Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Forfatterne takker alle medlemmer av Green, Pardee og Pena laboratorier, samt alle medforfattere av tidligere manuskripter knyttet til arbeidet som er beskrevet i dette manuskriptet. SJRDS ble støttet av et doktorgradsstipend sponset av Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasil, referansenummer IBPG-1321-2.12/18, og støttes for tiden av et postdoktorstipend sponset av University of Toronto, Canada. PB støttes av William Knapp Buckley Award fra Fakultet for farmasi, University of Toronto. M.K. ble støttet av Precision Medicine Initiative (PRiME) ved University of Toronto interne fellesskap nummer PRMF2019-002. Dette arbeidet ble støttet av midler til K.P fra Canada Research Chairs Program (Files 950-231075 og 950-233107), University of Toronto's Major Research Project Management Fund, CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469), og til L.P, A.A.G. og K.P gjennom CIHR / IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), samt av midler til K.P. fra Canadas International Development Research Center (stipend 109434-001) gjennom Canadian 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Dette arbeidet ble også støttet av midler til AAG fra en Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), Gates Foundation (OPP1160667), en NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), en NIH R21-pris (1R21AI136571-01A1) til K.P./A.A.G, og et Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). Figur 1 ble opprettet med Biorender.com under akademisk lisens til K.P.

<ol>
	<li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world.">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, 73-79 (2006).</li><li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+diagnostics+for+global+health.">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil.">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+Early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis.">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li><li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants.">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li><li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor.">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).</li><li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment.">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li><li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors.">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li><li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics.">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li><li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection.">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li><li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter.">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR&#946;-specific+endocrine+disruptors.">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTR&#946;-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine:+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach.">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li><li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors.">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li><li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis.">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li><li>Gr&#228;we, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper-based,+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs.">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).</li><li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toehold+Switches:+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression.">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li><li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics:+a+critical+review.">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li><li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification.">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers.">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li><li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples.">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li><li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information.">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li><li>. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022)</li><li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+(NASBA).">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li><li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization.">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).</li><li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+automated+DNA+assembly:+Best+practices,+metrics,+and+protocols+using+robots.">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).</li><li>Silva, S. J. R., de Magalh&#227;es, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+circulation+of+DENV,+CHIKV,+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil:+An+inconvenient+truth.">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205 (2021).</li><li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso.">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li><li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts.">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).</li><li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+(RT-LAMP)+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil.">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li></ol>

K.P. og A.A.G. er medoppfinnere av papirbaserte tåholdsensorrelaterte teknologier. Y.G., S.C. og K.P. er medstiftere av LSK Technologies, Inc., og er medoppfinnere av PLUM-relaterte teknologier. M.K., K.P. og A.A.G. er medgrunnleggere av En Carta Diagnostics Ltd. Andre forfattere har ingen interessekonflikter. Patenter: PLUM-enhet: Y.G., S.C., og K.P. patentsøknad ble innlevert av University of Toronto og tildelt LSK Technologies Inc. US Provisional Patent Application No. 62/982,323 arkivert februar 27, 2020; Toehold switch patent: A.A.G., P.Y., og J.J. C. "Riboregulator komposisjoner og metoder for bruk", Patent. WO2014074648A3 arkivert 6. november 2012; Papirbasert diagnostisk patent: K.P. og J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" USAs patentsøkte nr. US15/963,831 arkivert 6. desember 2013; Zika patent 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., og J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform," US Provisional Patent Application No. 62/403,778 arkivert 4. oktober 2016; Zika patent 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., og J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform," US Provisional Patent Application No. 62/341,221 arkivert 25. mai 2016.

