Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Авторы благодарят всех членов лабораторий Грина, Парди и Пены, а также всех соавторов предыдущих рукописей, относящихся к работе, раскрытой в этой рукописи. S.J.R.d.S. был поддержан стипендией PhD, спонсируемой Фондом науки и техники Пернамбуку (FACEPE), Бразилия, ссылочный номер IBPG-1321-2.12/18, и в настоящее время поддерживается постдокторской стипендией, спонсируемой Университетом Торонто, Канада. P.B. поддерживается премией Уильяма Кнаппа Бакли от фармацевтического факультета Университета Торонто. M.K. был поддержан Инициативой точной медицины (PRiME) в Университете Торонто с внутренним номером стипендии PRMF2019-002. Эта работа была поддержана средствами K.P из Канадской программы исследовательских кафедр (файлы 950-231075 и 950-233107), Фонда управления крупными исследовательскими проектами Университета Торонто, Программы грантов Фонда CIHR (201610FDN-375469) и L.P, A.A.G. и K.P через грант CIHR/IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), а также за счет средств K.P. от Канадского международного исследовательского центра развития (грант 109434-001) через Канадскую возможность быстрого финансирования исследований в связи с новым коронавирусом (COVID-19) в Канаде. Эта работа также была поддержана средствами для A.A.G. из премии New Investigator Award Комиссии по биомедицинским исследованиям Аризоны (ADHS16-162400), Фонда Гейтса (OPP1160667), премии директора NIH New Innovator Award (1DP2GM126892), премии NIH R21 (1R21AI136571-01A1) для K.P./A.A.G. и стипендии Альфреда. Слоуна (FG-2017-9108). Рисунок 1 был создан с Biorender.com под академической лицензией K.P.

<ol>
	<li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world.">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, 73-79 (2006).</li><li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+diagnostics+for+global+health.">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil.">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+Early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis.">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li><li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants.">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li><li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor.">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).</li><li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment.">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li><li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors.">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li><li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics.">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li><li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection.">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li><li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter.">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR&#946;-specific+endocrine+disruptors.">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTR&#946;-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine:+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach.">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li><li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors.">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li><li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis.">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li><li>Gr&#228;we, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper-based,+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs.">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).</li><li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toehold+Switches:+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression.">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li><li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics:+a+critical+review.">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li><li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification.">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers.">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li><li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples.">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li><li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information.">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li><li>. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022)</li><li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+(NASBA).">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li><li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization.">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).</li><li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+automated+DNA+assembly:+Best+practices,+metrics,+and+protocols+using+robots.">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).</li><li>Silva, S. J. R., de Magalh&#227;es, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+circulation+of+DENV,+CHIKV,+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil:+An+inconvenient+truth.">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205 (2021).</li><li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso.">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li><li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts.">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).</li><li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+(RT-LAMP)+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil.">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li></ol>

K.P. и A.A.G. являются соавторами технологий, связанных с датчиками на бумажной основе. Y.G., S.C. и K.P. являются соучредителями LSK Technologies, Inc. и соавторами технологий, связанных с PLUM. M.K., K.P. и A.A.G. являются соучредителями En Carta Diagnostics Ltd. У других авторов нет конфликта интересов. Патенты: Устройство PLUM: Y.G., S.C. и K.P. Заявка на патент была подана Университетом Торонто и передана LSK Technologies Inc. Предварительная патентная заявка США No 62/982,323, поданная 27 февраля 2020 года; Патент на переключатель Toehold: A.A.G., P.Y. и J.J.C. "Составы риборегуляторов и способы использования", Патент. WO2014074648A3 подано 6 ноября 2012 г.; Диагностический патент на бумажной основе: K.P. и J.J.C. "Синтетические генные сети на бумажной основе" Патент США находится на рассмотрении No. US15/963,831 подано 6 декабря 2013 года; Патент Зика 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. и J.J.C., «Портативная, недорогая платформа обнаружения вирусов и идентификации штаммов», предварительная патентная заявка США No 62/403,778, поданная 4 октября 2016 года; Патент Зика 2: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. и J.J.C., «Портативная, недорогая платформа обнаружения вирусов и идентификации штаммов», Предварительная патентная заявка США No 62/341,221, поданная 25 мая 2016 года.

