Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
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Los autores agradecen a todos los miembros de los laboratorios Green, Pardee y Pena, así como a todos los coautores de manuscritos anteriores relacionados con el trabajo divulgado en este manuscrito. S.J.R.d.S. fue apoyado por una beca de doctorado patrocinada por la Fundación para la Ciencia y la Tecnología de Pernambuco (FACEPE), Brasil, número de referencia IBPG-1321-2.12/18, y actualmente cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral patrocinada por la Universidad de Toronto, Canadá. P.B. cuenta con el apoyo del Premio William Knapp Buckley de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Toronto. M.K. fue apoyado por la Iniciativa de Medicina de Precisión (PRiME) en la beca interna de la Universidad de Toronto número PRMF2019-002. Este trabajo fue apoyado por fondos para K.P del Programa de Cátedras de Investigación de Canadá (Archivos 950-231075 y 950-233107), el Fondo de Gestión de Proyectos de Investigación Principales de la Universidad de Toronto, el Programa de Subvenciones de la Fundación CIHR (201610FDN-375469), y para L.P, A.A.G. y K.P a través de la Subvención del Equipo CIHR / IDRC: Programa del Virus del Zika Canadá-América / América / Caribe (FRN: 149783), así como por fondos a K.P. del Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo de Canadá (subvención 109434-001) a través de la Oportunidad de Financiación de Investigación Rápida del Nuevo Coronavirus (COVID-19) canadiense de 2019. Este trabajo también fue apoyado por fondos para A.A.G. de un Premio al Nuevo Investigador de la Comisión de Investigación Biomédica de Arizona (ADHS16-162400), la Fundación Gates (OPP1160667), un Premio al Nuevo Innovador del Director de los NIH (1DP2GM126892), un premio NIH R21 (1R21AI136571-01A1) a K.P./A.A.G, y una beca Alfred P. Sloan (FG-2017-9108). La Figura 1 fue creada con Biorender.com bajo licencia académica a K.P.

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K.P. y A.A.G. son coinventores de tecnologías relacionadas con el sensor de punto de apoyo basado en papel. Y.G., S.C. y K.P. son cofundadores de LSK Technologies, Inc. y son coinventores de las tecnologías relacionadas con PLUM. M.K., K.P. y A.A.G. son cofundadores de En Carta Diagnostics Ltd. Otros autores no tienen conflictos de intereses. Patentes: Dispositivo PLUM: Y.G., S.C. y K.P. La solicitud de patente fue presentada por la Universidad de Toronto y asignada a LSK Technologies Inc. Solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 62/982,323 presentada el 27 de febrero de 2020; Patente del interruptor de punto de apoyo: A.A.G., P.Y., y J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Patent. WO2014074648A3 presentada el 6 de noviembre de 2012; Patente de diagnóstico basada en papel: K.P. y J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" patente estadounidense pendiente No. US15/963.831 presentada el 6 de diciembre de 2013; Patente 1 sobre Zika: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. y J.J.C., "Plataforma portátil de detección de virus e identificación de cepas de bajo costo", Solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 62/403,778 presentada el 4 de octubre de 2016; Patente 2 sobre Zika: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. y J.J.C., "Plataforma portátil de detección de virus e identificación de cepas de bajo costo", Solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 62/341,221 presentada el 25 de mayo de 2016.

El sistema combinado basado en papel descrito aquí puede llevar diagnósticos moleculares clínicamente relevantes, con un rendimiento que es funcionalmente comparable a la RT-qPCR, al punto de necesidad6. Es importante destacar que, para la configuración remota, la disponibilidad de diagnósticos in situ puede disminuir el tiempo de obtención de resultados de días a horas. Destacando la programabilidad de este enfoque, la tubería que se ha descrito se puede utilizar para detectar prácticamente cualquier objetivo patógeno. Hemos emparejado las herramientas moleculares con un lector de placas portátil especialmente diseñado, que es compacto y compatible con el funcionamiento de la batería (8-9 h) y proporciona análisis de datos a bordo para permitir aplicaciones distribuidas. En otros trabajos, hemos validado el hardware combinado y la plataforma de diagnóstico del virus Zika con 268 muestras de pacientes, en paralelo con RT-qPCR, y encontramos una precisión diagnóstica del 98,5%24. En conjunto, nuestro objetivo es permitir la transferencia de tecnología de esta plataforma a los investigadores para que pueda ser reutilizada y mejorada por la comunidad para abordar las necesidades de diagnóstico no satisfechas.
