Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Os autores agradecem a todos os membros dos laboratórios Green, Pardee e Pena, bem como a todos os coautores de manuscritos anteriores relativos ao trabalho divulgado neste manuscrito. A S.J.R.D.S. foi apoiada por uma bolsa de doutorado patrocinada pela Fundação para a Ciência e Tecnologia de Pernambuco (FACEPE), Brasil, número de referência IBPG-1321-2.12/18, e atualmente é apoiada por uma Bolsa de Pós-Doutorado patrocinada pela Universidade de Toronto, Canadá. P.B. é apoiado pelo Prêmio William Knapp Buckley da Faculdade de Farmácia da Universidade de Toronto. M.K. foi apoiado pela Precision Medicine Initiative (PRiME) na bolsa interna da Universidade de Toronto número PRMF2019-002. Este trabalho foi apoiado por fundos para K.P do Programa de Cátedras de Pesquisa do Canadá (Arquivos 950-231075 e 950-233107), do Major Research Project Management Fund da Universidade de Toronto, do Programa de Subsídios da Fundação CIHR (201610FDN-375469) e da L.P, A.A.G. e K.P através do CIHR / IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), bem como por fundos para K.P. do Centro Internacional de Pesquisa de Desenvolvimento do Canadá (subsídio 109434-001) através da Oportunidade de Financiamento de Pesquisa Rápida do Novo Coronavírus Canadense 2019 (COVID-19). Este trabalho também foi apoiado por fundos para A.A.G. de um Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), da Gates Foundation (OPP1160667), de um NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), de um prêmio NIH R21 (1R21AI136571-01A1) para K.P./A.A.G, e de uma Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). A Figura 1 foi criada com Biorender.com sob licença acadêmica para K.P.

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K.P. e A.A.G. são co-inventores de tecnologias relacionadas a sensores de retenção de dedo do pé baseadas em papel. Y.G., S.C. e K.P. são co-fundadores da LSK Technologies, Inc. e são co-inventores das tecnologias relacionadas com o PLUM. M.K., K.P. e A.A.G. são co-fundadores da En Carta Diagnostics Ltd. Outros autores não têm conflitos de interesse. Patentes: Dispositivo PLUM: O pedido de patente Y.G., S.C. e K.P. foi depositado pela Universidade de Toronto e atribuído à LSK Technologies Inc. U. S. Provisional Patent Application No. 62/982,323 arquivado em 27 de fevereiro de 2020; Patente do interruptor Toehold: A.A.G., P.Y. e J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Patente. WO2014074648A3 arquivado em 6 de novembro de 2012; Patente de diagnóstico baseada em papel: K.P. e J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" Patente dos EUA pendente No. US15/963.831 arquivado em 6 de dezembro de 2013; Patente Zika 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. e J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", Pedido de Patente Provisória dos EUA nº 62/403.778 arquivado em 4 de outubro de 2016; Patente Zika 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. e J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", Pedido de Patente Provisória dos EUA nº 62/341.221 arquivado em 25 de maio de 2016.

O sistema combinado baseado em papel descrito aqui pode levar diagnósticos moleculares clinicamente relevantes, com desempenho funcionalmente comparável ao RT-qPCR, ao ponto de necessidade6. É importante ressaltar que, para configurações remotas, a disponibilidade de diagnósticos no local pode diminuir o tempo de resultados de dias para horas. Destacando a programabilidade dessa abordagem, o pipeline que foi descrito pode ser usado para detectar praticamente qualquer alvo patogênico. Emparelhamos as ferramentas moleculares com um leitor de placas portátil construído especificamente para o efeito, que é compacto e compatível com o funcionamento da bateria (8-9 h) e fornece análise de dados a bordo para permitir aplicações distribuídas. Em outros trabalhos, validamos o hardware combinado e a plataforma de diagnóstico do vírus Zika com 268 amostras de pacientes, em paralelo com a RT-qPCR, e encontramos uma acurácia diagnóstica de 98,5%24. Em conjunto, nosso objetivo é permitir a transferência de tecnologia dessa plataforma para os pesquisadores, para que ela possa ser reaproveitada e melhorada pela comunidade para atender às necessidades diagnósticas não atendidas.
