功したことを示している。または、バンドのないレーン、複数のバンド、または正しくないサイズのバンドは、PCRが失敗したことを示します。PCRが失敗した場合は、反応条件やプライマー配列を最適化する必要があります。
組み立てられたトーホールドスイッチをスクリーニングして、それぞれの in vitro 転写トリガーRNAに対して各センサーを評価しました(図3)。3つのセンサーはすべてOD570 の吸光度の増加を示しましたが、スイッチ27B(図3A)は最も速いオンレートを示しました。スイッチ33Bおよび、程度は低いが47Bは、標的トリガーRNAの非存在下でOD570 吸光度の増加を示し、これらのスイッチが何らかのバックグラウンド活性またはリーク性を有することを示している(図3B、C)-特異性を低下させる可能性があるため、候補センサーには望まれない特性。ON/OFF信号比が最も高いセンサーをより明確に識別するために、OD570 吸光度の倍率変化を計算し(補足情報のセクション5を参照)、プロットしました(図4)。この分析から、スイッチ27BがON/OFF比約60で最高の性能を発揮するセンサであることが明らかである。
次に、最高性能のトーホールドスイッチ(27B)の感度を、NASBA反応と結合したときにトーホールドスイッチを活性化するのに必要な最低RNA濃度を決定することによって評価しました。このグラフは、最高性能のジカ熱センサーが、μLあたり1.24分子という低い濃度(~2 aMに相当)のRNAを検出できることを示しています。 図5)。
スイッチ27Bが特定され検証された後、センサー材料はブラジルのペルナンブコ州のレシフェのチームメンバーに配布されました。ブラジルでは、ジカウイルス診断プラットフォームの臨床診断精度を、比較のためにRT-qPCRと並行して、ジカウイルス患者サンプルを使用して評価しました。紙ベースのジカ熱診断プラットフォームを検証するために、紙ベースのセンサーの比色出力をインキュベートして読み取ることができるポータブルプレートリーダーを使用しました。黄色から紫への色の変化は陽性サンプルを識別するために使用されますが、陰性サンプルは黄色のままです(図6)。ポータブルプレートリーダー(図8)によって生成された結果を視覚化するための追加のオプションは、各紙ベースの反応の比色応答を経時的にプロットすることです。サンプルは3回でテストされ、しきい値を超えたサンプル(赤い線を1に設定)は陽性と見なされ、しきい値を下回るサンプルは陰性と見なされました(図6 および 図7)。
最後に、ジカトウホールドスイッチセンサーの臨床性能を、ジカウイルス感染を診断するための現在のゴールドスタンダードの方法と比較するために、すべての患者サンプルをRT-qPCRと並行してテストしました。2つの代表的な患者サンプルの増幅プロットを、RT-qPCRによるジカウイルスの検出についてトリプリケートでテストしました(図9)。サイクルしきい値(Ct)値が≤38の場合、サンプルは陽性と見なされます。赤い線は陽性サンプルを示し、青い線はジカウイルスの陰性サンプルを示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> 図2:PCR産物の品質を評価するためのアガロースゲル電気泳動。 PCR産物は、1X TAE中の1%アガロースゲルで分析され、80 Vで90分間実行されます。通常、単一のクリアバンドは反応が成功したことを示します。レーン1:1 kb DNAラダー;レーン2〜4:それぞれ27BスイッチDNA、33BトリガーDNA、および47BトリガーDNA。左側の数字はバンド サイズを bp で表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> 図3:紙ベースのジカセンサー用の3つのトーホールドスイッチのプロトタイピング。 3つの紙ベースのRNAトーホールドスイッチセンサーの性能を37°Cで130分以上測定しました。各グラフには 2 つのトレースが含まれており、1 つはスイッチのみのコントロールを表し、もう 1 つはスイッチとトリガーを表します。3つのグラフは、トーホールドスイッチセンサ27B(A)、33B(B)、および47B(C)を用いて取得されたデータを表す。エラーバーは、3回の反復からの平均(SEM)の標準誤差を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> 図4:570 nmでの吸光度の倍率変化を計算することによって、最も高性能なセンサーを特定します。 フォールド変化(または最大ON/OFF比)は、スイッチのみのコントロールとスイッチプラストリガーCFPSアッセイの間の130分での吸光度(OD570)の比を測定することによって計算されます。エラーバーは、3回の反復からのSEMを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> 図5:最高性能のスイッチの感度評価。 インビトロ 転写されたジカRNAはNASBA反応に滴定されます。1時間のインキュベーション後、反応物を紙ディスク上の無細胞PURExpress反応に1:7の比率で添加しました。37°Cで130分後のフォールド変化をプロットした。このフィギュアは24から再現しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> 図6:キャプチャされた画像データがロードされたポータブルプレートリーダーキャプチャページ。 この図は、データ収集実行中にポータブルプレートリーダーによってキャプチャされた最終画像のサンプル画像を示しています。元の日付/タイムスタンプは、画像の上部に表示されます。黄色は対照反応または陰性反応を示し、紫色は陽性反応を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> 図7:データ分析モード。 左側で、ユーザーはプロットするデータセットを選択します。グラフは、サンプルまたはコントロールセットごとに一意の色で右側に表示されます。赤い破線は、陽性および陰性のサンプルを決定するためのしきい値として機能します。閾値を超える3連でテストされたサンプルは陽性と見なされ、閾値を下回るサンプルは陰性と見なされます。エラーバーは、3回の反復からの標準偏差(SD)を表します。Ctrl 1 から Ctrl 5 はコントロールを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> 図 8.プラム、ポータブルプレートリーダー。 このポータブルプレートリーダーは、ラボインボックスとして機能し、比色反応をインキュベートおよび監視するための温度制御プレートリーダーとして機能します。このポータブルデバイスは、紙ベースのジカセンサーの定量的かつ高スループットな測定を現場で提供できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> 図9:ジカウイルスの検出のために3連でテストされた2つの患者サンプルの増幅のRT-qPCRプロット。 サイクル閾値(Ct)値が≤38の場合、サンプルは陽性と見なされます。赤い点線は、陽性および陰性のサンプルを決定するためのしきい値として機能します。赤いトレースは陽性サンプルを示し、青いトレースは陰性サンプルを示します。ΔRn(デルタRn)値は、試験したすべてのサンプルについてRT-qPCR装置によって検出された蛍光シグナルの正規化された大きさを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足プロトコル ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">これらの図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