Комбинированная бумажная система, описанная здесь, может довести клинически значимую молекулярную диагностику с производительностью, функционально сопоставимой с RT-qPCR, до точки необходимости6. Важно отметить, что для удаленных настроек доступность диагностики на месте может сократить время получения результатов с дней до нескольких часов. Подчеркивая программируемость этого подхода, описанный конвейер может быть использован для обнаружения практически любой патогенной мишени. Мы объединили молекулярные инструменты со специализированным портативным пластинчатым считывателем, который компактен и совместим с батареей (8–9 ч) и обеспечивает встроенный анализ данных для обеспечения распределенных приложений. В другой работе мы проверили комбинированное оборудование и платформу диагностики вируса Зика с 268 образцами пациентов, параллельно с RT-qPCR, и обнаружили диагностическую точность 98,5%24. В совокупности наша цель состоит в том, чтобы обеспечить передачу технологии этой платформы исследователям, чтобы она могла быть перепрофилирована и улучшена сообществом для удовлетворения неудовлетворенных диагностических потребностей.
Процесс проектирования переключателя in silico toehold был интегрирован и автоматизирован в трубопровод, который можно разделить на три этапа. Первый этап генерирует пул конструкций переключателей, которые гибридизируются с целевой последовательностью с одним нуклеотидным шагом. На втором этапе проверяется вторичная структура и доступность переключателя носков, а также устраняются датчики с внутрирамочными кодонами преждевременной остановки. Затем реализуется функция оценки, которая учитывает несколько факторов (например, уровень дефекта переключателя toehold, доступность переключателя toehold и доступность целевого сайта), чтобы выбрать конструкции коммутатора верхнего носового удержания на основе общих оценок. На заключительном этапе формируется список последовательностей для конструкций переключателей верхнего носка и соответствующих им целевых триггеров. Верхние последовательности датчиков должны быть проверены на специфичность по отношению к транскриптому человека и тесно связанным вирусным геномам с использованием NCBI/Primer-BLAST25. Также рекомендуется проверять целевые участки датчиков для сохранения последовательностей в вирусном геноме вируса Зика, чтобы гарантировать, что датчики обеспечат широкое и надежное обнаружение. Было разработано несколько версий программного обеспечения для проектирования коммутаторов toehold, и алгоритм проектирования позволяет пользователям генерировать две версии, либо коммутаторы серии A6, либо коммутаторы серии B6. В этой статье основное внимание было уделено дизайну переключателя серии B.
После коммерческого синтеза ДНК переключатели пальцев ног могут быть быстро собраны, а затем протестированы путем выполнения начального скрининга против синтетической последовательности триггера-мишени, которая соответствует коротким областям (200-300 нт) генома-мишени. Для скрининга производительности датчиков на основе переключателя toehold идеально добавить целевую последовательность в виде РНК. В этой статье были описаны шаги, необходимые для добавления транскрибированной in vitro триггерной РНК. Однако, если таковые имеются, можно использовать полноразмерные шаблоны генома, такие как количественные вирусные экстракты РНК или коммерческие синтетические геномы или стандарты РНК. Использование полноразмерных геномов РНК для первоначального скрининга переключения пальцев ног полезно, поскольку оно может сообщить, повлияют ли дополнительные факторы, такие как вторичная структура РНК, на производительность датчика. Чтобы оптимизировать соотношение ON/OFF переключателей-кандидатов, ДНК переключателя носкворка может быть титрована в бесклеточную реакцию. Этот этап также может служить для идентификации высокопроизводительных переключателей носковых удерживающих устройств (сгибающее усиление или высокое соотношение ON/OFF) и пропускать протекающие переключатели носкового удержания (высокий сигнал в отсутствие целевой РНК) с последующих этапов характеризации.
Чтобы улучшить предел обнаружения наиболее эффективных кандидатов на переключение пальцев ног, NASBA используется для повышения клинически значимых концентраций целевой вирусной РНК Зика до уровня, который может быть обнаружен переключателями6. Различные комбинации наборов прямых и обратных праймеров проверяются для определения наилучших комбинаций праймера NASBA и переключателя носок, чтобы обеспечить обнаружение клинически значимых концентраций. После того, как идеальная комбинация праймера и переключателя носкреба была идентифицирована, анализ переносится на клиническую проверку. Важно отметить, что этапы переключения носков и скрининга NASBA могут быть трудоемкими и ресурсоемкими, и поэтому разработка тестов лучше всего подходит для хорошо обеспеченных ресурсами исследовательских объектов. Хотя мы не применяли автоматизацию процессов, вполне вероятно, что это может ускорить итеративный цикл проектирования, сборки и тестирования32. К счастью, время обработки от проектирования датчиков и тестирования до развертывания может быть удивительно коротким (менее недели), что делает эту стратегию идеальной для критических по времени ситуаций, таких как эпидемические вспышки6.