O processo de projeto do interruptor in silico toehold foi integrado e automatizado em uma tubulação que pode ser dividida em três etapas. O primeiro estágio gera um conjunto de projetos de interruptores de dedo do pé que hibridizam para a sequência de destino em incrementos de nucleotídeos. O segundo estágio examina a estrutura secundária e a disponibilidade do interruptor de apoio e elimina sensores com códons de parada prematura no quadro. Uma função de pontuação que considera vários fatores (por exemplo, nível de defeito do interruptor de retenção do dedo do pé, disponibilidade do interruptor do dedo do pé e acessibilidade do local de destino) é então implementada para selecionar os designs do interruptor de retenção superior com base nas pontuações gerais. No estágio final, uma lista de sequências é gerada para os designs de interruptores de dedo superior e seus gatilhos de destino correspondentes. As sequências superiores do sensor devem ser rastreadas quanto à especificidade contra o transcriptoma humano e genomas virais intimamente relacionados usando NCBI/Primer-BLAST25. Também é uma boa prática rastrear os locais-alvo do sensor para a conservação da sequência no genoma viral do Zika para garantir que os sensores forneçam uma detecção ampla e robusta. Várias versões do software de design de interruptores de dedo do pé foram desenvolvidas e o algoritmo de design permite que os usuários gerem duas versões, os interruptores de dedo do péda série A 6 ou da série B6. Neste artigo, o foco tem sido o design do interruptor de apoio do dedo do pé da série B.
Após a síntese comercial de DNA, os interruptores de dedo do pé podem ser rapidamente montados e, em seguida, testados realizando uma triagem inicial contra uma sequência de gatilho de alvo sintético que corresponde a regiões curtas (200-300 nt) do genoma alvo. Para a triagem do desempenho de sensores baseados em interruptores de dedo do pé, é ideal adicionar a sequência alvo na forma de RNA. Neste artigo, as etapas necessárias para adicionar RNA desencadeante transcrito in vitro foram descritas. No entanto, se disponíveis, podem ser utilizados modelos de genoma completos, tais como extratos quantificados de ARN viral ou genomas ou normas comerciais de ARN sintético. O uso de genomas de RNA completos para a triagem inicial do interruptor de dedo do pé é benéfico, pois pode informar se fatores adicionais, como a estrutura secundária de RNA, afetarão o desempenho do sensor. Para otimizar a relação ON/OFF dos interruptores candidatos, o DNA do interruptor do dedo do pé pode ser titulado na reação livre de células. Esta etapa também pode servir para identificar interruptores de dedo do pé de alto desempenho (amplificação de dobra ou alta relação ON/OFF) e omitir interruptores de dedo do pé com vazamento (sinal alto na ausência do RNA alvo) das etapas de caracterização a jusante.
Para melhorar o limite de detecção dos candidatos a interruptor de dedo do pé de melhor desempenho, o NASBA é usado para aumentar as concentrações clinicamente relevantes de RNA viral alvo do Zika para um nível que possa ser detectado pelos interruptores de dedodo pé 6. Diferentes combinações de conjuntos de primer para frente e para trás são rastreadas para determinar as melhores combinações de primer NASBA e interruptor de retenção para permitir a detecção em concentrações clinicamente relevantes. Uma vez que um conjunto ideal de primer e uma combinação de interruptor de apoio do dedo do pé tenham sido identificados, o ensaio é levado adiante para validação clínica. É importante notar que o interruptor de retenção e os estágios de triagem NASBA podem ser trabalhosos e intensivos em recursos e, portanto, o desenvolvimento de testes é mais adequado para locais de pesquisa com bons recursos. Embora não tenhamos aplicado a automação de processos, é provável que isso possa acelerar o ciclo iterativo de projeto, construção e teste32. Felizmente, o tempo de resposta desde o projeto e teste do sensor até a implantação pode ser notavelmente curto (menos de uma semana), tornando essa estratégia ideal para situações críticas em termos de tempo, como surtos epidêmicos6.
Mesmo depois de um biossensor com sensibilidade clinicamente relevante ter sido desenvolvido, existem desafios técnicos que precisam ser abordados. Como esse protocolo envolve operação manual e é um procedimento de várias etapas, existe o risco de contaminação cruzada entre as amostras. Fazemos o nosso melhor para reduzir esse risco através de uma prática laboratorial cuidadosa. Em um ensaio clínico recente de 268 amostras de pacientes, não encontramos nenhum problema de contaminação; no entanto, trata-se de uma consideração importante24. Com isso em mente, o protocolo continua sendo um ensaio de laboratório e requer um usuário qualificado com domínio de técnicas adequadas de biologia molecular. Uma consideração adicional para a implantação é o isolamento de RNA de amostras de pacientes. Aqui descrevemos o isolamento de RNA usando kits de extração de ácido nucleico baseados em colunas. No entanto, em outros trabalhos, demonstramos um método de lise fervente eficaz e simples (95 °C por 2 min) para o processamento de amostras de pacientes de baixa carga6. Essa estratégia quase elimina o custo associado à extração de RNA e evita o uso de kits de extração de ácido nucleico baseados em colunas, o que pode representar um desafio logístico em ambientes com poucos recursos ou problemas na cadeia de suprimentos durante crises, como a pandemia de COVID-1933.