Det kombinerte papirbaserte systemet beskrevet her kan bringe klinisk relevant molekylær diagnostikk, med ytelse som er funksjonelt sammenlignbar med RT-qPCR, til behovspunktet6. Det er viktig at for eksterne innstillinger kan tilgjengeligheten av diagnostikk på stedet redusere tiden til resultatene fra dager til timer. Ved å fremheve programmerbarheten til denne tilnærmingen, kan rørledningen som er beskrevet, brukes til å oppdage praktisk talt alle patogenmål. Vi har paret de molekylære verktøyene med en spesialbygd bærbar plateleser, som er kompakt og kompatibel med batteridrift (8–9 timer) og gir innebygd dataanalyse for å muliggjøre distribuerte applikasjoner. I annet arbeid har vi validert den kombinerte maskinvare- og Zika-virusdiagnostiske plattformen med 268 pasientprøver, parallelt med RT-qPCR, og funnet en diagnostisk nøyaktighet på 98,5%24. Samlet sett er målet vårt å muliggjøre teknologioverføring av denne plattformen til forskere slik at den kan brukes på nytt og forbedres av samfunnet for å møte udekkede diagnostiske behov.
Designprosessen for in silico toehold-bryteren er integrert og automatisert i en rørledning som kan deles inn i tre trinn. Den første fasen genererer et basseng med tåholdbryterdesign som hybridiserer til målsekvensen i trinn på ett nukleotid. Den andre fasen undersøker tilgjengeligheten av sekundærstrukturen og tåholdbryteren og eliminerer sensorer med for tidlige stoppkodoner i rammen. En scoringsfunksjon som vurderer flere faktorer (f.eks. feilnivå for toehold-bryteren, tilgjengeligheten av toehold-bryteren og tilgjengelighet på målstedet) implementeres deretter for å velge de beste tåholdbryterdesignene basert på samlede poengsummer. I sluttfasen genereres en liste over sekvenser for de øverste tåholdbryterdesignene og deres tilsvarende målutløsere. De øverste sensorsekvensene bør screenes for spesifisitet mot det humane transkriptomet og nært beslektede virale genomer ved bruk av NCBI/Primer-BLAST25. Det er også beste praksis å skjerme sensormålstedene for sekvensbevaring i Zika-virusgenomet for å sikre at sensorene vil gi bred og robust deteksjon. Flere versjoner av toehold switch design programvare er utviklet og designalgoritmen tillater brukere å generere to versjoner, enten serie A 6 eller serie B toehold brytere6. I denne artikkelen har fokuset vært på serie B toehold switch design.
Etter kommersiell DNA-syntese kan tåholdbryterne raskt settes sammen, og deretter testes ved å utføre en innledende skjerm mot en syntetisk målutløsersekvens som tilsvarer korte regioner (200-300 nt) av målgenomet. For screening av ytelsen til tåholdbryterbaserte sensorer, er det ideelt å legge til målsekvensen i form av RNA. I denne artikkelen er trinnene som kreves for å legge til in vitro transkribert utløser-RNA skissert. Imidlertid, hvis tilgjengelig, kan full-lengde genommaler som kvantifiserte virale RNA-ekstrakter eller kommersielle syntetiske RNA-genomer eller standarder brukes. Bruk av RNA-genomer i full lengde for innledende toehold-bryterscreening er gunstig, da det kan informere om flere faktorer, for eksempel RNA-sekundærstruktur, vil påvirke sensorens ytelse. For å optimalisere ON/OFF-forholdet mellom kandidatbrytere, kan toehold-bryterens DNA titreres til den cellefrie reaksjonen. Dette trinnet kan også tjene til å identifisere høytytende tåholdbrytere (foldforsterkning eller høyt ON / AV-forhold) og utelate lekkende tåholdbrytere (høyt signal i fravær av mål-RNA) fra nedstrøms karakteriseringstrinn.
For å forbedre deteksjonsgrensen for de beste toehold-bryterkandidatene, brukes NASBA til å øke klinisk relevante konsentrasjoner av mål Zika viral RNA til et nivå som kan oppdages av toehold-brytere6. Ulike kombinasjoner av fremre og bakover primersett screenes for å bestemme de beste NASBA-primer- og tåholdbryterkombinasjonene for å muliggjøre deteksjon ved klinisk relevante konsentrasjoner. Når et ideelt primersett og toehold-bryterkombinasjon er identifisert, blir analysen tatt frem til klinisk validering. Det er viktig å merke seg at toehold-bryteren og NASBA-screeningsstadiene kan være arbeids- og ressurskrevende, og derfor er testutvikling best egnet for ressurssterke forskningssteder. Selv om vi ikke har brukt prosessautomatisering, er det sannsynlig at dette kan akselerere den iterative design-, bygge- og testsyklusen32. Heldigvis kan behandlingstiden fra sensordesign og testing til distribusjon være bemerkelsesverdig kort (mindre enn en uke), noe som gjør denne strategien ideell for tidskritiske situasjoner, for eksempel epidemiske utbrudd6.