Даже после того, как был разработан биосенсор с клинически значимой чувствительностью, существуют технические проблемы, которые необходимо решить. Поскольку этот протокол включает в себя ручное управление и является многоэтапной процедурой, существует риск перекрестного загрязнения между образцами. Мы делаем все возможное, чтобы уменьшить этот риск с помощью тщательной лабораторной практики. В недавнем клиническом испытании 268 образцов пациентов мы не столкнулись с какими-либо проблемами загрязнения; однако это важное соображение24. Имея это в виду, протокол остается лабораторным анализом и требует опытного пользователя, владеющего надлежащими методами молекулярной биологии. Дополнительным соображением при развертывании является выделение РНК из образцов пациентов. Здесь мы описываем изоляцию РНК с использованием наборов экстракции нуклеиновых кислот на основе колонн. Однако в других работах мы продемонстрировали эффективный и простой метод кипящего лизиса (95 °C в течение 2 мин) для обработки образцов пациентов с низкой нагрузкой6. Эта стратегия почти устраняет затраты, связанные с извлечением РНК, и позволяет избежать использования наборов для экстракции нуклеиновых кислот на основе колонн, которые могут представлять логистическую проблему в условиях ограниченных ресурсов или проблемах цепочки поставок во время кризисов, таких как пандемия COVID-1933.
Как мы видели во время пандемии COVID-19, инструменты, используемые для выполнения RT-qPCR, сами по себе могут служить узким местом и ограничивать доступ пациентов к тестированию. Этот фактор, который также в значительной степени является финансовым, приводит к централизованному режиму тестирования, который может ограничить диагностический доступ. Например, во время вспышки Зика в 2015/2016 годах в Бразилии было доступно только пять национальных референс-лабораторий, что вызвало задержки в тестировании пациентов. Без учета потенциальной выгоды от эффекта масштаба, текущая стоимость товаров для портативного считывателя пластин составляет ~ 500 долларов США, что, даже если увеличить в пять раз с учетом рабочей силы и коммерческой маржи, по-прежнему обеспечивает доступный инструмент. Это хорошо сопоставимо с инструментами RT-qPCR, стоимость которых варьируется от 15 000 до 90 000долларов США 34. Кроме того, оценочная стоимость одного теста для бесклеточного анализа в Латинской Америке составляет около 5,48 доллара США, в то время как стоимость теста RT-qPCR в Бразилии составляла ~ 10-11 долларов США на момент вспышки Зика36. Помимо стоимости оборудования, портативный считыватель пластин имеет небольшую площадь (20см3), автоматический анализ, загрузку данных в облако через Интернет и может работать от батареи. Эти функции значительно расширяют потенциальные возможности, в которых может быть развернуто тестирование, и одновременно расширяют популяцию пациентов, которые могут быть обслужены.
На сегодняшний день наиболее распространенными коммерческими платформами E. coli CFPS являются системы S30 и PURE37; однако одним из ключевых факторов улучшения доступа к диагностике в странах с низким и средним уровнем дохода является ограниченность наличия этих реагентов на внутреннем рынке. Важным шагом на пути к решению этой проблемы является развитие местного производства CFPS. Лаборатория Federici недавно добилась значительного прогресса в разработке некоммерческой платформы для реализации датчиков на основе переключателей в бесклеточных системах на основе лизата, достигнув LOD 2,7 fM с РНК14 вируса Зика. Это достижение не только позволяет производить реагенты в стране использования, избегая импортных тарифов и задержек, но затраты на рабочую силу также масштабируются до местных ставок, и, таким образом, общая стоимость может быть значительно снижена. В работе, изложенной группой Федеричи, стоимость производства реакции экспрессии CFPS (5 мкл) в Чили составила 6,9 центов (USD)35,38, обеспечивая двойной стимул (улучшенная логистика и стоимость) для внедрения систем на основе лизата 35,38.
Размещение тестирования, сопоставимого с RT-qPCR, в распределенных диагностических сетях может принести значительные преимущества по сравнению с нынешней практикой, которая зависит от транспортировки образцов на централизованные объекты RT-qPCR. В пригородных условиях, где были сосредоточены случаи Зика, физическое расстояние между пациентом и диагностическим учреждением замедляет диагностику и увеличивает риск того, что результаты не достигнут пациента в клинически значимое время. Мы надеемся, что представленная здесь работа может способствовать тому, чтобы научно-исследовательское сообщество путем передачи знаний могло создать децентрализованные биотехнологии и портативное оборудование для здоровья человека, сельского хозяйства и мониторинга окружающей среды.