Como vimos durante a pandemia de COVID-19, os instrumentos utilizados para realizar a RT-qPCR podem, por si só, servir como um gargalo e limitar o acesso do paciente ao teste. Esse fator, que também é em grande parte financeiro, leva a um modo de teste centralizado que pode limitar o acesso ao diagnóstico. Por exemplo, durante o surto de Zika de 2015/2016, apenas cinco laboratórios nacionais de referência estavam disponíveis no Brasil, o que causou atrasos nos testes dos pacientes. Sem considerar o benefício potencial das economias de escala, o custo atual dos bens para o leitor de placas portátil é de ~ US $ 500, que mesmo aumentado cinco vezes para explicar a mão de obra e a margem comercial, ainda fornece um instrumento acessível. Isso se compara bem aos instrumentos RT-qPCR que variam em custo de US $ 15.000 a US $ 90.000 US $34. Além disso, o custo estimado por teste para o ensaio sem células na América Latina é de cerca de US $ 5,48, enquanto o custo por teste de RT-qPCR no Brasil foi de ~ US $ 10-11 USD no momento do surto de Zika36. Além do custo do equipamento, o leitor de placas portátil tem uma pegada pequena (20 cm3), análise automática, upload de dados para a nuvem via internet e pode ser executado com energia da bateria. Esses recursos expandem drasticamente as configurações potenciais onde o teste pode ser implantado e, concomitantemente, expandem a população de pacientes que podem ser atendidos.
Até o momento, as plataformas comerciais mais comuns de CFPS de E. coli são os sistemas S30 e PURE37; no entanto, uma consideração fundamental para melhorar o acesso ao diagnóstico em países de baixa e média renda é a disponibilidade doméstica limitada desses reagentes. Um passo importante para resolver este desafio é o desenvolvimento da produção local de CFPS. O laboratório Federici recentemente fez progressos significativos no desenvolvimento de uma plataforma não comercial para implementar sensores baseados em interruptores de dedo do pé em sistemas livres de células baseados em lisado, atingindo um LOD de 2,7 fM com RNA14 do vírus Zika. Essa conquista não apenas permite que os reagentes sejam feitos no país de uso, evitando tarifas de importação e atrasos, mas os custos de mão de obra também se expandem para as taxas locais e, portanto, o custo total pode ser significativamente reduzido. No trabalho delineado pelo grupo Federici, o custo de produção da reação de expressão CFPS (5 μL) no Chile foi de 6,9 centavos (USD)35,38, proporcionando um duplo incentivo (melhoria da logística e do custo) para a implementação de sistemas à base de lisado 35,38.
A colocação de testes comparáveis de RT-qPCR em redes de diagnóstico distribuídas poderia trazer vantagens significativas sobre as práticas atuais que dependem do transporte de amostras para instalações centralizadas de RT-qPCR. Em ambientes periurbanos, onde os casos de zika estavam concentrados, a distância física entre um paciente e a instalação de diagnóstico retarda o diagnóstico e aumenta o risco de que os resultados não cheguem ao paciente em um momento clinicamente relevante. Esperamos que o trabalho aqui apresentado possa contribuir para permitir que a comunidade de investigação, através da transferência de conhecimentos, crie biotecnologias descentralizadas e hardware portátil para a saúde humana, a agricultura e a monitorização ambiental.

A RT-QPCR manteve-se como a tecnologia padrão-ouro para diagnósticos clínicos devido à sua excelente sensibilidade e especificidade. Embora altamente robusto, o método depende de equipamentos e reagentes caros e especializados que exigem distribuição e armazenamento com temperatura controlada. Isso apresenta barreiras significativas para a acessibilidade de diagnósticos de qualidade globalmente, particularmente em tempos de surtos de doenças e em regiões onde o acesso a laboratórios bem equipados é limitado 1,2. Isso foi observado durante o surto do vírus Zika 2015/2016 no Brasil. Com apenas cinco laboratórios centralizados disponíveis para fornecer testes RT-qPCR, gargalos significativos resultaram, limitando o acesso ao diagnóstico. Isso foi especialmente desafiador para indivíduos em ambientes periurbanos, que foram mais severamente impactados pelo surto 3,4. Em um esforço para melhorar o acesso aos diagnósticos, o protocolo mostra uma plataforma que foi desenvolvida com o potencial de fornecer diagnósticos descentralizados, de baixo custo e alta capacidade em ambientes com poucos recursos. Como parte disso, um pipeline de descoberta diagnóstica foi estabelecido, acoplando amplificação isotérmica e sensores sintéticos baseados em interruptores de RNA com sistemas de expressão livre de células baseados em papel 5,6.