Selv etter at en biosensor med klinisk relevant sensitivitet er utviklet, er det tekniske utfordringer som må løses. Siden denne protokollen innebærer manuell betjening og er en flertrinnsprosedyre, er det fare for krysskontaminering mellom prøvene. Vi gjør vårt beste for å redusere denne risikoen gjennom nøye laboratoriepraksis. I en nylig klinisk studie av 268 pasientprøver møtte vi ingen forurensningsproblemer; Det er imidlertid et viktig hensyn24. Med dette i bakhodet forblir protokollen en laboratorieanalyse og krever en dyktig bruker med kommando av riktige molekylærbiologiske teknikker. En ekstra vurdering for distribusjon er RNA-isolasjonen fra pasientprøver. Her beskriver vi RNA-isolasjon ved hjelp av kolonnebaserte nukleinsyreekstraksjonssett. I andre arbeider har vi imidlertid vist en effektiv og enkel kokelysemetode (95 °C i 2 min) for pasientprøvebehandling med lav belastning6. Denne strategien eliminerer nesten kostnadene forbundet med RNA-ekstraksjon og unngår bruk av kolonnebaserte nukleinsyreekstraksjonssett, noe som kan utgjøre en logistikkutfordring i lavressursinnstillinger eller forsyningskjedeproblemer under kriser, for eksempel COVID-19-pandemien33.
Som vi har sett under COVID-19-pandemien, kan instrumentene som brukes til å utføre RT-qPCR selv tjene som en flaskehals og begrense pasientens tilgang til testing. Denne faktoren, som også i stor grad er økonomisk, fører til en sentralisert testmodus som kan begrense diagnostisk tilgang. For eksempel, under Zika-utbruddet 2015/2016, var bare fem nasjonale referanselaboratorier tilgjengelige i Brasil, noe som forårsaket forsinkelser i pasienttesting. Uten å vurdere den potensielle fordelen med stordriftsfordeler, er dagens varekostnad for den bærbare plateleseren ~ $ 500 USD, som selv om den økes fem ganger for å ta hensyn til arbeidskraft og kommersiell margin, fortsatt gir et rimelig instrument. Dette sammenligner godt med RT-qPCR-instrumenter som varierer i pris fra $ 15.000 - $ 90.000 USD34. Videre er den estimerte kostnaden per test for den cellefrie analysen i Latin-Amerika rundt $ 5.48 USD, mens kostnaden per test av RT-qPCR i Brasil var ~ $ 10-11 USD på tidspunktet for Zika-utbruddet36. Utover kostnadene for utstyr har den bærbare plateleseren et lite fotavtrykk (20 cm3), automatisk analyse, dataopplasting til skyen via internett, og kan kjøres på batteristrøm. Disse funksjonene utvider dramatisk de potensielle innstillingene der testing kan distribueres og samtidig utvider pasientpopulasjonen som kan betjenes.
Til dags dato er de vanligste kommersielle E. coli CFPS-plattformene S30 og PURE systems37; Et viktig hensyn for å forbedre tilgangen til diagnostikk i lav- og mellominntektsland er imidlertid den begrensede innenlandske tilgjengeligheten av disse reagensene. Et viktig skritt mot å løse denne utfordringen er utviklingen av lokal CFPS-produksjon. Federici-laboratoriet har nylig gjort betydelige fremskritt mot å utvikle en ikke-kommersiell plattform for å implementere toehold-bryterbaserte sensorer i lysatbaserte cellefrie systemer, og nå en 2,7 fM LOD med Zika-virus RNA14. Ikke bare tillater denne oppnåelsen at reagensene kan gjøres i brukslandet, og unngår importtariffer og forsinkelser, men lønnskostnadene skaleres også til lokale priser, og dermed kan den totale kostnaden reduseres betydelig. I arbeidet skissert av Federici-gruppen var kostnadene ved å produsere CFPS-uttrykksreaksjonen (5 μL) i Chile 6,9 cent (USD) 35,38, noe som gir et dobbelt insentiv (forbedret logistikk og kostnad) for å implementere lysatbaserte systemer 35,38.
Plasseringen av RT-qPCR-sammenlignbar testing i distribuerte diagnostiske nettverk kan gi betydelige fordeler i forhold til dagens praksis som er avhengig av transport av prøver til sentraliserte RT-qPCR-anlegg. I peri-urbane omgivelser, hvor Zika-tilfeller var konsentrert, reduserer den fysiske avstanden mellom en pasient og det diagnostiske anlegget diagnosen og øker risikoen for at resultatene ikke når pasienten på et klinisk relevant tidspunkt. Det er vårt håp at arbeidet som presenteres her kan bidra til at forskningsmiljøet, gjennom overføring av kunnskap, kan skape desentralisert bioteknologi og bærbar maskinvare for menneskers helse, landbruk og miljøovervåking.