分散型テストのためにコミュニティに展開できる分散型、低コスト、大容量の診断へのアクセスは、世界的な健康危機と戦うために重要です。この原稿では、ポータブル光学リーダーで検出できるウイルスRNA配列の紙ベースの診断を構築する方法について説明します。

紙ベースのトーホールドスイッチ診断の開発と患者検証のための設計から実装までの研究

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

私たちのプロトコルは、遺伝子回路ベースの診断の設計、組み立て、および検証について説明しています。これらの紙ベースの分子診断は、低コストで高感度であり、臨床的に関連する濃度の核酸を検出でき、事実上あらゆる配列を検出するように設計できます。これは、ユーザーがニーズに合わせて設計できるプラットフォームテクノロジーであり、臨床グレードの診断をより分散型の歯科リソース設定に持ち込む可能性があります。セルフリートーホールドスイッチセンサーは、ほぼすべての核酸ベースのターゲット用に設計できます。最近の研究では、エボラ出血熱、ノロウイルス、SARS-CoV-2、C.ディフィシル、腸チフスの原因となる細菌の無細胞診断が実証されています。手順を実演するのは、ポスドクのセヴェリーノ・ジェファーソン・リベロ・ダ・シルバと、私の研究室の博士課程の学生であるプーリヤ・バヤットです。トーホールドスイッチを設計するには、テキストプロトコルに記載されているように、ジカウイルスゲノムからターゲット配列を特定し、アンプリコンからジカウイルスターゲット配列を選択します。トーホールドスイッチ設計ソフトウェアパッケージをダウンロードします。MATLABを開き、設計ソフトウェアフォルダに移動します。入力サブフォルダーにあるデザイン入力ファイルのcsvファイルにターゲットシーケンスを入力します。設計関数に使用するパラメータを選択します。計画関数を実行して、対象のターゲットのトーホールドスイッチ計画を生成します。完了したら、final_designsフォルダーに移動し、csv形式のスプレッドシートでトップトーホールドスイッチデザインシーケンスと対応するターゲットシーケンスを見つけます。アルゴリズムによって生成されたトーホールドスイッチDNA配列に、5つのプライム末端にT7プロモーター配列が含まれ、3つのプライム末端に保存された21ヌクレオチドリンカー配列が含まれていることを確認します。NCBI BLASTを使用して、配列の相同性をチェックすることにより、トップトーホールドスイッチの設計シーケンスを他の一般的なウイルスに対してスクリーニングします。ヘモロジーが40%未満の配列を受け入れます。トーホールドスイッチヘアピンDNAオリゴと逆増幅プライマーの溶液をヌクレアーゼフリー水中で10マイクロモルの濃度で調製します。この表に従って、氷上のPCRチューブで反応を組み立てます。この表にリストされているサイクリング条件に従って、反応チューブをサーモサイクラーに入れます。アガロースゲルでPCR産物を分析します。PCR産物を精製し、最小限の量のヌクレアーゼフリー水でDNAを溶出して、十分に高い濃度を確保します。分光光度計を使用してDNAを定量します。25ミリグラムの粉末を1ミリリットルのヌクレアーゼフリー水に溶解してCPRGストック溶液を調製します。ここに示す標準プロトコルに従って、氷上でマスターミックスを準備します。無細胞マスターミックスをPCRチューブに分注します。セルフリーコントロールおよびスイッチアローンコントロールの場合は、ヌクレアーゼフリーの水を5.94マイクロリットルの容量まで追加します。また、反応のために、PCR精製されたトーホールドスイッチDNAを追加して、33ナノモルの最終濃度を取得します。トーホールドスイッチとターゲットRNAの組み合わせをテストするには、in vitroで転写されたターゲットRNAを最終濃度1マイクロモルまで追加します。ピペッティングと遠心分離機ですべての反応を完全に混合します。黒く透明な底の384ウェルプレートで、反応ウェルの周囲のウェルに30マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を追加します。次に、2ミリメートルの生検パンチとピンセットを使用して、BSAブロックされたろ紙ディスクを切断し、反応ウェルに入れます。