Os sistemas de síntese proteica sem células (CFPS), em particular os sistemas livres de células à base de E. coli, são uma plataforma atraente para uma ampla gama de aplicações de biossensoriamento, desde o monitoramento ambiental 7,8 até o diagnóstico de patógenos 5,6,9,10,11,12 . Compreendendo os componentes necessários para a transcrição e tradução, os sistemas CFPS têm vantagens significativas sobre os biossensores de células inteiras. Especificamente, a detecção não é limitada por uma parede celular e, em geral, eles são modulares em design, biosseguros, baratos e podem ser liofilizados para uso portátil. A capacidade de congelar reações baseadas em circuitos gênicos em substratos, como papel ou têxteis, permite o transporte, o armazenamento a longo prazo à temperatura ambiente5 e até mesmo a incorporação em tecnologia vestível13.
Trabalhos anteriores demonstraram que sistemas livres de células de E. coli podem ser usados para detectar inúmeros analitos, por exemplo, metais tóxicos como mercúrio, antibióticos como tetraciclina 7,14, produtos químicos desreguladores endócrinos15,16, biomarcadores como ácido hipúrico 17, moléculas de detecção de quórum associadas a patógenos 9,18 e substâncias ilícitas como cocaína17 e gama-hidroxibutirato (GHB)19 . Para a detecção de ácidos nucleicos específicos por sequência, as estratégias dependeram, em sua maior parte, do uso de biossensores baseados em interruptores acoplados a técnicas de amplificação isotérmica. Os interruptores Toehold são riboreguladores sintéticos (também referidos simplesmente como "interruptores" no resto do texto) que contêm uma estrutura hairpin que bloqueia a translação a jusante, sequestrando o local de ligação ribossomal (RBS) e o códon inicial. Após a interação com o RNA de gatilho alvo, a estrutura do hairpin é aliviada e a tradução subsequente de um quadro de leitura aberto do repórter é habilitada20.
A amplificação isotérmica também pode ser utilizada como diagnóstico molecular21; no entanto, esses métodos são propensos à amplificação inespecífica, o que pode reduzir a especificidade e, portanto, a acurácia do teste para abaixo da RT-qPCR 22. No trabalho aqui relatado, a amplificação isotérmica a montante dos sensores baseados em interruptor foi usada para fornecer amplificação de sinal combinada que permite a detecção clinicamente relevante de ácidos nucleicos (femtomolar a attomolar). Esse emparelhamento dos dois métodos também fornece dois pontos de verificação específicos da sequência que, em combinação, fornecem um alto nível de especificidade. Usando essa abordagem, trabalhos anteriores demonstraram a detecção de vírus como Zika6, Ebola5, Norovírus10, bem como bactérias patogênicas como C. difficile23 e Typhoid resistente a antibióticos12. Mais recentemente, os interruptores de retenção sem células foram demonstrados para a detecção de SARS-CoV-2 em esforços para fornecer diagnósticos acessíveis para a pandemia de COVID-1911,12,13.
O protocolo a seguir descreve o desenvolvimento e a validação de um ensaio de interruptor de dedo sintético baseado em papel e livre de células para detecção do vírus Zika, desde o projeto de biossensores in silico , passando pelas etapas de montagem e otimização, até a validação de campo com amostras de pacientes. O protocolo começa com o projeto in silico de sensores baseados em interruptor de RNA e primers de amplificação isotérmica específicos para o RNA viral do Zika. Embora existam inúmeros métodos de amplificação isotérmica, aqui foi demonstrado o uso de amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA) para aumentar a concentração de RNA viral alvo presente na reação, permitindo sensibilidade clinicamente significativa. Na prática, os métodos de amplificação isotérmica têm a vantagem de operar a uma temperatura constante, eliminando a necessidade de equipamentos especializados, como termocicladores, que geralmente são limitados a locais centralizados.
Em seguida, descreve-se o processo de montagem dos sensores sintéticos do interruptor do dedo do pé com sequências de codificação do repórter por meio da PCR de extensão de sobreposição e triagem dos sensores sintéticos do interruptor do dedo do pé para um desempenho ideal em sistemas livres de células usando RNA sintético. Para este conjunto de sensores do vírus Zika, selecionamos o gene lacZ que codifica a enzima β-galactosidase, que é capaz de clivar um substrato colorimétrico, clorofenol vermelho-β-D-galactopiranóssido (CPRG), para produzir uma mudança de cor amarela a roxa que pode ser detectada pelo olho ou com um leitor de placas. Uma vez que os interruptores sintéticos de alto desempenho são identificados, o processo de triagem de primers para amplificação isotérmica baseada em sequência de ácido nucleico da sequência alvo correspondente usando RNA sintético para encontrar conjuntos que fornecem a melhor sensibilidade é descrito.