RT-qPCR har forblitt gullstandardteknologien for klinisk diagnostikk på grunn av sin utmerkede følsomhet og spesifisitet. Selv om metoden er svært robust, er den avhengig av dyrt, spesialisert utstyr og reagenser som krever temperaturkontrollert distribusjon og lagring. Dette gir betydelige barrierer for tilgjengeligheten av kvalitetsdiagnostikk globalt, spesielt i tider med sykdomsutbrudd og i regioner der tilgangen til velutstyrte laboratorier er begrenset 1,2. Dette ble observert under Zika-virusutbruddet 2015/2016 i Brasil. Med bare fem sentraliserte laboratorier tilgjengelig for å tilby RT-qPCR-testing, resulterte betydelige flaskehalser, noe som begrenset tilgangen til diagnostikk. Dette var spesielt utfordrende for personer i peri-urbane omgivelser, som ble mer alvorlig påvirket av utbruddet 3,4. I et forsøk på å forbedre tilgangen til diagnostikk, viser protokollen en plattform som er utviklet med potensial til å gi desentralisert, rimelig og høykapasitetsdiagnostikk i lavressursinnstillinger. Som en del av dette ble det etablert en diagnostisk oppdagelsesrørledning, som koblet isotermisk forsterkning og syntetiske RNA-bryterbaserte sensorer med papirbaserte cellefrie uttrykkssystemer 5,6.
Cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS), spesielt E. coli-baserte cellefrie systemer, er en attraktiv plattform for et bredt spekter av biosensingsapplikasjoner fra miljøovervåking 7,8 til patogendiagnostikk 5,6,9,10,11,12 . CFPS-systemer består av komponentene som er nødvendige for transkripsjon og oversettelse, og har betydelige fordeler i forhold til helcellebiosensorer. Spesielt er sensing ikke begrenset av en cellevegg, og generelt er de modulære i design, biosafe, billig og kan frysetørkes for bærbar bruk. Evnen til å frysetørke genkretsbaserte reaksjoner på underlag som papir eller tekstiler, muliggjør transport, langtidslagring ved romtemperatur5, og til og med innlemmelse i bærbar teknologi13.
Tidligere arbeid har vist at E. coli-cellefrie systemer kan brukes til å oppdage mange analytter, for eksempel giftige metaller som kvikksølv, antibiotika som tetracyklin 7,14, hormonforstyrrende kjemikalier15,16, biomarkører som hippursyre 17, patogenassosierte quorumsfølermolekyler 9,18 og ulovlige stoffer som kokain 17 og gammahydroksybutyrat (GHB)19 . For sekvensspesifikk påvisning av nukleinsyrer har strategier for det meste vært avhengig av bruk av bryterbaserte biosensorer koblet til isotermiske forsterkningsteknikker. Toehold-brytere er syntetiske riboregulatorer (også referert til som bare "brytere" i resten av teksten) som inneholder en hårnålsstruktur som blokkerer nedstrøms oversettelse ved å sekvestrere det ribosomale bindingsstedet (RBS) og startkodonet. Ved interaksjon med målutløseren RNA blir hårnålsstrukturen lettet og påfølgende oversettelse av en reporter åpen leseramme er aktivert20.
Isotermisk forsterkning kan også brukes som molekylær diagnostikk21; Imidlertid er disse metodene utsatt for ikke-spesifikk forsterkning, noe som kan redusere spesifisiteten og dermed nøyaktigheten av testen til under RT-qPCR 22. I arbeidet som er rapportert her, ble isotermisk forsterkning oppstrøms for bryterbaserte sensorer brukt til å gi kombinert signalforsterkning som muliggjør klinisk relevant deteksjon av nukleinsyrer (femtomolar til attomolar). Denne sammenkoblingen av de to metodene gir også to sekvensspesifikke sjekkpunkter som i kombinasjon gir et høyt spesifisitetsnivå. Ved hjelp av denne tilnærmingen har tidligere arbeid vist påvisning av virus som Zika6, Ebola5, Norovirus10, samt patogene bakterier som C. difficile23 og antibiotikaresistent tyfus12. Senest har cellefrie tåholdbrytere blitt demonstrert for SARS-CoV-2-deteksjon i arbeidet med å gi tilgjengelig diagnostikk for COVID-19-pandemien11,12,13.
Følgende protokoll skisserer utvikling og validering av cellefri, papirbasert syntetisk tåholdbryteranalyse for Zika-virusdeteksjon, fra biosensordesign i silico , gjennom monterings- og optimaliseringstrinn, til feltvalidering med pasientprøver. Protokollen begynner med in silico-design av RNA toehold-bryterbaserte sensorer og isotermiske forsterkningsprimere som er spesifikke for Zika viral RNA. Selv om det finnes mange isotermiske amplifikasjonsmetoder, ble det her vist bruk av nukleinsyresekvensbasert amplifikasjon (NASBA) for å øke konsentrasjonen av viralt RNA-mål som er tilstede i reaksjonen, noe som muliggjør klinisk signifikant følsomhet. Praktisk sett har isotermiske forsterkningsmetoder fordelen av å operere ved konstant temperatur, og eliminerer behovet for spesialutstyr, for eksempel termiske syklister, som generelt er begrenset til sentraliserte steder.
Deretter beskrives prosessen med å montere de syntetiske tåholdbrytersensorene med reporterkodingssekvenser gjennom overlappingsforlengelses-PCR, og screening av de syntetiske tåholdbrytersensorene for optimal ytelse i cellefrie systemer ved bruk av syntetisk RNA. For dette settet med Zika-virussensorer har vi valgt lacZ-genet som koder for β-galaktosidase-enzymet, som er i stand til å spalte et kolorimetrisk substrat, klorfenol rød-β-D-galaktopyranosid (CPRG), for å produsere en gul til lilla fargeendring som kan oppdages med øye eller med en plateleser. Når topppresterende syntetiske brytere er identifisert, beskrives prosessen for screening av primere for nukleinsyresekvensbasert isotermisk forsterkning av den tilsvarende målsekvensen ved bruk av syntetisk RNA for å finne sett som gir best følsomhet.
Til slutt valideres ytelsen til diagnoseplattformen på stedet i Latin-Amerika (figur 1). For å bestemme den kliniske diagnostiske nøyaktigheten utføres den papirbaserte cellefrie analysen ved bruk av Zika-virusprøver fra pasienter; parallelt utføres en gullstandard RT-qPCR-analyse for sammenligning. For å overvåke kolorimetriske cellefrie analyser aktiverer vi kvantifisering av resultater på stedet i områder der termiske sykluser ikke er tilgjengelige. Den håndmonterte plateleseren kalt Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; heretter kalt bærbar plateleser) introduseres også her24. Opprinnelig utviklet som en følgesvenn enhet for cellefri syntetisk tåholdbryterdiagnostikk, tilbyr den bærbare plateleseren en tilgjengelig måte å inkubere og lese resultater på en høy gjennomstrømningsmåte, og gir integrert, datasynsbasert programvareanalyse for brukere.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Figur 1: Arbeidsflyt for testing av pasientprøver med papirbaserte cellefrie tåholdsbryterreaksjoner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