El proceso de diseño del interruptor de punto de apoyo in silico se ha integrado y automatizado en una tubería que se puede dividir en tres etapas. La primera etapa genera un conjunto de diseños de interruptores de punto de apoyo que se hibridan con la secuencia objetivo en incrementos de un nucleótido. La segunda etapa examina la estructura secundaria y la disponibilidad del interruptor de punto de apoyo y elimina los sensores con codones de parada prematura en el marco. Luego se implementa una función de puntuación que considera múltiples factores (por ejemplo, el nivel de defecto del interruptor de punto de apoyo, la disponibilidad del interruptor de punto de apoyo y la accesibilidad del sitio de destino) para seleccionar los diseños de interruptores de punto superior en función de los puntajes generales. En la etapa final, se genera una lista de secuencias para los diseños de interruptores de punto de apoyo superior y sus correspondientes disparadores de objetivo. Las secuencias del sensor superior deben examinarse para determinar su especificidad contra el transcriptoma humano y los genomas virales estrechamente relacionados utilizando NCBI/Primer-BLAST25. También es una buena práctica examinar los sitios objetivo del sensor para la conservación de secuencias en el genoma viral del Zika para garantizar que los sensores proporcionen una detección amplia y sólida. Se han desarrollado varias versiones del software de diseño de interruptores de punto de apoyo y el algoritmo de diseño permite a los usuarios generar dos versiones, ya sea la serie A 6 o los interruptores de puntode la serie B6. En este artículo, la atención se ha centrado en el diseño del interruptor de punto de la serie B.
Después de la síntesis comercial de ADN, los interruptores de punto de apoyo se pueden ensamblar rápidamente y luego probarse realizando una pantalla inicial contra una secuencia de activación de objetivo sintético que corresponde a regiones cortas (200-300 nt) del genoma objetivo. Para evaluar el rendimiento de los sensores basados en interruptores de punto de apoyo, es ideal agregar la secuencia objetivo en forma de ARN. En este artículo, se han descrito los pasos necesarios para agregar ARN desencadenante transcrito in vitro . Sin embargo, si están disponibles, se pueden usar plantillas de genoma de longitud completa, como extractos cuantificados de ARN viral o genomas o estándares de ARN sintético comercial. El uso de genomas de ARN de longitud completa para la detección inicial del interruptor del punto de apoyo es beneficioso, ya que puede informar si factores adicionales, como la estructura secundaria del ARN, afectarán el rendimiento del sensor. Para optimizar la relación ON/OFF de los interruptores candidatos, el ADN del interruptor de punto de apoyo se puede ajustar en la reacción libre de células. Este paso también puede servir para identificar interruptores de punto de alto rendimiento (amplificación de pliegue, o alta relación ON / OFF) y omitir interruptores de punto de apoyo con fugas (señal alta en ausencia del ARN objetivo) de los pasos de caracterización aguas abajo.
Para mejorar el límite de detección de los candidatos a interruptor de punto de suero de alto rendimiento, NASBA se utiliza para aumentar las concentraciones clínicamente relevantes de ARN viral objetivo del Zika a un nivel que pueda ser detectado por los interruptores de punto6. Se examinan diferentes combinaciones de conjuntos de cebadores hacia adelante y hacia atrás para determinar las mejores combinaciones de cebador NASBA y interruptor de punto de apoyo para permitir la detección a concentraciones clínicamente relevantes. Una vez que se ha identificado una combinación ideal de juego de cebador y punto de apoyo, el ensayo se lleva a validación clínica. Es importante tener en cuenta que el interruptor de punto de apoyo y las etapas de detección de NASBA pueden requerir mucha mano de obra y recursos y, por lo tanto, el desarrollo de pruebas es más adecuado para sitios de investigación con recursos suficientes. Aunque no hemos aplicado la automatización de procesos, es probable que esto pueda acelerar el ciclo iterativo de diseño, construcción y prueba32. Afortunadamente, el tiempo de respuesta desde el diseño y las pruebas del sensor hasta la implementación puede ser notablemente corto (menos de una semana), lo que hace que esta estrategia sea ideal para situaciones de tiempo crítico, como brotes epidémicos6.
Incluso después de que se haya desarrollado un biosensor con sensibilidad clínicamente relevante, existen desafíos técnicos que deben abordarse. Dado que este protocolo implica la operación manual y es un procedimiento de varios pasos, existe el riesgo de contaminación cruzada entre las muestras. Hacemos todo lo posible para reducir este riesgo a través de una cuidadosa práctica de laboratorio. En un ensayo clínico reciente de 268 muestras de pacientes, no encontramos ningún problema de contaminación; sin embargo, es una consideración importante24. Con esto en mente, el protocolo sigue siendo un ensayo de laboratorio y requiere un usuario experto con dominio de las técnicas adecuadas de biología molecular. Una consideración adicional para el despliegue es el aislamiento de ARN de muestras de pacientes. Aquí describimos el aislamiento de ARN utilizando kits de extracción de ácidos nucleicos basados en columnas. Sin embargo, en otros trabajos, hemos demostrado un método de lisis de ebullición eficaz y simple (95 °C durante 2 min) para el procesamiento de muestras de pacientes de baja carga6. Esta estrategia casi elimina el costo asociado con la extracción de ARN y evita el uso de kits de extracción de ácidos nucleicos basados en columnas, que pueden plantear un desafío logístico en entornos de bajos recursos o problemas de la cadena de suministro durante crisis, como la pandemia de COVID-1933.