RT-qPCR остается золотым стандартом технологии клинической диагностики благодаря своей отличной чувствительности и специфичности. Несмотря на высокую надежность, метод зависит от дорогостоящего специализированного оборудования и реагентов, которые требуют распределения и хранения с контролируемой температурой. Это создает значительные препятствия для доступности качественной диагностики во всем мире, особенно во время вспышек заболеваний и в регионах, где доступ к хорошо оборудованным лабораториям ограничен 1,2. Это наблюдалось во время вспышки вируса Зика в Бразилии в 2015/2016 гг. Поскольку для проведения тестирования RT-qPCR доступно только пять централизованных лабораторий, возникли значительные узкие места, ограничившие доступ к диагностике. Это было особенно сложно для людей в пригородных условиях, которые более серьезно пострадали от вспышки 3,4. В целях улучшения доступа к диагностике протокол демонстрирует платформу, которая была разработана с потенциалом для обеспечения децентрализованной, недорогой и высокопроизводительной диагностики в условиях ограниченных ресурсов. В рамках этого был создан диагностический конвейер обнаружения, соединяющий изотермическую амплификацию и синтетические датчики на основе переключателей РНК с бумажными системами бесклеточной экспрессии 5,6.
Системы бесклеточного синтеза белка (CFPS), в частности бесклеточные системы на основе E. coli, являются привлекательной платформой для широкого спектра применений биозондирования от мониторинга окружающей среды 7,8 до диагностики патогенов 5,6,9,10,11,12 . Содержащие компоненты, необходимые для транскрипции и трансляции, системы CFPS имеют значительные преимущества перед полноклеточными биосенсорами. В частности, зондирование не ограничено клеточной стенкой и, как правило, они являются модульными по конструкции, биобезопасными, недорогими и могут быть сублимированы для портативного использования. Способность сублимировать реакции на основе генной цепи на подложках, таких как бумага или текстиль, обеспечивает транспортировку, длительное хранение при комнатной температуре5 и даже включение в носимую технологию13.
Предыдущая работа показала, что бесклеточные системы E. coli могут быть использованы для обнаружения многочисленных аналитов, например, токсичных металлов, таких как ртуть, антибиотиков, таких как тетрациклин 7,14, химических веществ, разрушающих эндокринную систему 15,16, биомаркеров, таких как гиппуровая кислота17, патоген-ассоциированных молекул кворума 9,18 и запрещенных веществ, таких как кокаин17 и гамма-гидроксибутират (ГОМК)19 . Для определения последовательности нуклеиновых кислот стратегии по большей части основывались на использовании биосенсоров на основе переключателей, связанных с методами изотермической амплификации. Переключатели Toehold представляют собой синтетические риборегуляторы (также называемые просто «переключателями» в остальной части текста), которые содержат структуру шпильки, которая блокирует нисходящую трансляцию путем секвестрации сайта рибосомального связывания (RBS) и стартового кодона. При взаимодействии с их целевой триггерной РНК структура шпильки снимается и включается последующая трансляция репортера открытого кадра считывания20.
Изотермическая амплификация также может быть использована в качестве молекулярной диагностики21; однако эти методы подвержены неспецифическому усилению, что может снизить специфичность и, следовательно, точность теста ниже, чем у RT-qPCR 22. В работе, представленной здесь, изотермическое усиление перед датчиками на основе переключателей использовалось для обеспечения комбинированного усиления сигнала, которое позволяет клинически значимо обнаруживать нуклеиновые кислоты (от фемтомолярных до аттомолярных). Это сопряжение двух методов также обеспечивает две специфичные для последовательности контрольные точки, которые в сочетании обеспечивают высокий уровень специфичности. Используя этот подход, предыдущая работа продемонстрировала обнаружение таких вирусов, как Зика6, Эбола5, Норовирус10, а также патогенных бактерий, таких как C. difficile23 и устойчивый к антибиотикам брюшной тиф12. Совсем недавно были продемонстрированы бесклеточные переключатели для обнаружения SARS-CoV-2 в целях обеспечения доступной диагностики пандемии COVID-19 11,12,13.
В следующем протоколе описывается разработка и валидация бесклеточного синтетического анализа на основе бумаги для обнаружения вируса Зика, от проектирования биосенсора in silico через этапы сборки и оптимизации до полевой валидации с образцами пациентов. Протокол начинается с проектирования in silico датчиков на основе переключателей РНК и праймеров изотермической амплификации, специфичных для вирусной РНК Зика. Хотя существует множество методов изотермической амплификации, здесь было продемонстрировано использование амплификации на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA) для повышения концентрации вирусной РНК-мишени, присутствующей в реакции, что обеспечивает клинически значимую чувствительность. Практически, методы изотермического усиления имеют преимущество работы при постоянной температуре, устраняя необходимость в специализированном оборудовании, таком как тепловые циклеры, которые, как правило, ограничены централизованными местоположениями.
Далее описан процесс сборки синтетических датчиков переключателя с репортерными кодирующими последовательностями через перекрывающую ПЦР расширения и скрининга синтетических датчиков переключателя на носок для оптимальной производительности в бесклеточных системах с использованием синтетической РНК. Для этого набора датчиков вируса Зика мы выбрали ген lacZ , кодирующий фермент β-галактозидазы, который способен расщеплять колориметрический субстрат, хлорфенол красного β-D-галактопиранозид (CPRG), чтобы произвести изменение цвета от желтого до фиолетового, которое может быть обнаружено глазом или с помощью считывателя пластин. Как только наиболее эффективные синтетические переключатели идентифицированы, описан процесс скрининга праймеров для изотермической амплификации соответствующей целевой последовательности на основе последовательностей нуклеиновых кислот с использованием синтетической РНК для поиска наборов, обеспечивающих наилучшую чувствительность.
Наконец, производительность диагностической платформы проверяется на месте в Латинской Америке (рисунок 1). Для определения клинической диагностической точности проводится бумажный бесклеточный анализ с использованием образцов вируса Зика от пациентов; параллельно для сравнения проводится анализ RT-qPCR золотого стандарта. Для мониторинга колориметрических бесклеточных анализов мы обеспечиваем количественную оценку результатов на месте в регионах, где тепловые циклеры недоступны. Собранный вручную считыватель пластин под названием Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; далее именуемый портативным считывателем пластин) также представлен здесь24. Первоначально разработанный в качестве сопутствующего устройства для бесклеточной диагностики синтетических переключателей пальцев ног, портативный считыватель пластин предлагает доступный способ инкубации и считывания результатов с высокой пропускной способностью, обеспечивая интегрированный анализ программного обеспечения на основе компьютерного зрения для пользователей.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Рисунок 1: Рабочий процесс для тестирования образцов пациентов с использованием бумажных бесклеточных реакций переключения пальцев ног. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