Tilgang til molekylær diagnostikk med lav byrde som kan distribueres i samfunnet for testing, blir stadig viktigere og har meningsfulle bredere implikasjoner for samfunnets velvære og økonomisk stabilitet. De siste årene har flere nye isotermiske diagnostiske modaliteter dukket opp for å møte behovet for rask, billig molekylær diagnostikk. Vi har bidratt til dette arbeidet gjennom utvikling og pasientvalidering av tåholdbryterbasert diagnostikk, inkludert diagnostikk for myggbårne Zika- og chikungunya-virus, som ga ytelse som kan sammenlignes med gullstandard revers transkripsjon-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) baserte analyser. Disse diagnostikkene er billige å utvikle og produsere, og de har potensial til å gi diagnostisk kapasitet til lavressursmiljøer. Her gir protokollen alle trinnene som er nødvendige for utvikling av en bryterbasert analyse for Zika-virusdeteksjon. Artikkelen tar leserne gjennom den trinnvise diagnostiske utviklingsprosessen. For det første tjener genomiske sekvenser av Zika-virus som innganger for beregningsdesign av kandidatbrytere ved hjelp av åpen kildekode-programvare. Deretter vises samlingen av sensorene for empirisk screening med syntetiske RNA-sekvenser og optimalisering av diagnostisk følsomhet. Når den er fullført, utføres validering med pasientprøver parallelt med RT-qPCR, og en spesialbygd optisk leser, PLUM. Dette arbeidet gir et teknisk veikart til forskere for utvikling av rimelige tåholdbryterbaserte sensorer for applikasjoner innen menneskers helse, landbruk og miljøovervåking.