Como hemos visto durante la pandemia de COVID-19, los instrumentos utilizados para realizar RT-qPCR pueden servir como cuello de botella y limitar el acceso de los pacientes a las pruebas. Este factor, que también es en gran medida financiero, conduce a un modo de prueba centralizado que puede limitar el acceso al diagnóstico. Por ejemplo, durante el brote de Zika de 2015/2016, solo cinco laboratorios nacionales de referencia estaban disponibles en Brasil, lo que causó retrasos en las pruebas de los pacientes. Sin considerar el beneficio potencial de las economías de escala, el costo actual de los bienes para el lector de placas portátil es de ~ $ 500 USD, que incluso si se multiplica por cinco para tener en cuenta el margen laboral y comercial, todavía proporciona un instrumento asequible. Esto se compara bien con los instrumentos RT-qPCR que varían en costo de $ 15,000- $ 90,000 USD34. Además, el costo estimado por prueba para el ensayo libre de células en América Latina es de alrededor de $ 5.48 USD, mientras que el costo por prueba de RT-qPCR en Brasil fue de ~ $ 10-11 USD en el momento del brote de Zika36. Más allá del costo del equipo, el lector de placas portátil tiene una huella pequeña (20 cm3), análisis automático, carga de datos a la nube a través de Internet y puede funcionar con batería. Estas características amplían drásticamente los entornos potenciales donde se pueden implementar las pruebas y, al mismo tiempo, amplían la población de pacientes que se pueden atender.
Hasta la fecha, las plataformas comerciales más comunes de CFPS de E. coli son los sistemas S30 y PURE37; Sin embargo, una consideración clave para mejorar el acceso a los diagnósticos en los países de ingresos bajos y medianos es la limitada disponibilidad nacional de estos reactivos. Un paso importante para resolver este desafío es el desarrollo de la producción local de CFPS. El laboratorio de Federici ha logrado recientemente un progreso significativo hacia el desarrollo de una plataforma no comercial para implementar sensores basados en interruptores de dedo en sistemas libres de células basados en lisados, alcanzando un LOD de 2.7 fM con ARN14 del virus Zika. Este logro no solo permite que los reactivos se fabriquen en el país de uso, evitando aranceles y retrasos de importación, sino que los costos laborales también se escalan a las tasas locales y, por lo tanto, el costo general puede reducirse significativamente. En el trabajo esbozado por el grupo Federici, el costo de producir la reacción de expresión CFPS (5 μL) en Chile fue de 6,9 centavos (USD)35,38, proporcionando un doble incentivo (mejora logística y costo) para implementar sistemas basados en lisados 35,38.
La colocación de pruebas comparables a RT-qPCR en redes de diagnóstico distribuidas podría aportar ventajas significativas sobre las prácticas actuales que dependen del transporte de muestras a instalaciones centralizadas de RT-qPCR. En entornos periurbanos, donde se concentraron los casos de Zika, la distancia física entre un paciente y el centro de diagnóstico ralentiza el diagnóstico y aumenta el riesgo de que los resultados no lleguen al paciente en un momento clínicamente relevante. Esperamos que el trabajo aquí presentado pueda contribuir a permitir que la comunidad investigadora, a través de la transferencia de conocimientos, cree biotecnologías descentralizadas y equipos portátiles para la salud humana, la agricultura y el monitoreo ambiental.

La RT-qPCR se ha mantenido como la tecnología estándar de oro para el diagnóstico clínico debido a su excelente sensibilidad y especificidad. Aunque es muy robusto, el método depende de equipos y reactivos costosos y especializados que requieren distribución y almacenamiento con temperatura controlada. Esto presenta barreras significativas para la accesibilidad de diagnósticos de calidad a nivel mundial, particularmente en tiempos de brotes de enfermedades y en regiones donde el acceso a laboratorios bien equipados es limitado 1,2. Esto se observó durante el brote del virus Zika 2015/2016 en Brasil. Con solo cinco laboratorios centralizados disponibles para proporcionar pruebas RT-qPCR, se produjeron cuellos de botella significativos, lo que limitó el acceso a los diagnósticos. Esto fue especialmente difícil para las personas en entornos periurbanos, que se vieron más gravemente afectadas por el brote 3,4. En un esfuerzo por mejorar el acceso a los diagnósticos, el protocolo muestra una plataforma que se ha desarrollado con el potencial de proporcionar diagnósticos descentralizados, de bajo costo y de alta capacidad en entornos de bajos recursos. Como parte de esto, se estableció una tubería de descubrimiento de diagnóstico, acoplando sensores basados en amplificación isotérmica y conmutación de ARN sintético con sistemas de expresión libre de células basados en papel 5,6.