Доступ к низкой молекулярной диагностике, которая может быть развернута в сообществе для тестирования, становится все более важным и имеет значимые более широкие последствия для благополучия обществ и экономической стабильности. В последние годы появилось несколько новых изотермических диагностических методов для удовлетворения потребности в быстрой и недорогой молекулярной диагностике. Мы внесли свой вклад в эти усилия путем разработки и проверки пациентом диагностики на основе переключателей пальцев ног, включая диагностику переносимых комарами вирусов Зика и чикунгуньи, которые обеспечили производительность, сопоставимую с анализами на основе золотого стандарта обратной транскрипции и количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR). Эти диагностические средства недороги в разработке и производстве, и они могут обеспечить диагностический потенциал для сред с низким уровнем ресурсов. Здесь протокол предоставляет все шаги, необходимые для разработки анализа на основе коммутатора для обнаружения вируса Зика. Статья проводит читателей через поэтапный процесс разработки диагностики. Во-первых, геномные последовательности вируса Зика служат входными данными для вычислительного проектирования коммутаторов-кандидатов с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом. Далее показана сборка датчиков для эмпирического скрининга с синтетическими последовательностями РНК и оптимизация диагностической чувствительности. После завершения валидация выполняется с образцами пациентов параллельно с RT-qPCR и специально построенным оптическим считывателем PLUM. Эта работа предоставляет техническую дорожную карту для исследователей для разработки недорогих датчиков на основе переключателей пальцев ног для применения в здравоохранении человека, сельском хозяйстве и мониторинге окружающей среды.