Etter beregningsdesignrørledningen ble konstruksjonen av tre tåholdbrytere utført av PCR. PCR-produktene ble analysert ved hjelp av agarosegelelektroforese (figur 2). Tilstedeværelsen av et klart bånd rundt 3000 bp, omtrent størrelsen på lacZ-genet koblet til en tåholdbryter, indikerer vanligvis en vellykket reaksjon. Alternativt indikerer et kjørefelt uten bånd, flere bånd eller et bånd av feil størrelse en mislykket PCR. Ved mislykket PCR bør reaksjonsbetingelsene og/eller primersekvensene optimaliseres.
De monterte tåholdbryterne ble screenet for å vurdere hver sensor mot sine respektive in vitro transkriberte trigger-RNA (figur 3). Mens alle tre sensorene viste økt OD 570-absorbans, hadde bryter27B (figur 3A) den raskeste frekvensen. Brytere 33B og i mindre grad 47B viste en økt OD570-absorbans i fravær av målutløser-RNA, noe som indikerer at disse bryterne har noe bakgrunnsaktivitet eller lekkasje (figur 3B, C) -en egenskap som ikke er ønsket i en kandidatsensor, da den kan redusere spesifisiteten. For å tydeligere identifisere sensoren med det høyeste ON/OFF-signalforholdet ble foldeendringen av OD 570-absorbansen beregnet (se tilleggsinformasjon avsnitt 5) og plottet inn (figur 4). Fra denne analysen er det klart at bryter 27B er sensoren som har best ytelse med et ON / OFF-forhold på rundt 60.
Følsomheten til den topppresterende tåholdbryteren (27B) ble deretter evaluert ved å bestemme den laveste RNA-konsentrasjonen som kreves for å aktivere tåholdbryteren når den kombineres med en NASBA-reaksjon. Grafen illustrerer at de beste Zika-sensorene kan oppdage RNA i konsentrasjoner så lave som 1,24 molekyler per μL (tilsvarende ~ 2 aM; Figur 5).
Etter at bryter 27B ble identifisert og validert, ble sensormaterialet distribuert til teammedlemmene i Recife i Pernambuco-staten i Brasil. I Brasil ble den kliniske diagnostiske nøyaktigheten til Zika-virusdiagnostisk plattform vurdert ved hjelp av Zika-viruspasientprøver, parallelt med RT-qPCR for sammenligning. For å validere den papirbaserte Zika-diagnostiske plattformen ble den bærbare plateleseren brukt, som er i stand til å inkubere og lese kolorimetrisk utgang av papirbaserte sensorer. Fargeendringen fra gul til lilla brukes til å identifisere en positiv prøve, mens en negativ prøve forblir gul (figur 6). Et ekstra alternativ for å visualisere resultatene generert av den bærbare plateleseren (figur 8) er å plotte kolorimetrisk respons for hver papirbasert reaksjon over tid. Prøvene ble testet i tre eksemplarer og de som oversteg grenseverdien (rød linje satt til 1) ble vurdert som positive, mens prøver under grenseverdien ble vurdert som negative (figur 6 og figur 7).
Til slutt, for å evaluere og sammenligne den kliniske ytelsen til Zika toehold-brytersensoren med den nåværende gullstandardmetoden for diagnostisering av Zika-virusinfeksjon, ble alle pasientprøver testet parallelt med RT-qPCR. Forsterkningsplottet til to representative pasientprøver ble testet i tre eksemplarer for påvisning av zikavirus med RT-qPCR (figur 9). Prøvene anses som positive når syklusterskelverdien (Ct) er ≤38; den røde linjen indikerer en positiv prøve og den blå linjen indikerer en negativ prøve for Zika-virus.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Figur 2: Agarosegelelektroforese for å vurdere kvaliteten på PCR-produkter. PCR-produkter analyseres på en 1% agarosegel i 1X TAE, kjørt ved 80 V i 90 minutter. Et enkelt klart bånd indikerer vanligvis en vellykket reaksjon. Kjørefelt 1: 1 kb DNA-stige; Baner 2-4: 27B bryter DNA, 33B utløser DNA og 47B utløser DNA, henholdsvis. Tallene på venstre side representerer båndstørrelse i bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Figur 3: Prototyping av tre tåholdbrytere for papirbaserte zikasensorer. Ytelsen til tre papirbaserte RNA toehold-brytersensorer ble målt ved 37 °C i over 130 minutter. Hver graf inneholder to spor, den ene representerer bryteren bare kontroll, mens den andre representerer bryteren og utløseren. De tre grafene representerer data samlet inn ved hjelp av tåholdbrytersensorer 27B (A), 33B (B) og 47B (C). Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) fra tre replikasjoner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Figur 4: Sensorer med best ytelse identifiseres ved å beregne foldeendringen i absorbans ved 570 nm. Foldeendring (eller maksimalt ON / OFF-forhold) beregnes ved å måle forholdet mellom absorbans (OD570) ved 130 minutter mellom bryterkontrollen, og bryteren pluss utløser CFPS-analysen. Feilfelt representerer SEM fra tre replikasjoner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Figur 5: Sensitivitetsvurdering av bryteren som gir best resultater. In vitro transkribert Zika RNA titreres til NASBA-reaksjoner. Etter en inkubasjon på 1 time ble reaksjonene tilsatt cellefrie PURExpress-reaksjoner på papirplater i forholdet 1:7. Foldeendringen etter 130 min ved 37 °C er plottet. Dette tallet er gjengitt fra24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Figur 6: Bærbar plateleseropptaksside lastet med fangede bildedata. Denne illustrasjonen viser et eksempelbilde av det endelige bildet som ble tatt av den bærbare plateleseren under en datainnsamling. Det opprinnelige dato-/tidsstempelet er synlig øverst på bildet. Gul farge indikerer kontroll eller negative reaksjoner, og den lilla fargen indikerer en positiv reaksjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Figur 7: Dataanalysemodus. Til venstre velger brukerne datasettene de vil tegne inn; Grafene vises deretter til høyre med unike farger for hver prøve eller kontrollsett. Den stiplede røde linjen fungerer som en terskel for å bestemme positive og negative prøver. Prøver testet i tre eksemplarer som overskrider terskelen anses som positive, mens prøver under terskelen anses som negative. Feilfelt representerer standardavvik (SD) fra tre replikasjoner. Ctrl 1 til Ctrl 5 indikerer kontroller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Figur 8. PLUM, en bærbar plateleser. Denne bærbare plateleseren fungerer som en lab-in-a-box og fungerer som en temperaturkontrollert plateleser for å inkubere og overvåke kolorimetriske reaksjoner. Denne bærbare enheten kan gi kvantitative målinger og målinger med høy gjennomstrømning av papirbaserte Zika-sensorer på stedet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Figur 9: RT-qPCR-plott av forsterkningen av to pasientprøver testet i tre eksemplarer for påvisning av Zika-viruset. Prøver anses som positive når syklusterskelverdien (Ct) er ≤38. Den stiplede røde linjen fungerer som en terskel for å bestemme positive og negative prøver. Det røde sporet indikerer en positiv prøve, og det blå sporet indikerer en negativ prøve. ΔRn (delta Rn) -verdien representerer den normaliserte størrelsen på fluorescenssignalet oppdaget av RT-qPCR-instrumentet for alle prøvene som ble testet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Supplerende protokollfil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende tall. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned disse tallene.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