Los sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS), en particular los sistemas libres de células basados en E. coli, son una plataforma atractiva para una amplia gama de aplicaciones de biodetección, desde el monitoreo ambiental 7,8 hasta el diagnóstico de patógenos 5,6,9,10,11,12 . Compuestos por los componentes necesarios para la transcripción y traducción, los sistemas CFPS tienen ventajas significativas sobre los biosensores de células enteras. Específicamente, la detección no está limitada por una pared celular y, en general, son modulares en diseño, bioseguras, económicas y pueden liofilizarse para uso portátil. La capacidad de liofilizar reacciones basadas en circuitos genéticos sobre sustratos como papel o textiles, permite el transporte, el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente5 e incluso la incorporación en tecnología portátil13.
Trabajos anteriores han demostrado que los sistemas libres de células de E. coli se pueden utilizar para detectar numerosos analitos, por ejemplo, metales tóxicos como el mercurio, antibióticos como la tetraciclina7,14, productos químicos disruptores endocrinos15,16, biomarcadores como el ácido hipúrico 17, moléculas de detección de quórum asociadas a patógenos 9,18 y sustancias ilícitas como la cocaína 17 y el gamma hidroxibutirato (GHB)19 . Para la detección de ácidos nucleicos específicos de secuencia, las estrategias se han basado en su mayor parte en el uso de biosensores basados en interruptores acoplados a técnicas de amplificación isotérmica. Los interruptores de punto de apoyo son riboreguladores sintéticos (también denominados simplemente "interruptores" en el resto del texto) que contienen una estructura de horquilla que bloquea la traslación posterior al secuestrar el sitio de unión ribosómica (RBS) y el codón de inicio. Tras la interacción con su ARN desencadenante objetivo, la estructura de horquilla se alivia y se habilita la traducción posterior de un marco de lectura abierto del reportero20.
La amplificación isotérmica también puede ser utilizada como diagnóstico molecular21; sin embargo, estos métodos son propensos a la amplificación inespecífica, lo que puede reducir la especificidad y, por lo tanto, la precisión de la prueba por debajo de la RT-qPCR 22. En el trabajo reportado aquí, la amplificación isotérmica aguas arriba de los sensores basados en interruptores se utilizó para proporcionar una amplificación de señal combinada que permite la detección clínicamente relevante de ácidos nucleicos (femtomolar a attomolar). Este emparejamiento de los dos métodos también proporciona dos puntos de control específicos de la secuencia que, en combinación, proporcionan un alto nivel de especificidad. Usando este enfoque, trabajos previos han demostrado la detección de virus como Zika6, Ébola5, Norovirus10, así como bacterias patógenas como C. difficile23 y Typhoid12 resistente a los antibióticos. Más recientemente, se han demostrado interruptores de punto de apoyo sin células para la detección del SARS-CoV-2 en un esfuerzo por proporcionar diagnósticos accesibles para la pandemia deCOVID-19 11,12,13.
El siguiente protocolo describe el desarrollo y la validación del ensayo de interruptor de punto de apoyo sintético sin células y basado en papel para la detección del virus Zika, desde el diseño del biosensor in silico , pasando por los pasos de ensamblaje y optimización, hasta la validación de campo con muestras de pacientes. El protocolo comienza con el diseño in silico de sensores basados en interruptores de punto de apoyo de ARN y cebadores de amplificación isotérmica específicos para el ARN viral Zika. Aunque existen numerosos métodos de amplificación isotérmica, aquí se demostró el uso de la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) para aumentar la concentración del ARN viral objetivo presente en la reacción, lo que permite una sensibilidad clínicamente significativa. Prácticamente, los métodos de amplificación isotérmica tienen la ventaja de operar a una temperatura constante, eliminando la necesidad de equipos especializados, como los termocicladores, que generalmente se limitan a ubicaciones centralizadas.
A continuación, se describe el proceso de ensamblaje de los sensores de interruptor de punto de apoyo sintético con secuencias de codificación de reportero a través de PCR de extensión de superposición, y la detección de los sensores de interruptor de punto de apoyo sintético para un rendimiento óptimo en sistemas libres de células utilizando ARN sintético. Para este conjunto de sensores del virus Zika, hemos seleccionado el gen lacZ que codifica la enzima β-galactosidasa, que es capaz de escindir un sustrato colorimétrico, el rojo clorofenol β-D-galactopiranósido (CPRG), para producir un cambio de color amarillo a púrpura que puede ser detectado a simple vista o con un lector de placas. Una vez que se identifican los interruptores sintéticos de mayor rendimiento, se describe el proceso para la detección de cebadores para la amplificación isotérmica basada en secuencias de ácidos nucleicos de la secuencia objetivo correspondiente utilizando ARN sintético para encontrar conjuntos que proporcionen la mejor sensibilidad.