Por fim, o desempenho da plataforma diagnóstica é validado in loco na América Latina (Figura 1). Para determinar a precisão do diagnóstico clínico, o ensaio sem células baseado em papel é realizado usando amostras do vírus Zika de pacientes; em paralelo, um ensaio de RT-qPCR padrão-ouro é realizado para comparação. Para monitorar ensaios colorimétricos livres de células, permitimos a quantificação no local dos resultados em regiões onde os termocicladores não estão disponíveis. O leitor de placas montado à mão chamado Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; doravante referido como leitor de placas portátil) também é introduzido aqui24. Inicialmente desenvolvido como um dispositivo complementar para diagnósticos de interruptores sintéticos sem células, o leitor de placas portátil oferece uma maneira acessível de incubar e ler resultados de maneira de alto rendimento, fornecendo análise de software integrada e baseada em visão computacional para os usuários.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho para testar amostras de pacientes usando reações de interruptor de dedo do pé sem células baseadas em papel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

O acesso a diagnósticos moleculares de baixa carga que podem ser implantados na comunidade para testes é cada vez mais importante e tem implicações mais amplas significativas para o bem-estar das sociedades e a estabilidade econômica. Nos últimos anos, várias novas modalidades de diagnóstico isotérmico surgiram para atender à necessidade de diagnósticos moleculares rápidos e de baixo custo. Contribuímos para esse esforço por meio do desenvolvimento e validação do paciente de diagnósticos baseados em interruptores de dedo do pé, incluindo diagnósticos para os vírus Zika e chikungunya transmitidos por mosquitos, que forneceram desempenho comparável aos ensaios baseados em reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa padrão ouro (RT-qPCR). Esses diagnósticos são baratos de desenvolver e fabricar e têm o potencial de fornecer capacidade de diagnóstico para ambientes com poucos recursos. Aqui, o protocolo fornece todas as etapas necessárias para o desenvolvimento de um ensaio baseado em switch para detecção do vírus Zika. O artigo leva os leitores através do processo de desenvolvimento de diagnóstico passo a passo. Primeiro, as sequências genômicas do vírus Zika servem como entradas para o projeto computacional de switches candidatos usando software de código aberto. Em seguida, mostra-se a montagem dos sensores para triagem empírica com sequências sintéticas de RNA e otimização da sensibilidade diagnóstica. Uma vez concluída, a validação é realizada com amostras de pacientes em paralelo com RT-qPCR e um leitor óptico construído especificamente para o efeito, o PLUM. Este trabalho fornece um roteiro técnico para pesquisadores para o desenvolvimento de sensores baseados em interruptores de dedo de baixo custo para aplicações em saúde humana, agricultura e monitoramento ambiental.

Seguindo o pipeline de projeto computacional, a construção de três interruptores de dedo do pé foi realizada por PCR. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose (Figura 2). A presença de uma banda clara em torno de 3.000 pb, aproximadamente do tamanho do gene lacZ acoplado a um interruptor de dedo do pé, normalmente indica uma reação bem-sucedida. Como alternativa, uma faixa sem uma banda, várias bandas ou uma faixa do tamanho incorreto indica uma PCR com falha. No caso de uma PCR com falha, as condições de reação e/ou sequências de iniciadores devem ser otimizadas.
Os interruptores de dedo montados foram triados para avaliar cada sensor em relação ao seu respectivo RNA desencadeante transcrito in vitro (Figura 3). Enquanto todos os três sensores exibiam uma maior absorvância OD570, o interruptor 27B (Figura 3A) tinha a taxa de ativação mais rápida. Os interruptores 33B e, em menor grau, 47B mostraram um aumento da absorbância OD570 na ausência de RNA de gatilho alvo, indicando que esses interruptores possuem alguma atividade de fundo ou vazamento (Figura 3B,C) - uma característica não desejada em um sensor candidato, pois pode reduzir a especificidade. Para identificar mais claramente o sensor com a maior relação de sinal ON/OFF, a mudança de dobra da absorbância OD570 foi calculada (ver informações suplementares seção 5) e plotada (Figura 4). A partir desta análise, fica claro que o switch 27B é o sensor que tem o melhor desempenho com uma relação ON/OFF de cerca de 60.
A sensibilidade do interruptor de dedo do pé de melhor desempenho (27B) foi então avaliada determinando a menor concentração de RNA necessária para ativar o interruptor de retenção do dedo do pé quando acoplado a uma reação NASBA. O gráfico ilustra que os sensores de Zika de melhor desempenho podem detectar RNA em concentrações tão baixas quanto 1,24 moléculas por μL (equivalente a ~2 aM; Figura 5).