Tilgang til desentralisert, rimelig og høykapasitetsdiagnostikk som kan distribueres i samfunnet for desentralisert testing er avgjørende for å bekjempe globale helsekriser. Dette manuskriptet beskriver hvordan man bygger papirbasert diagnostikk for virale RNA-sekvenser som kan oppdages med en bærbar optisk leser.

Design til implementeringsstudie for utvikling og pasientvalidering av papirbasert tåholdbryterdiagnostikk

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Vår protokoll beskriver design, montering og validering av genkretsbasert diagnostikk. Disse papirbaserte molekylære diagnostikkene er lave kostnader og følsomme, og kan oppdage klinisk relevante konsentrasjoner av nukleinsyrer og kan utformes for å oppdage nesten hvilken som helst sekvens. Dette er en plattformteknologi som kan utformes av brukere for deres behov og har potensial til å bringe klinisk diagnostikk inn i mer desentraliserte tannressursinnstillinger.Cellefri tåholdsbrytersensor kan utformes for praktisk talt alle nukleinsyrebaserte mål. Nylig arbeid har vist cellefri diagnostikk for Ebola, norovirus, SARS-CoV-2, C.difficile og tyfusfremkallende bakterier. Demonstrere prosedyren vil være Severino Jefferson Rivero da Silva, en postdoktor, og Pouriya Bayat, en doktorgradsstudent fra laboratoriet mitt.For å designe tåholdbryteren, identifiser målsekvensene fra Zika-virusgenomet og velg Zika-virusmålsekvensene fra amplikonene som beskrevet i tekstprotokollen. Last ned programvarepakken for design av toehold-bryteren. Åpne MATLAB og naviger til mappen for designprogramvare.Skriv inn målsekvensene i csv-filen for designinndatafilen som ligger i inndataundermappen. Velg parametrene som skal brukes for designfunksjonen. Kjør designfunksjonen for å generere toehold-bryterdesignene for målene av interesse.Når du er ferdig, naviger til final_designs-mappen og finn designsekvensene øverst til tåholdbryteren og de tilsvarende målsekvensene i regneark i CSV-format. Forsikre deg om at DNA-sekvensene for tåholdbryteren generert av algoritmen inneholder T7-promotorsekvensene i den fem primære enden og en konservert 21 nukleotidlinkersekvens i den tre primære enden. Bruk NCBI BLAST til å skjerme designsekvensene for topptåholdbryteren mot andre vanlige virus ved å se etter sekvenshomologi.Godta sekvenser med mindre enn 40% hemologi. Klargjør løsninger av toeholdbryteren hårnåls-DNA-oligoer og reversforsterkningsprimere i en konsentrasjon på 10 mikromolar i nukleasefritt vann. Monter reaksjoner i PCR-rør på is i henhold til denne tabellen.Plasser reaksjonsrørene i en termosykler, etter sykkelforholdene som er oppført i denne tabellen. Analyser PCR-produktene på en agarosegel. Rens PCR-produktene og eluer DNA i et minimalt volum nukleasfritt vann for å sikre en tilstrekkelig høy konsentrasjon.Kvantifiser DNA ved hjelp av et spektrofotometer. Forbered en CPRG-lagerløsning ved å oppløse 25 milligram pulveret i en milliliter nukleasefritt vann. Forbered en masterblanding på is i henhold til standardprotokollen som vises her.Dispenser den cellefrie masterblandingen i PCR-rør. For cellefrie kontroller og bryterkontroller alene, tilsett nukleasefritt vann til et volum på 5,94 mikroliter. Og for reaksjonen, legg til PCR-renset tåholdbryter-DNA for å få en endelig konsentrasjon på 33 nanomolar.For å teste toehold-bryteren og mål-RNA-kombinasjonen, legg in vitro transkribert mål-RNA til en endelig konsentrasjon av en mikromolar. Bland alle reaksjoner grundig ved pipettering og sentrifuge kort. På en svart klarbunnet 384-brønnplate tilsettes 30 mikroliter nukleasefritt vann til brønnene rundt reaksjonsbrønnene.Deretter bruker du en to millimeter biopsistans og pinsett, kutter BSA-blokkerte filterpapirskiver og plasserer dem i reaksjonsbrønnene. Dispenser 1,8 mikroliter fra hvert reaksjonsrør på filterpapirskivene i 384-brønnsplaten i tre eksemplarer. Dekk platen med klar PCR-film og legg den i en plateleser.Mål absorbansen ved 570 nanometer ved 37 grader Celsius hvert minutt i 130 minutter. Forbered en 25 mikromolar stamløsning av alle fremre og omvendte primersett i nukleasefritt vann. Sett opp en fem mikroliter reaksjon ved hjelp av masterblandingen vist her.Bland ved pipettering til det hvite bunnfallet løses og dispenser deretter i PCR-rør. Legg fremover og bakover primere til de aktuelle rørene, etterfulgt av å legge til en mikroliter av enten nukleasefritt