Finalmente, el desempeño de la plataforma de diagnóstico se valida in situ en América Latina (Figura 1). Para determinar la precisión del diagnóstico clínico, el ensayo sin células en papel se realiza utilizando muestras del virus del Zika de pacientes; en paralelo, se realiza un ensayo RT-qPCR estándar de oro para la comparación. Para monitorear los ensayos colorimétricos sin células, permitimos la cuantificación in situ de los resultados en regiones donde los termocicladores no están disponibles. El lector de placas ensamblado a mano llamado Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; en adelante, lector de placas portátil) también se presenta aquí24. Inicialmente desarrollado como un dispositivo complementario para el diagnóstico de interruptores de punto de apoyo sintéticos sin células, el lector de placas portátil ofrece una forma accesible de incubar y leer resultados de una manera de alto rendimiento, proporcionando análisis de software integrado basado en visión artificial para los usuarios.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo para analizar muestras de pacientes utilizando reacciones de interruptor de punto de apoyo sin células basadas en papel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

El acceso a diagnósticos moleculares de baja carga que se pueden implementar en la comunidad para realizar pruebas es cada vez más importante y tiene implicaciones más amplias y significativas para el bienestar de las sociedades y la estabilidad económica. En los últimos años han surgido varias nuevas modalidades de diagnóstico isotérmico para satisfacer la necesidad de diagnósticos moleculares rápidos y de bajo costo. Hemos contribuido a este esfuerzo a través del desarrollo y la validación del paciente de diagnósticos basados en el interruptor del dedo del pie, incluidos los diagnósticos para los virus Zika y chikungunya transmitidos por mosquitos, que proporcionaron un rendimiento comparable a los ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) estándar de oro. Estos diagnósticos son baratos de desarrollar y fabricar, y tienen el potencial de proporcionar capacidad de diagnóstico a entornos de bajos recursos. Aquí, el protocolo proporciona todos los pasos necesarios para el desarrollo de un ensayo basado en interruptores para la detección del virus Zika. El artículo lleva a los lectores a través del proceso de desarrollo de diagnóstico paso a paso. En primer lugar, las secuencias genómicas del virus del Zika sirven como entradas para el diseño computacional de interruptores candidatos utilizando software de código abierto. A continuación, se muestra el montaje de los sensores para el cribado empírico con secuencias de ARN sintético y la optimización de la sensibilidad diagnóstica. Una vez completada, la validación se realiza con muestras de pacientes en paralelo con RT-qPCR y un lector óptico especialmente diseñado, PLUM. Este trabajo proporciona una hoja de ruta técnica a los investigadores para el desarrollo de sensores basados en interruptores de punto de apoyo de bajo costo para aplicaciones en salud humana, agricultura y monitoreo ambiental.

Siguiendo la tubería de diseño computacional, la construcción de tres interruptores de punto de apoyo se realizó mediante PCR. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2). La presencia de una banda clara de alrededor de 3.000 pb, aproximadamente del tamaño del gen lacZ acoplado a un interruptor de punto de apoyo, generalmente indica una reacción exitosa. Alternativamente, un carril sin banda, múltiples bandas o una banda del tamaño incorrecto, indica una PCR fallida. En el caso de una PCR fallida, se deben optimizar las condiciones de reacción y/o las secuencias de cebador.
Los interruptores de punto de apoyo ensamblados se examinaron para evaluar cada sensor contra su respectivo ARN de gatillo transcrito in vitro (Figura 3). Mientras que los tres sensores mostraron una mayor absorbancia OD570 , el interruptor 27B (Figura 3A) tuvo la velocidad de encendido más rápida. Los interruptores 33B y, en menor medida, 47B mostraron un aumento de la absorbancia OD570 en ausencia de ARN desencadenante objetivo, lo que indica que estos interruptores poseen alguna actividad de fondo o fugas (Figura 3B, C), un rasgo no deseado en un sensor candidato, ya que puede reducir la especificidad. Para identificar más claramente el sensor con la relación de señal ON/OFF más alta, se calculó el cambio de plegado de la absorbancia OD570 (consulte la sección 5 de información complementaria) y se trazó (Figura 4). A partir de este análisis, queda claro que el interruptor 27B es el sensor que tiene el mejor rendimiento con una relación ON / OFF de alrededor de 60.
La sensibilidad del interruptor de punto de apoyo de alto rendimiento (27B) se evaluó determinando la concentración de ARN más baja requerida para activar el interruptor de punto de apoyo cuando se combina con una reacción NASBA. El gráfico ilustra que los sensores de Zika de mayor rendimiento pueden detectar ARN en concentraciones tan bajas como 1.24 moléculas por μL (equivalente a ~ 2 aM; Figura 5).