Após a identificação e validação do switch 27B, os materiais do sensor foram distribuídos aos membros da equipe em Recife, no estado de Pernambuco. No Brasil, a acurácia diagnóstica clínica da plataforma diagnóstica do vírus Zika foi avaliada por meio de amostras de pacientes com o vírus Zika, em paralelo com a RT-qPCR para comparação. Para validar a plataforma de diagnóstico de Zika baseada em papel, foi utilizado o leitor de placas portátil, que é capaz de incubar e ler a saída colorimétrica de sensores à base de papel. A mudança de cor de amarelo para roxo é usada para identificar uma amostra positiva, enquanto uma amostra negativa permanece amarela (Figura 6). Uma opção adicional para visualizar os resultados gerados pelo leitor de placas portátil (Figura 8) é plotar a resposta colorimétrica para cada reação baseada em papel ao longo do tempo. As amostras foram testadas em triplicado e aquelas que excederam o limiar (linha vermelha definida como 1) foram consideradas positivas, enquanto as amostras abaixo do limiar foram consideradas negativas (Figura 6 e Figura 7).
Finalmente, para avaliar e comparar o desempenho clínico do sensor de interruptor de dedo do pé Zika com o atual método padrão-ouro para diagnosticar a infecção pelo vírus Zika, todas as amostras de pacientes foram testadas em paralelo com RT-qPCR. O gráfico de amplificação de duas amostras representativas de pacientes foi testado em triplicado para a detecção do vírus Zika por RT-qPCR (Figura 9). As amostras são consideradas positivas quando o valor do limiar de ciclo (Ct) é ≤38; a linha vermelha indica uma amostra positiva e a linha azul indica uma amostra negativa para o vírus Zika.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Figura 2: Eletroforese em gel de agarose para avaliar a qualidade dos produtos de PCR. Os produtos de PCR são analisados em um gel de agarose a 1% em TAE 1X, executado a 80 V por 90 min. Uma única faixa clara normalmente indica uma reação bem-sucedida. Faixa 1: escada de DNA de 1 kb; Faixas 2-4: 27B mudam de DNA, 33B desencadeiam DNA e 47B desencadeiam DNA, respectivamente. Os números no lado esquerdo representam o tamanho da banda em bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Figura 3: Prototipagem de três interruptores de dedo do pé para sensores Zika baseados em papel. O desempenho de três sensores de interruptor de retenção de RNA baseados em papel foi medido a 37 °C por mais de 130 min. Cada gráfico contém dois rastreamentos, um representa apenas o controle switch, enquanto o outro representa o switch e o gatilho. Os três gráficos representam dados adquiridos usando os sensores de interruptor de dedo do pé 27B (A), 33B (B) e 47B (C). As barras de erro representam o erro padrão da média (MEV) de três replicações. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Figura 4: Os sensores de melhor desempenho são identificados calculando a mudança de dobra na absorbância a 570 nm. A mudança de dobra (ou relação ON/OFF máxima) é calculada medindo a razão de absorvância (OD570) a 130 minutos entre o controle somente do interruptor e o teste CFPS do interruptor mais gatilho. As barras de erro representam o SEM de três replicações. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Figura 5: Avaliação da sensibilidade do interruptor de alto desempenho. O RNA de Zika transcrito in vitro é titulado em reações NASBA. Após uma incubação de 1 h, as reações foram adicionadas às reações PURExpress livres de células em discos de papel na proporção de 1:7. A mudança de dobra após 130 min a 37 °C é plotada. Este número foi reproduzido a partir de24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Figura 6: Página de captura do leitor de placas portátil carregada com dados de imagem capturados. Esta figura mostra uma imagem de amostra da imagem final capturada pelo leitor de placas portátil durante uma execução de coleta de dados. O carimbo de data/hora original é visível na parte superior da imagem. A cor amarela indica controle ou reações negativas, e a cor roxa indica uma reação positiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Figura 7: Modo de análise de dados. À esquerda, os usuários selecionam os conjuntos de dados que gostariam de plotar; os gráficos são então exibidos à direita com cores exclusivas para cada amostra ou conjunto de controle. A linha vermelha tracejada serve como um limite para determinar amostras positivas e negativas. As amostras testadas em triplicado que excedam o limiar são consideradas positivas, enquanto as amostras abaixo do limiar são consideradas negativas. As barras de erro representam o desvio padrão (DP) de três replicações. Ctrl 1 a Ctrl 5 indica controles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Figura 8. PLUM, um leitor de placas portátil. Este leitor de placas portátil atua como um lab-in-a-box e serve como um leitor de placas com temperatura controlada para incubar e monitorar reações colorimétricas. Este dispositivo portátil pode fornecer medições quantitativas e de alto rendimento dos sensores Zika baseados em papel no local. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Figura 9: Gráfico RT-qPCR da amplificação de duas amostras de pacientes testadas em triplicado para a detecção do vírus Zika. As amostras são consideradas positivas quando o valor do limiar de ciclo (Ct) é ≤38. A linha vermelha pontilhada serve como um limiar para determinar amostras positivas e negativas. O traço vermelho indica uma amostra positiva e o traço azul indica uma amostra negativa. O valor de ΔRn (delta Rn) representa a magnitude normalizada do sinal de fluorescência detectado pelo instrumento RT-qPCR para todas as amostras testadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo de Protocolo Suplementar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Números Suplementares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esses números.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

O acesso a diagnósticos descentralizados, de baixo custo e de alta capacidade que podem ser implantados na comunidade para testes descentralizados é fundamental para combater crises globais de saúde. Este manuscrito descreve como construir diagnósticos baseados em papel para sequências de RNA viral que podem ser detectadas com um leitor óptico portátil.