После вычислительного проектирования конструкция трех носочных переключателей была выполнена методом ПЦР. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза агарозного геля (рисунок 2). Наличие четкой полосы около 3000 bp, примерно размером с ген lacZ , связанного с переключением пальцев ног, обычно указывает на успешную реакцию. В качестве альтернативы, полоса без полосы, нескольких полос или полосы неправильного размера указывает на неудачную ПЦР. В случае неудачной ПЦР условия реакции и/или последовательности праймеров должны быть оптимизированы.
Собранные переключатели были экранированы для оценки каждого датчика по его соответствующей транскрибированной in vitro триггерной РНК (рисунок 3). В то время как все три датчика отображали повышенное поглощение OD570 , переключатель 27B (рисунок 3A) имел самую быструю скорость включения. Переключатели 33B и, в меньшей степени, 47B показали повышенное поглощение OD570 в отсутствие РНК целевого триггера, что указывает на то, что эти переключатели обладают некоторой фоновой активностью или утечкой (рисунок 3B, C) - черта, не желаемая в датчике-кандидате, поскольку она может снизить специфичность. Для более четкой идентификации датчика с наибольшим соотношением сигналов ON/OFF было рассчитано изменение коэффициента поглощения OD570 (см. раздел 5 дополнительной информации) и построен график (рисунок 4). Из этого анализа ясно, что переключатель 27B - это датчик, который имеет наилучшую производительность с соотношением ON / OFF около 60.
Затем оценивали чувствительность наиболее эффективного переключателя носочного удержания (27B) путем определения самой низкой концентрации РНК, необходимой для активации переключателя toehold в сочетании с реакцией NASBA. График показывает, что наиболее эффективные датчики Зика могут обнаруживать РНК в концентрациях до 1,24 молекулы на мкл (что эквивалентно ~ 2 аМ; Рисунок 5).
После того, как переключатель 27B был идентифицирован и проверен, материалы датчиков были распределены среди членов команды в Ресифи в штате Пернамбуку в Бразилии. В Бразилии клиническая диагностическая точность диагностической платформы вируса Зика оценивалась с использованием образцов пациентов с вирусом Зика параллельно с RT-qPCR для сравнения. Для проверки бумажной диагностической платформы Zika был использован портативный считыватель пластин, который способен инкубировать и считывать колориметрический выход бумажных датчиков. Изменение цвета с желтого на фиолетовый используется для идентификации положительного образца, в то время как отрицательный образец остается желтым (рисунок 6). Дополнительной опцией для визуализации результатов, генерируемых портативным считывателем пластин (рисунок 8), является построение колориметрического отклика для каждой реакции на бумажной основе с течением времени. Образцы были протестированы в трех экземплярах, а те, которые превысили пороговое значение (красная линия установлена на 1), считались положительными, в то время как образцы ниже порога считались отрицательными (рисунок 6 и рисунок 7).
Наконец, чтобы оценить и сравнить клиническую производительность датчика переключателя Зика с текущим методом золотого стандарта для диагностики вирусной инфекции Зика, все образцы пациентов были протестированы параллельно с RT-qPCR. График амплификации двух репрезентативных образцов пациентов был протестирован в трех экземплярах для обнаружения вируса Зика с помощью RT-qPCR (рисунок 9). Образцы считаются положительными, когда пороговое значение цикла (Ct) составляет ≤38; красная линия указывает на положительный образец, а синяя линия указывает на отрицательный образец на вирус Зика.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Рисунок 2: Электрофорез агарозного геля для оценки качества продуктов ПЦР. Продукты ПЦР анализируют на 1% агарозном геле в 1X TAE, запускают при 80 В в течение 90 мин. Одна четкая полоса обычно указывает на успешную реакцию. Полоса 1: 1 кб ДНК лестницы; Полосы 2-4: 27B переключает ДНК, 33B триггер ДНК и 47B триггер ДНК соответственно. Цифры с левой стороны представляют размер полосы в bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Рисунок 3: Прототип трех носочных переключателей для бумажных датчиков Зика. Производительность трех бумажных датчиков переключателя РНК измерялась при 37 °C в течение более 130 минут. Каждый график содержит две трассировки, одна из которых представляет только элемент управления переключателем, а другая представляет переключатель и триггер. Три графика представляют данные, полученные с помощью датчиков 27B (A), 33B (B) и 47B (C). Полосы ошибок представляют стандартную погрешность среднего значения (SEM) из трех реплик. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Рисунок 4: Наиболее эффективные датчики идентифицируются путем расчета изменения коэффициента поглощения при 570 нм. Изменение сгиба (или максимальное соотношение ON/OFF) рассчитывается путем измерения соотношения поглощения (OD570) через 130 мин между переключателем только управления и переключателем плюс триггер CFPS анализ. Полосы ошибок представляют SEM из трех реплик. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Рисунок 5: Оценка чувствительности наиболее эффективного переключателя. In vitro транскрибированная РНК Зика титруется в реакции NASBA. После 1-часовой инкубации реакции добавляли к бесклеточным реакциям PURExpress на бумажных дисках в соотношении 1:7. Производится изменение складки через 130 мин при 37 °C. Эта цифра воспроизводится из24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Рисунок 6: Портативный считыватель пластин, загруженный захваченными данными изображения. На этом рисунке показан образец окончательного изображения, полученного портативным устройством считывания пластин во время сбора данных. Исходная отметка даты и времени видна в верхней части изображения. Желтый цвет указывает на контроль или отрицательные реакции, а фиолетовый цвет указывает на положительную реакцию. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Рисунок 7: Режим анализа данных. Слева пользователи выбирают наборы данных, которые они хотели бы построить; затем графики отображаются справа с уникальными цветами для каждого образца или набора элементов управления. Пунктирная красная линия служит порогом для определения положительных и отрицательных образцов. Образцы, протестированные в трех экземплярах, которые превышают пороговое значение, считаются положительными, в то время как образцы ниже порога считаются отрицательными. Полосы ошибок представляют стандартное отклонение (SD) от трех реплик. Ctrl 1 - Ctrl 5 указывает на элементы управления. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Рисунок 8. PLUM, портативный считыватель пластин. Этот портативный считыватель пластин действует как лаборатория в коробке и служит в качестве считывателя пластин с контролируемой температурой для инкубации и мониторинга колориметрических реакций. Это портативное устройство может обеспечить количественные и высокопроизводительные измерения бумажных датчиков Зика на месте. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Рисунок 9: График RT-qPCR амплификации двух образцов пациентов, протестированных в трех экземплярах для обнаружения вируса Зика. Образцы считаются положительными, когда пороговое значение цикла (Ct) составляет ≤38. Пунктирная красная линия служит порогом для определения положительных и отрицательных образцов. Красный след указывает на положительный образец, а синий след указывает на отрицательный образец. Значение ΔRn (дельта Rn) представляет собой нормализованную величину флуоресцентного сигнала, обнаруженного прибором RT-qPCR для всех тестируемых образцов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Файл дополнительного протокола. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительные цифры. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти рисунки.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