Después de identificar y validar el interruptor 27B, los materiales del sensor se distribuyeron a los miembros del equipo en Recife, en el estado brasileño de Pernambuco. En Brasil, la precisión diagnóstica clínica de la plataforma de diagnóstico del virus del Zika se evaluó utilizando muestras de pacientes con el virus del Zika, en paralelo con RT-qPCR para la comparación. Para validar la plataforma de diagnóstico Zika basada en papel, se utilizó el lector de placas portátil, que es capaz de incubar y leer la salida colorimétrica de los sensores basados en papel. El cambio de color de amarillo a púrpura se utiliza para identificar una muestra positiva, mientras que una muestra negativa permanece amarilla (Figura 6). Una opción adicional para visualizar los resultados generados por el lector de placas portátil (Figura 8) es trazar la respuesta colorimétrica para cada reacción basada en papel a lo largo del tiempo. Las muestras se analizaron por triplicado y las que excedieron el umbral (línea roja establecida en 1) se consideraron positivas, mientras que las muestras por debajo del umbral se consideraron negativas (Figura 6 y Figura 7).
Finalmente, para evaluar y comparar el rendimiento clínico del sensor del interruptor del punto de apoyo del Zika con el método estándar de oro actual para diagnosticar la infección por el virus del Zika, todas las muestras de pacientes se analizaron en paralelo con RT-qPCR. La gráfica de amplificación de dos muestras representativas de pacientes se probó por triplicado para la detección del virus Zika mediante RT-qPCR (Figura 9). Las muestras se consideran positivas cuando el valor del umbral del ciclo (Ct) es ≤38; la línea roja indica una muestra positiva y la línea azul indica una muestra negativa para el virus Zika.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa para evaluar la calidad de los productos de PCR. Los productos de PCR se analizan en un gel de agarosa al 1% en 1X TAE, ejecutado a 80 V durante 90 min. Una sola banda transparente generalmente indica una reacción exitosa. Carril 1: escalera de ADN de 1 kb; Carriles 2-4: 27B cambian el ADN, el ADN de activación 33B y el ADN de activación 47B, respectivamente. Los números en el lado izquierdo representan el tamaño de la banda en bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Figura 3: Creación de prototipos de tres interruptores de punto de apoyo para sensores Zika basados en papel. El rendimiento de tres sensores de interruptor de punto de ARN basados en papel se midió a 37 °C durante más de 130 min. Cada gráfico contiene dos trazas, una representa el control de solo interruptor, mientras que la otra representa el interruptor y el disparador. Los tres gráficos representan datos adquiridos utilizando los sensores de interruptor de punto de apoyo 27B (A), 33B (B) y 47B (C). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) de tres réplicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Figura 4: Los sensores de mayor rendimiento se identifican calculando el cambio de plegado en la absorbancia a 570 nm. El cambio de plegado (o relación máxima de encendido/apagado) se calcula midiendo la relación de absorbancia (OD570) a los 130 min entre el control de solo interruptor y el interruptor más el ensayo CFPS de disparo. Las barras de error representan SEM a partir de tres réplicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Figura 5: Evaluación de la sensibilidad del switch de alto rendimiento. El ARN del Zika transcrito in vitro se ajusta a las reacciones NASBA. Después de una incubación de 1 h, las reacciones se agregaron a las reacciones PURExpress libres de células en discos de papel en una proporción de 1: 7. Se traza el cambio de pliegue después de 130 min a 37 °C. Esta cifra ha sido reproducida de24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Figura 6: Página de captura del lector de placas portátil cargada con datos de imagen capturados. Esta figura muestra una imagen de muestra de la imagen final capturada por el lector de placas portátil durante una ejecución de recopilación de datos. El sello de fecha/hora original es visible en la parte superior de la imagen. El color amarillo indica control o reacciones negativas, y el color púrpura indica una reacción positiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Figura 7: Modo de análisis de datos. A la izquierda, los usuarios seleccionan los conjuntos de datos que les gustaría trazar; Los gráficos se muestran a la derecha con colores únicos para cada muestra o conjunto de control. La línea roja discontinua sirve como umbral para determinar muestras positivas y negativas. Las muestras analizadas por triplicado que superan el umbral se consideran positivas, mientras que las muestras por debajo del umbral se consideran negativas. Las barras de error representan la desviación estándar (DE) de tres réplicas. Ctrl 1 a Ctrl 5 indica controles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Figura 8. PLUM, un lector de placas portátil. Este lector de placas portátil actúa como un laboratorio en una caja y sirve como un lector de placas con temperatura controlada para incubar y monitorear reacciones colorimétricas. Este dispositivo portátil puede proporcionar mediciones cuantitativas y de alto rendimiento de los sensores de Zika en papel en el sitio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Figura 9: Gráfica RT-qPCR de la amplificación de dos muestras de pacientes analizadas por triplicado para la detección del virus Zika. Las muestras se consideran positivas cuando el valor del umbral del ciclo (Ct) es ≤38. La línea roja punteada sirve como umbral para determinar muestras positivas y negativas. La traza roja indica una muestra positiva y la traza azul indica una muestra negativa. El valor de ΔRn (delta Rn) representa la magnitud normalizada de la señal de fluorescencia detectada por el instrumento RT-qPCR para todas las muestras analizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo de protocolo suplementario. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Cifras suplementarias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar estas cifras.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

El acceso a diagnósticos descentralizados, de bajo costo y de alta capacidad que se pueden implementar en la comunidad para realizar pruebas descentralizadas es fundamental para combatir las crisis sanitarias mundiales. Este manuscrito describe cómo construir diagnósticos en papel para secuencias de ARN viral que se pueden detectar con un lector óptico portátil.