Estudo de Projeto para Implementação para Desenvolvimento e Validação de Pacientes de Diagnósticos de Interruptores de Retenção de Pé Baseados em Papel

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Nosso protocolo descreve o projeto, a montagem e a validação de diagnósticos baseados em circuitos genéticos. Esses diagnósticos moleculares baseados em papel são de baixo custo e sensíveis, sendo capazes de detectar concentrações clinicamente relevantes de ácidos nucleicos e podem ser projetados para detectar praticamente qualquer sequência. Esta é uma tecnologia de plataforma que pode ser projetada pelos usuários para suas necessidades e tem o potencial de trazer diagnósticos de nível clínico para configurações de recursos odontológicos mais descentralizadas.O sensor de interruptor de retenção de dedo livre de células pode ser projetado para praticamente qualquer alvo à base de ácido nucleico. Trabalhos recentes demonstraram diagnósticos livres de células para Ebola, norovírus, SARS-CoV-2, C.difficile e bactérias causadoras de febre tifoide. Demonstrando o procedimento estarão Severino Jefferson Rivero da Silva, pós-doutorando, e Pouriya Bayat, doutoranda do meu laboratório.Para projetar o interruptor de apoio ao dedo do pé, identifique as sequências-alvo do genoma do vírus Zika e escolha as sequências-alvo do vírus Zika a partir dos amplificadores, conforme descrito no protocolo de texto. Baixe o pacote de software de design do interruptor do dedo do pé. Abra o MATLAB e navegue até a pasta do software de design.Insira as sequências de destino no arquivo csv do arquivo de entrada de design localizado na subpasta de entrada. Selecione os parâmetros a serem usados para a função de design. Execute a função de design para gerar os designs do interruptor de retenção para os alvos de interesse.Após a conclusão, navegue até a pasta final_designs e localize as sequências de design do switch de dedo do pé superior e as sequências de destino correspondentes em planilhas no formato csv. Certifique-se de que as sequências de DNA de interruptor de dedo do pé geradas pelo algoritmo contenham as sequências promotoras T7 na extremidade cinco primos e uma sequência conservada de 21 ligadores de nucleotídeos nas três extremidades primos. Use o NCBI BLAST para filtrar as sequências de design do interruptor de dedo do pé superior em relação a outros vírus comuns, verificando a homologia de sequência.Aceitar sequências com menos de 40% de hemologia. Preparar soluções dos oligos de DNA hairpin do interruptor do dedo do pé e iniciadores de amplificação reversa a uma concentração de 10 micromolares em água livre de nuclease. Monte as reações em tubos de PCR sobre gelo de acordo com esta tabela.Coloque os tubos de reação em um termociclador, seguindo as condições de ciclagem listadas nesta tabela. Analise os produtos de PCR em um gel de agarose. Purificar os produtos de PCR e eluir o DNA em um volume mínimo de água livre de nuclease para garantir uma concentração suficientemente alta.Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro. Prepare uma solução-mãe de CPRG dissolvendo 25 miligramas do pó em um mililitro de água livre de nuclease. Prepare uma mistura mestre no gelo de acordo com o protocolo padrão mostrado aqui.Dispense a mistura mestra sem células em tubos de PCR. Para controles sem células e controles de interruptor sozinhos, adicione água livre de nuclease a um volume de 5,94 microlitros. E para a reação, adicione o DNA do interruptor de dedo do pé purificado por PCR para obter uma concentração final de 33 nanomolares.Para testar o interruptor de apoio do dedo do pé e a combinação de RNA alvo, adicione o RNA-alvo transcrito in vitro a uma concentração final de um micromolar. Misture todas as reações completamente pipetando e centrifugando brevemente. Em uma placa de fundo claro preto de 384 poços, adicione 30 microlitros de água livre de nuclease aos poços que cercam os poços de reação.Em seguida, usando um punção de biópsia de dois milímetros e uma pinça, corte os discos de papel de filtro bloqueados pela BSA e coloque-os nos poços de reação. Dispense 1,8 microlitros de cada tubo de reação nos discos de papel de filtro na placa de 384 poços em triplicado. Cubra a placa com filme de PCR transparente e coloque-a em um leitor de placas.Meça a absorvância a 570 nanômetros a 37 graus Celsius a cada minuto por 130 minutos. Preparar uma solução-mãe de 25 micromolares de todos os conjuntos de primer para a frente e para trás em água isenta de nuclease. Configure uma reação de cinco microlitros usando a mistura