Доступ к децентрализованной, недорогой и высокопроизводительной диагностике, которая может быть развернута в сообществе для децентрализованного тестирования, имеет решающее значение для борьбы с глобальными кризисами в области здравоохранения. В этой рукописи описывается, как построить бумажную диагностику для последовательностей вирусных РНК, которые могут быть обнаружены с помощью портативного оптического считывателя.

Исследование от проектирования до внедрения для разработки и проверки пациентом бумажной диагностики toehold Switch

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Наш протокол описывает проектирование, сборку и валидацию диагностики на основе генных схем. Эти бумажные молекулярные диагностики являются недорогими и чувствительными, способными обнаруживать клинически значимые концентрации нуклеиновых кислот и могут быть разработаны для обнаружения практически любой последовательности. Это технология платформы, которая может быть разработана пользователями для их нужд и имеет потенциал для переноса диагностики клинического уровня в более децентрализованные стоматологические ресурсы.Бесклеточный датчик переключения может быть разработан практически для любой мишени на основе нуклеиновых кислот. Недавняя работа продемонстрировала бесклеточную диагностику Эболы, норовируса, SARS-CoV-2, C.difficile и бактерий, вызывающих брюшной тиф. Продемонстрировать процедуру будут Северино Джефферсон Риверо да Силва, постдокторант, и Пурия Баят, аспирант из моей лаборатории.Чтобы спроектировать переключатель, определите целевые последовательности из генома вируса Зика и выберите целевые последовательности вируса Зика из ампликонов, как описано в текстовом протоколе. Загрузите пакет программного обеспечения для проектирования коммутаторов toehold. Откройте MATLAB и перейдите в папку программного обеспечения для проектирования.Введите целевые последовательности в csv-файл входного файла проекта, расположенный во входной вложенной папке. Выберите параметры, которые будут использоваться для функции проектирования. Запустите функцию проектирования, чтобы создать дизайн переключателя toehold для интересующих целей.По завершении перейдите в папку final_designs и найдите последовательности проектирования переключателя верхнего носок и соответствующие целевые последовательности в электронных таблицах формата csv. Убедитесь, что последовательности ДНК переключателя пальцев ног, генерируемые алгоритмом, содержат промоторные последовательности T7 на пяти простых концах и законсервированную последовательность 21 нуклеотидного линкера на трех простых концах. Используйте NCBI BLAST для проверки последовательностей проектирования переключателей верхнего носка от других распространенных вирусов, проверяя гомологию последовательностей.Принимайте последовательности с гемологией менее 40%. Готовят растворы носкового переключателя шпильки ДНК олиго и праймеров обратной амплификации в концентрации 10 микромоляров в безнуклеазной воде. Соберите реакции в ПЦР-трубках на льду согласно этой таблице.Поместите реакционные трубки в термоциклер, следуя условиям циклирования, перечисленным в этой таблице. Анализ препаратов ПЦР на агарозном геле. Очищают продукты ПЦР и элюируют ДНК в минимальном объеме безнуклеазной воды для обеспечения достаточно высокой концентрации.Количественно оцените ДНК с помощью спектрофотометра. Приготовьте раствор CPRG, растворив 25 миллиграммов порошка в одном миллилитре воды без нуклеазы. Приготовьте мастер-микс на льду в соответствии со стандартным протоколом, показанным здесь.Дозируйте бесклеточную мастер-смесь в пробирки ПЦР. Для бесклеточных элементов управления и управления только переключением добавьте воду без нуклеазы до объема 5,94 микролитров. А для реакции добавьте ПЦР очищенную ДНК переключателя пальцев ног, чтобы получить конечную концентрацию 33 наномоляра.Чтобы проверить переключатель пальца ноги и комбинацию целевой РНК, добавьте транскрибированную in vitro целевую РНК к конечной концентрации одного микромоляра. Тщательно перемешайте все реакции путем пипетирования и центрифуги. На черной прозрачной нижней плите из 384 скважин добавьте 30 микролитров воды без нуклеаз в скважины, окружающие реакционные скважины.Затем, используя двухмиллиметровый биопсийный перфоратор и пинцет, вырежьте заблокированные BSA диски фильтровальной бумаги и поместите их в реакционные колодцы. Распределите 1,8 микролитра из каждой реакционной трубки на диски фильтровальной бумаги в 384-луночной пластине в трех экземплярах. Накройте пластину прозрачной ПЦР-пленкой и поместите ее в считыватель пластин.Измеряйте поглощение на 570 нанометров при 37 градусах Цельсия каждую минуту в течение 130 минут. Приготовьте 25 микромолярный раствор всех наборов прямых и обратных праймеров в воде без нуклеаз. Настройте реакцию в пять микролитров, используя мастер-микс, показанный здесь.