Estudio de diseño a implementación para el desarrollo y validación de pacientes de diagnósticos de interruptores de punto de apoyo basados en papel

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Nuestro protocolo describe el diseño, ensamblaje y validación de diagnósticos basados en circuitos genéticos. Estos diagnósticos moleculares basados en papel son de bajo costo y sensibles, pudiendo detectar concentraciones clínicamente relevantes de ácidos nucleicos y pueden diseñarse para detectar prácticamente cualquier secuencia. Esta es una tecnología de plataforma que puede ser diseñada por los usuarios para sus necesidades y tiene el potencial de llevar diagnósticos de grado clínico a entornos de recursos dentales más descentralizados.El sensor de interruptor de punto de apoyo sin células se puede diseñar para prácticamente cualquier objetivo basado en ácidos nucleicos. Trabajos recientes han demostrado diagnósticos libres de células para el ébola, el norovirus, el SARS-CoV-2, C. difficile y las bacterias que causan la fiebre tifoidea. Demostrando el procedimiento estarán Severino Jefferson Rivero da Silva, becario postdoctoral, y Pouriya Bayat, estudiante de doctorado de mi laboratorio.Para diseñar el interruptor de punto de apoyo, identifique las secuencias objetivo del genoma del virus del Zika y elija las secuencias objetivo del virus del Zika de los amplicones como se describe en el protocolo de texto. Descargue el paquete de software de diseño del interruptor de punto de apoyo. Abra MATLAB y navegue hasta la carpeta del software de diseño.Introduzca las secuencias de destino en el archivo csv del archivo de entrada de diseño ubicado en la subcarpeta de entrada. Seleccione los parámetros que desea utilizar para la función de diseño. Ejecute la función de diseño para generar los diseños de interruptores de punto de apoyo para los objetivos de interés.Al finalizar, navegue hasta la carpeta final_designs y localice las secuencias de diseño del interruptor de punto de apoyo superior y las secuencias de destino correspondientes en hojas de cálculo en formato csv. Asegúrese de que las secuencias de ADN del interruptor de dedo del pie generadas por el algoritmo contengan las secuencias promotoras T7 en el extremo primo cinco y una secuencia conservada de enlace de 21 nucleótidos en el extremo primario tres. Utilice NCBI BLAST para comparar las secuencias de diseño del interruptor del punto de apoyo superior contra otros virus comunes comprobando la homología de secuencia.Acepta secuencias con menos del 40% de hemología. Preparar soluciones de oligos de ADN de horquilla del interruptor de dedo del pie y cebadores de amplificación inversa a una concentración de 10 micromolares en agua libre de nucleasas. Ensamble las reacciones en tubos de PCR sobre hielo de acuerdo con esta tabla.Coloque los tubos de reacción en un termociclador, siguiendo las condiciones de ciclo enumeradas en esta tabla. Analizar los productos de PCR en un gel de agarosa. Purificar los productos de PCR y eluyar el ADN en un volumen mínimo de agua libre de nucleasas para asegurar una concentración suficientemente alta.Cuantificar el ADN usando un espectrofotómetro. Prepare una solución madre de CPRG disolviendo 25 miligramos del polvo en un mililitro de agua libre de nucleasas. Prepare una mezcla maestra en hielo de acuerdo con el protocolo estándar que se muestra aquí.Dispense la mezcla maestra libre de células en tubos de PCR. Para controles sin células y controles de interruptor solo, agregue agua sin nucleasa a un volumen de 5.94 microlitros. Y para la reacción, agregue ADN de interruptor de punto purificado por PCR para obtener una concentración final de 33 nanomolares.Para probar el interruptor del punto de apoyo y la combinación de ARN objetivo, agregue ARN objetivo transcrito in vitro a una concentración final de un micromolar. Mezclar bien todas las reacciones pipeteando y centrifugando brevemente. En una placa de 384 pocillos de fondo transparente negro, agregue 30 microlitros de agua libre de nucleasa a los pozos que rodean los pozos de reacción.Luego, usando un punzón de biopsia de dos milímetros y pinzas, corte los discos de papel de filtro bloqueados por BSA y colóquelos en los pocillos de reacción. Dispense 1,8 microlitros de cada tubo de reacción en los discos de papel de filtro en la placa de 384 pocillos por triplicado. Cubra la placa con una película de PCR transparente y colóquela en un lector de placas.Mida la