mestre mostrada aqui.Misture por pipetagem até que o precipitado branco solubilize e, em seguida, dispense em tubos de PCR. Adicione os primers para frente e para trás aos tubos apropriados, seguido pela adição de um microlitro de água livre de nuclease ou dois picomolares de RNA de gatilho alvo. Misture suavemente pipetando e gire brevemente os tubos.Configure o protocolo de incubação em um termociclador, como mostrado aqui. Após 12 minutos, retire os tubos e adicione 1,25 microlitros da mistura enzimática a cada tubo, seguido de mistura e centrifugação. Devolva os tubos ao termociclador depois de pular a etapa de retenção de 41 graus Celsius para iniciar a incubação da reação de uma hora.Em seguida, para avaliar o desempenho do primer, monte as reações de interruptor de dedo do pé sem células baseadas em papel e analise os dados. Para análise de sensibilidade, identifique pares de iniciadores candidatos e prepare diluições seriadas de RNA alvo em água livre de nuclease. Repita as reações NASBA e livre de células com os conjuntos de primer selecionados em triplicados biológicos.Usando um microlitro de RNA extraído do paciente, execute a amplificação NASBA e as reações livres de células à base de papel, conforme mostrado na seção cinco. Após as reações, prepare a placa de reação de 384 poços e execute o ensaio em um leitor de placas portátil a 37 graus Celsius. Em seguida, monte os componentes RT-qPCR e adicione os reagentes a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro de acordo com esta tabela.Misture a reação por pipetagem. Dispense 6,5 microlitros em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços ou 384 poços, seguida por 3,5 microlitros de cada molde de RNA em triplicado. Coloque um filme de PCR sobre a parte superior da placa.Centrifugar a placa de 384 poços a 600 vezes G por dois minutos. Coloque a placa em uma máquina RT-qPCR e execute as condições de ciclismo, conforme mostrado aqui. Seguindo o delineamento computacional, três interruptores de dedo do pé foram construídos e analisados por eletroforese em gel de agarose.Uma banda em torno de 3.000 pares de bases indicou uma reação bem-sucedida. Os interruptores de dedo do pé foram avaliados em relação ao respectivo RNA desencadeante transcrito in vitro. Enquanto todos os três sensores exibiram um aumento na absorvência, o sensor 27B teve a taxa mais rápida, enquanto os interruptores 33B e 47B tiveram uma menor relação liga/desliga, indicando atividade de fundo e especificidade reduzida.A mudança de dobra de absorbância a 570 nanômetros mostrou que o interruptor 27B tem o melhor desempenho com uma relação de sinal on/off. Além disso, quando acoplado ao NASBA, ele pode detectar RNA em concentrações tão baixas quanto 124 moléculas por microlitro, indicando alta sensibilidade. Amostras de pacientes com o vírus Zika do Brasil foram testadas para avaliar a precisão diagnóstica clínica dos sensores usando um leitor de placas portátil.Uma mudança de cor de amarelo para roxo identificou uma amostra positiva. A resposta colorimétrica para cada reação baseada em papel foi plotada ao longo do tempo pelo software integrado no leitor de placas portátil PLUM. As amostras que ultrapassaram o limiar foram consideradas positivas.O desempenho clínico do sensor foi estabelecido por comparação com a RT-qPCR. As amostras foram consideradas positivas quando o valor do limiar do ciclo foi igual ou inferior a 38. É importante garantir que os resultados das telas de troca de dedo do pé e da sensibilidade do primer NASBA sejam reprodutíveis e otimizados antes de avançar com os ensaios com pacientes.Dada a sua simplicidade e adaptabilidade, a plataforma diagnóstica aqui descrita abriu caminho para o desenvolvimento de novas ferramentas de ponto de atendimento que possam trazer benefícios para o sistema de saúde, especialmente para os países de baixa renda.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Caracterização de Sistemas Complexos Usando o Projeto de Experimentos Abordagem: Transient Protein Expression em tabaco como um Estudo de Caso

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

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Levitação magnética Juntamente com imagem Portátil e Análise para a doença Diagnostics

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Modelo de coração Neonatal anatomicamente realista para uso em simuladores de paciente Neonatal

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Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

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