Перемешайте путем пипетирования до тех пор, пока белый осадок не солюбилизируется, а затем дозируйте в пробирки для ПЦР. Добавьте прямую и обратную праймеры в соответствующие трубки, а затем добавьте один микролитр либо воды без нуклеазы, либо два пикомоляра целевой триггерной РНК. Перемешайте путем мягкой пипетки и ненадолго раскрутите трубки.Настройте протокол инкубации на термоциклере, как показано здесь. Через 12 минут удалите трубки и добавьте 1,25 микролитра ферментной смеси в каждую трубку с последующим смешиванием и центрифугированием. Верните трубки в термоциклер после пропуска шага удержания 41 градуса Цельсия, чтобы начать одночасовую реакционную инкубацию.Затем, чтобы оценить производительность грунтовки, соберите реакции безячеистого переключателя на бумажной основе и проанализируйте данные. Для анализа чувствительности определите пары праймеров-кандидатов и подготовьте серийные разведения целевой РНК в воде без нуклеаз. Повторите NASBA и бесклеточные реакции с выбранными наборами праймеров в биологических трипликатах.Используя один микролитр экстрагированной РНК пациента, выполните амплификацию NASBA и бумажные бесклеточные реакции, как показано в пятом разделе. После реакций подготовьте реакционную пластину с 384 лунками и проведите анализ в портативном считывателе пластин при 37 градусах Цельсия. Затем соберите компоненты RT-qPCR и добавьте реагенты в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку в соответствии с этой таблицей.Перемешайте реакцию путем пипетирования. Дозируйте 6,5 микролитров в каждую лунку 96-луночной или 384-луночной ПЦР-пластины, а затем 3,5 микролитра каждого шаблона РНК в трех экземплярах. Поместите пленку ПЦР поверх пластины.Центрифугируйте пластину из 384 скважин при 600 G в течение двух минут. Поместите пластину в машину RT-qPCR и выполните условия цикла, как показано здесь. Следуя вычислительному проекту, три переключателя были построены и проанализированы с использованием электрофореза агарозного геля.Полоса около 3000 пар оснований указывала на успешную реакцию. Переключатели пальцев ног оценивались по их соответствующей транскрибированной in vitro триггерной РНК. В то время как все три датчика демонстрировали увеличение поглощения, датчик 27B имел наиболее быструю скорость, тогда как переключатели 33B и 47B имели более низкое соотношение включения / выключения, указывающее на фоновую активность и снижение специфичности.Сменное изменение поглощения на 570 нанометров показало, что переключатель 27B обладает лучшей производительностью с соотношением включения/выключения сигнала. Кроме того, в сочетании с NASBA он может обнаруживать РНК в концентрациях до 124 молекул на микролитр, что указывает на высокую чувствительность. Образцы пациентов с вирусом Зика из Бразилии были протестированы для оценки клинической диагностической точности датчиков с использованием портативного считывателя пластин.Изменение цвета с желтого на фиолетовый выявило положительный образец. Колориметрический отклик для каждой реакции на бумажной основе был построен с течением времени встроенным программным обеспечением на портативном считывателе пластин PLUM. Образцы, превысившие порог, были признаны положительными.Клиническая эффективность датчика была установлена путем сравнения с RT-qPCR. Образцы считались положительными, когда пороговое значение цикла было равно или меньше 38. Важно убедиться, что результаты экранов переключения пальцев ног и чувствительности грунтовки NASBA воспроизводимы и оптимизированы, прежде чем переходить к испытаниям пациентов.Учитывая свою простоту и адаптивность, диагностическая платформа, описанная здесь, проложила путь для разработки новых инструментов для оказания медицинской помощи, которые могут принести пользу системе здравоохранения, особенно для стран с низким уровнем дохода.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Характеристика сложных систем по постановке эксперимента подхода: Переходный Белок Expression табачными в качестве примера

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Бумажные основе Приборы для выделения и характеристики внеклеточной пузырьков

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Разработка и внедрение автоматизированной освещая, культивированием и система отбора проб для микробного оптогенетика приложений

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Магнитной левитации В сочетании с Портативный визуализации и анализа для заболевания Диагностика

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Изготовление Трехмерная бумаги на основе микрожидком Устройства для иммуноанализа

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Изготовления и проверки системы орган на чипе с интегрированной электроды непосредственно поддается трансэндотелиальной электрическое сопротивление

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

Анатомически реалистичные неонатальной сердце модель для использования в неонатальной пациента тренажеры

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Наносенсоры обнаружить протеазы активность In Vivo для неинвазивной диагностики

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...