absorbancia a 570 nanómetros a 37 grados centígrados cada minuto durante 130 minutos. Prepare una solución madre de 25 micromolares de todos los juegos de cebadores directos e inversos en agua libre de nucleasas. Configure una reacción de cinco microlitros utilizando la mezcla maestra que se muestra aquí.Mezclar por pipeteo hasta que el precipitado blanco se solubilice y luego dispensar en tubos de PCR. Agregue los cebadores directos e inversos a los tubos apropiados, seguido de agregar un microlitro de agua libre de nucleasas o dos picomolares de ARN desencadenante objetivo. Mezclar con un pipeteo suave y girar brevemente los tubos.Configure el protocolo de incubación en un termociclador como se muestra aquí. Después de 12 minutos, retire los tubos y agregue 1,25 microlitros de la mezcla de enzimas a cada tubo, seguido de la mezcla y la centrifugación. Devuelva los tubos al termociclador después de omitir el paso de retención de 41 grados centígrados para iniciar la incubación de reacción de una hora.Luego, para evaluar el rendimiento de la imprimación, ensamble las reacciones del interruptor de punto de apoyo sin células en papel y analice los datos. Para el análisis de sensibilidad, identifique pares de cebadores candidatos y prepare diluciones seriadas de ARN objetivo en agua libre de nucleasas. Repita la NASBA y las reacciones libres de células con los conjuntos de cebadores seleccionados en triplicados biológicos.Usando un microlitro de ARN del paciente extraído, realice la amplificación NASBA y las reacciones libres de células basadas en papel como se muestra en la sección cinco. Después de las reacciones, prepare la placa de reacción de 384 pocillos y ejecute el ensayo en un lector de placas portátil a 37 grados centígrados. Luego ensamble los componentes RT-qPCR y agregue los reactivos a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros de acuerdo con esta tabla.Mezclar la reacción por pipeteo. Dispense 6,5 microlitros en cada pocillo de una placa de PCR de 96 o 384 pocillos, seguido de 3,5 microlitros de cada plantilla de ARN por triplicado. Coloque una película de PCR sobre la parte superior de la placa.Centrifugar la placa de 384 pocillos a 600 veces G durante dos minutos. Coloque la placa en una máquina RT-qPCR y ejecute las condiciones de ciclismo como se muestra aquí. Después del diseño computacional, se construyeron tres interruptores de punto de apoyo y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.Una banda de alrededor de 3.000 pares de bases indicó una reacción exitosa. Los interruptores de punto de apoyo se evaluaron contra su respectivo ARN desencadenante transcrito in vitro. Mientras que los tres sensores mostraron un aumento en la absorbancia, el sensor 27B tuvo la velocidad de encendido más rápida, mientras que los interruptores 33B y 47B tuvieron una relación de encendido / apagado más baja que indica actividad de fondo y especificidad reducida.El cambio de absorbancia de plegado a 570 nanómetros mostró que el interruptor 27B tiene el mejor rendimiento con una relación de señal de encendido / apagado. Además, cuando se combina con NASBA, puede detectar ARN en concentraciones tan bajas como 124 moléculas por microlitro, lo que indica una alta sensibilidad. Se analizaron muestras de pacientes con el virus del Zika de Brasil para evaluar la precisión diagnóstica clínica de los sensores utilizando un lector de placas portátil.Un cambio de color de amarillo a púrpura identificó una muestra positiva. La respuesta colorimétrica para cada reacción basada en papel se trazó a lo largo del tiempo mediante el software integrado en el lector de placas portátil PLUM. Las muestras que excedieron el umbral se consideraron positivas.El rendimiento clínico del sensor se estableció en comparación con RT-qPCR. Las muestras se consideraron positivas cuando el valor umbral del ciclo fue igual o inferior a 38. Es importante asegurarse de que los resultados de las pantallas del interruptor de punto de apoyo y la sensibilidad de la imprimación NASBA sean reproducibles y optimizados antes de seguir adelante con los ensayos con pacientes.Dada su simplicidad y adaptabilidad, la plataforma de diagnóstico descrita aquí ha allanado el camino para el desarrollo de nuevas herramientas de punto de atención que pueden aportar beneficios al sistema de salud, especialmente para los países de bajos ingresos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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