各反応チューブから384ウェルプレートのろ紙ディスクに1.8マイクロリットルを384ウェルプレートで分注します。プレートを透明なPCRフィルムで覆い、プレートリーダーに入れます。摂氏37度で570ナノメートルの吸光度を毎分130分間測定します。すべてのフォワードプライマーセットとリバースプライマーセットの25マイクロモルストック溶液をヌクレアーゼフリー水中で調製します。ここに示すマスターミックスを使用して5マイクロリットルの反応を設定します。白色沈殿物が可溶になるまでピペッティングで混合し、PCRチューブに分注します。フォワードプライマーとリバースプライマーを適切なチューブに加え、続いて1マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水または2ピコモルのターゲットトリガーRNAを加えます。穏やかなピペッティングで混合し、チューブを短時間回転させます。ここに示すように、サーモサイクラーでインキュベーションプロトコルを設定します。12分後、チューブを取り外し、各チューブに1.25マイクロリットルの酵素ミックスを加え、続いて混合と遠心分離を行います。摂氏41度のホールドステップをスキップした後、チューブをサーモサイクラーに戻し、1時間の反応インキュベーションを開始します。次に、プライマーの性能を評価するために、紙ベースのセルフリートーホールドスイッチ反応を組み立て、データを分析します。感度解析では、候補プライマーペアを特定し、ヌクレアーゼフリー水中でターゲット RNA の段階希釈液を調製します。NASBAおよび無細胞反応を、生物学的トリプリケート中の選択されたプライマーセットで繰り返します。抽出した患者RNA1マイクロリットルを用いて、セクション5に示すようにNASBA増幅および紙ベースの無細胞反応を行う。反応後、384ウェル反応プレートを準備し、ポータブルプレートリーダーで37°Cでアッセイを実行します。次に、RT-qPCRコンポーネントを組み立て、この表に従って1.5ミリリットルの微量遠心チューブに試薬を追加します。ピペッティングで反応を混合します。96ウェルまたは384ウェルPCRプレートの各ウェルに6.5マイクロリットルを分注し、続いて各RNAテンプレートを3.5マイクロリットルずつ3.5マイクロリットルずつ分注します。プレートの上部にPCRフィルムを置きます。384ウェルプレートを600倍Gで2分間遠心分離します。プレートをRT-qPCRマシンに入れ、ここに示すようにサイクリング条件を実行します。計算設計に続いて、3つのトーホールドスイッチを構築し、アガロースゲル電気泳動を使用して分析しました。約3, 000塩基対のバンドが反応の成功を示した。トーホールドスイッチは、それぞれのin vitro転写トリガーRNAに対して評価されました。3つのセンサーはすべて吸光度の増加を示したが、センサ27Bは最も速いオンレートを示したが、スイッチ33Bおよび47Bはバックグラウンド活性を示す低いオン/オフ比を有し、特異度が低下した。570ナノメートルでの吸光度の倍率変化は、スイッチ27Bがオン/オフ信号比で最高の性能を有することを示した。さらに、NASBAと組み合わせると、マイクロリットルあたり124分子という低い濃度のRNAを検出でき、高感度です。ブラジルからのジカウイルス患者サンプルは、ポータブルプレートリーダーを使用してセンサーの臨床診断精度を評価するためにテストされました。黄色から紫への色の変化は、陽性サンプルを特定しました。各紙ベースの反応の比色応答は、PLUMポータブルプレートリーダー上の統合ソフトウェアによって経時的にプロットされました。閾値を超えたサンプルは陽性とみなされた。センサーの臨床性能は、RT-qPCRとの比較によって確立されました。サンプルは、サイクルしきい値が38以下の場合に陽性と見なされました。患者の試験を進める前に、トーホールドスイッチスクリーンとNASBAプライマー感度の結果が再現性があり、最適化されていることを確認することが重要です。そのシンプルさと適応性を考えると、ここで説明する診断プラットフォームは、特に低所得国にとって、医療システムに利益をもたらすことができる新しいポイントオブケアツールの開発への道を開きました。

Research

JoVE Journal

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