vann eller to picomolar av målutløser RNA. Bland ved forsiktig pipettering og spinn kort ned rørene.Sett opp inkubasjonsprotokollen på en termocykler som vist her. Etter 12 minutter, fjern rørene og tilsett 1,25 mikroliter av enzymblandingen til hvert rør, etterfulgt av blanding og sentrifugering. Returner rørene til termosykleren etter å ha hoppet over 41 grader Celsius hold trinn for å starte en times reaksjonsinkubasjon.For deretter å vurdere primerytelsen, monter de papirbaserte cellefrie tåholdbryterreaksjonene og analyser dataene. For følsomhetsanalyse, identifiser kandidatprimerpar og fremstill serielle fortynninger av mål-RNA i nukleasefritt vann. Gjenta NASBA og cellefrie reaksjoner med de valgte primersettene i biologiske triplikater.Ved å bruke en mikroliter ekstrahert pasient-RNA, utfør NASBA-forsterkningen og papirbaserte cellefrie reaksjoner som vist i avsnitt fem. Etter reaksjonene, klargjør du 384-brønns reaksjonsplaten og kjører analysen i en bærbar plateleser ved 37 grader Celsius. Monter deretter RT-qPCR-komponentene og tilsett reagensene til et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør i henhold til denne tabellen.Bland reaksjonen ved pipettering. Dispenser 6,5 mikroliter i hver brønn i en 96-brønns eller 384-brønns PCR-plate, etterfulgt av 3,5 mikroliter av hver RNA-mal i tre eksemplarer. Plasser en PCR-film over toppen av platen.Sentrifuge 384-brønnplaten ved 600 ganger G i to minutter. Plasser platen i en RT-qPCR-maskin og kjør sykkelforholdene som vist her. Etter beregningsdesignet ble tre toehold-brytere konstruert og analysert ved hjelp av agarosegelelektroforese.Et bånd rundt 3.000 basepar indikerte en vellykket reaksjon. Toehold-bryterne ble vurdert opp mot deres respektive in vitro transkriberte trigger-RNA. Mens alle tre sensorene viste en økning i absorbans, hadde sensor 27B den raskeste på-hastigheten, mens bryterne 33B og 47B hadde et lavere på / av-forhold som indikerer bakgrunnsaktivitet og redusert spesifisitet.Foldeendringen av absorbans ved 570 nanometer viste at bryter 27B har den beste ytelsen med et av / på-signalforhold. Videre, når det kombineres med NASBA, kan det oppdage RNA i konsentrasjoner så lave som 124 molekyler per mikroliter som indikerer høy følsomhet. Zika-viruspasientprøver fra Brasil ble testet for å vurdere den kliniske diagnostiske nøyaktigheten til sensorene ved hjelp av en bærbar plateleser.En fargeendring fra gul til lilla identifiserte en positiv prøve. Den kolorimetriske responsen for hver papirbasert reaksjon ble plottet over tid av den integrerte programvaren på PLUM bærbar plateleser. Prøvene som oversteg terskelen ble vurdert som positive.Den kliniske ytelsen til sensoren ble etablert ved sammenligning med RT-qPCR. Prøvene ble vurdert som positive når syklusterskelverdien var lik eller mindre enn 38. Det er viktig å sikre at resultatene fra toehold-bryterskjermer og NASBA primerfølsomhet er reproduserbare og optimaliserte før du går videre med pasientforsøk.Gitt sin enkelhet og tilpasningsevne, har den diagnostiske plattformen beskrevet her banet vei for utvikling av nye pasientnære verktøy som kan gi fordeler for helsevesenet, spesielt for lavinntektsland.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering av Complex Systems Bruke Design of Experiments Approach: Forbigående Protein Expression i tobakk som et Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Papirbaserte Enheter for isolering og karakterisering av Ekstracellulær Blemmer

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering av en automatisert Illuminating, dyrking, og Sampling System for Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetisk Levitation Sammen med Portable Imaging and Analysis for sykdomsdiagnostikk

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Fabrikasjon av Tredimensjonal Papirbaserte mikrofluid Enheter for immunologiske

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabrikasjon og validering av en Organ-on-chip System med integrerte elektrodene direkte kvantifisere Transendothelial elektrisk motstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

Anatomisk realistisk Neonatal hjertet modell for bruk i Neonatal pasienten simulatorer

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors til å oppdage Protease aktivitet i Vivo Noninvasive diagnostikk

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...